Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar la implantación de microesferas para introducir alteraciones en el entorno tisular local en puntos espaciales y temporales específicos durante la embriogénesis del pez cebra. Esto se logra primero preparando una bandeja para la implantación de esferas que facilite la manipulación precisa e implantación de las microesferas. Como segundo paso, los huevos de pez cebra se incuban hasta la etapa deseada de desarrollo.

Las microperlas se preparan luego en las soluciones experimentales adecuadas y se transfieren cuidadosamente a la ubicación deseada dentro del embrión. En última instancia, la implantación de microperlas puede realizarse sin interrumpir el desarrollo normal del pez cebra, lo que permite evaluar los efectos de las moléculas de interés sobre la embriogénesis del pez cebra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como ¿cómo afectan diferentes moléculas al proceso de organogénesis?

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que se requiere práctica para adquirir destreza en el manejo de las microesferas. Para preparar la bandeja de implantación de microesferas, primero caliente la solución de aro al 2 % recién preparada durante 90 segundos. En un matraz erlenmeyer de 250 mililitros, gire el matraz cada 30 segundos para evitar que el gel rebose.

A continuación, coloque la tapa de un plato de Petri de 60 por 15 milímetros dentro de un plato de 150 por 15 milímetros con la cara interna de la tapa orientada hacia arriba. Luego, sujete la tapa del plato de Petri más pequeño con un dedo índice. Vierta el gel de aros caliente en el plato más grande.

Permita que se forme una fina capa de agros debajo de la tapa más pequeña para prevenir la formación de condensación y facilitar la visualización de las perlas bajo el microscopio mientras el agros se enfría. Pero antes de que se solidifique, incline lentamente un molde de pocillos en la parte superior del gel para facilitar la colocación de los embriones. Cuando el gel haya solidificado, utilice una espátula microscópica para retirar cuidadosamente el molde de pocillos.

Luego agregue la solución E tres a la placa y almacénela a cuatro grados Celsius. Para recolectar los embriones de pez cebra, llene una cámara de apareamiento con agua del sistema. Luego coloque un divisor en el centro de la cámara y agregue peces cebra adultos macho y hembra en los lados correspondientes de la cámara.

A la mañana siguiente, utilice un colador de malla fina para recoger los huevos fertilizados. Coloque el colador boca abajo dentro de una placa de Petri limpia de 10 centímetros y enjuague la malla con un chorro fino de E3 hasta que no queden huevos en el colador y haya aproximadamente 25 mililitros de solución de E3 en la placa. Luego, distribuya los huevos en varias placas con 50 a 60 huevos por placa para evitar el exceso de densidad, e incube los huevos en solución de E3 a 28,5 grados Celsius. Antes de implantar las microesferas, incube los embriones en el volumen adecuado de la molécula de prueba de interés o del vehículo control durante el período de tiempo apropiado.

Luego, cuando los embriones hayan alcanzado el punto temporal de desarrollo deseado, utilice pinzas finas para retirar sus kons e incubar los peces cebra en solución de Ringer filtrada, suplementada con antibióticos durante 10 minutos mientras los embriones se aclimatan. Transfiera las microperlas a la placa de microperlas previamente preparada, colocada dentro de la bandeja de implantación, y enjuague las perlas con la solución de Ringer durante 10 minutos.

En menos de 50 minutos tras lavar las perlas, manipule un embrión a la vez dentro del pocillo de la bandeja de implantación, de manera que la zona para la implantación de microperlas quede accesible. Con una aguja de tungsteno, realice una pequeña incisión en el embrión; luego, presione la perilla de una pipeta de transferencia capilar para aspirar suavemente una microperla dentro de la columna capilar y libere la presión para depositar la microperla en la bandeja de implantación, facilitando así su manipulación. Empuje suavemente la perla para hundirla en la solución de Ringer dentro del molde.

Luego, utilizando la micropunta, mueva la microesfera hacia el embrión y dentro de la incisión. Finalmente, use la herramienta de pincel para desplazar la microesfera fuera del sitio de incisión, de modo que la esfera no sea expulsada durante la cicatrización. El éxito del implante de la microesfera puede evaluarse inmediatamente mediante el microscopio estereoscópico, ya que la esfera permanecerá posicionada de forma estable dentro del tejido.

En este experimento, se implantaron microesferas individuales de dos tamaños diferentes, lavadas únicamente con solución de Ringer, en embriones de pez cebra en la etapa de yema de la cola o en puntos temporales posteriores durante algo de miogénesis, para asegurar que la ubicación de las esferas no se desplazó durante la duración del experimento debido a la morfogénesis del tejido endógeno. Las muestras de embriones pueden visualizarse mediante fotografía de curso temporal o verificarse a intervalos periódicos, tal como demuestran las imágenes de la implantación de microesferas. En ausencia de cualquier conjugado, se pueden lograr moléculas pequeñas sin efectos morfológicos evidentes durante el desarrollo normal del embrión de pez cebra SPR.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el Whole Mount Institute hyper para estudiar cómo el microgránulo afecta la expresión génica. En general, comprender la posición del gránulo a lo largo del tiempo es fundamental para interpretar los resultados, como evaluar los efectos de una molécula pequeña sobre un tejido diana o un proceso de desarrollo.