Simple y asistida por ordenador de pruebas olfativas para Ratones
15 de junio de 2015
Presentamos una prueba olfativa sencilla e imparcial en ratones. Con este protocolo, la discriminación olfativa, la preferencia, la evitación y la sensibilidad a un olor nuevo en comparación con el agua se pueden evaluar en sesiones conductuales únicas. Este método está indicado para un solo experimentador y el análisis se basa en el procesamiento de vídeo asistido por ordenador.
El objetivo general del siguiente experimento consiste en evaluar la discriminación olfativa innata, la preferencia u oposición olfativa y la sensibilidad olfativa en ratones. Esto se logra exponiendo al ratón a un atrayente o estímulo novedoso y a un olor neutro, que es el agua. Mientras tanto, una cámara de video registra la sesión de comportamiento.
A continuación, se analiza el video en Image J utilizando los macros proporcionados para obtener el tiempo dedicado a los parámetros de olor y agua. Los resultados muestran el comportamiento de preferencia o evitación frente a olores en comparación con el agua entre diferentes genotipos, según el análisis posterior asistido por computadora. La principal ventaja de la prueba olfativa frente al uso de una arena especializada y olfativa es que utiliza una arena familiar, por lo que su finalización es rápida y su montaje sencillo.
Además, utiliza hardware económico, demostrando que el procedimiento lo realizará Emmanuel Abry, estudiante de mi laboratorio. Para este experimento, utilice ratones macho de entre tres y cinco meses de edad, C57 negro, seis de tipo silvestre y ratones transgénicos. Esta demostración utiliza dos líneas knock-out y controles de camada.
Para las arenas experimentales, utilice jaulas esterilizadas y limpias para ratones con tres centímetros de cama. A continuación, prepare el montaje de la cámara. Colóquela a 58 centímetros sobre el piso de la jaula mediante un soporte personalizado de trípode.
Haga algunas marcas en la superficie de trabajo para indicar la posición que debe tener la jaula. Para una imagen central, configure la cámara para grabar un video de 320 por 240 píxeles a aproximadamente 15 cuadros por segundo. Para preparar al sujeto de prueba, tenga concentrados de cada aroma almacenados en disolvente siempre que sea posible.
Para la prueba de preferencia, prepare una solución al 10% peso por volumen de mantequilla de maní en aceite de maní. Para la prueba de evitación, tenga lista una solución al 98% de ácido butírico metílico. Para la prueba de sensibilidad, recolecte orina de hembras de un ratón de la misma cepa uno o dos días antes de la prueba.
Sujete a una hembra con su abdomen por encima de la rejilla de la jaula y recolecte gotas de su orina en un recipiente de plástico. Recolecte muestras de varias hembras para normalizar. Debido a la variabilidad individual, reúna todas las muestras en un tubo de 1,5 mililitros y almacénelas a menos 20 grados Celsius.
Para comenzar, habitúe a los animales colocando uno en una jaula limpia y permita que explore. Durante cinco minutos, el ambiente de la jaula de prueba debe ser similar al de la jaula de origen. Repita la fase de habituación una vez en cada día de prueba; cuando finalice el período de habituación, comience la grabación y pipetee 60 microlitros de un olor agradable.
En este caso, coloque mantequilla de maní en una pared y, en la pared opuesta, agregue con pipeta la misma cantidad de agua. Aplique las gotas de un olor neutro aproximadamente a 10 centímetros de altura en cada pared. Ahora permita que el animal explore durante dos minutos, luego detenga la grabación y devuelva al ratón a su jaula de origen.
Repita el proceso con cada ratón que se vaya a probar, utilizando siempre jaulas de prueba nuevas. De tres a cinco días después de realizar todas las pruebas de preferencia, lleve a cabo la prueba de evitación utilizando una jaula de prueba nueva.
Para cada ratón, realice la prueba de evitación. Al igual que en la prueba de atracción, solo sustituya el aroma agradable por el aroma de evitación, que es el ácido 2-metilbutírico. Para la prueba de sensibilidad, se puede reutilizar una jaula entre ensayos para el mismo ratón.
Marque entonces el lado del agua de la jaula y prepárese para limpiar las paredes cortas con papel impregnado en etanol al 70 % entre cada prueba. El día del experimento, prepare cuatro concentraciones de la orina mediante una serie de diluciones de diez veces. Utilizando agua doblemente destilada como en la prueba de evitación, habitúe a cada animal a su jaula de prueba durante cinco minutos.
Luego exponga a cada ratón primero a la orina en la dilución más alta, que es de uno a 10.000. Durante la grabación, aplique la dilución de orina a la jaula de prueba y aplique agua a la pared opuesta. Como se hizo para otras pruebas, permita que el animal explore.
Durante dos minutos. Posteriormente, transfiera el animal a una jaula limpia para ratón. Después de que todos los animales hayan estado expuestos a la concentración más baja, limpie todas las paredes de la jaula de prueba y repita el ensayo en cada ratón utilizando la orina con la siguiente concentración más alta.
Continúe este proceso hasta que se analice la orina pura. Después de recopilar todos los datos de un experimento, abra los videos en ImageJ para realizar ajustes y procesamiento, cuyos detalles se proporcionan en el protocolo escrito utilizando los protocolos descritos. Dos líneas knockout diferentes.
Los grupos B y C se compararon con el grupo control de camada A. Se utilizó una prueba T de Student no direccional con varianza igual o desigual para comparar el tiempo empleado entre el olor y el agua dentro de los genotipos. Compare el comportamiento entre genotipos utilizando un ANOVA unifactorial. Ambos grupos experimentales, B y C, no mostraron preferencia por el olor atractivo. En la prueba de evitación, la respuesta frente al olor repulsivo del ácido 2-metilbutírico fue la esperada para los grupos A y B, pero el grupo C no mostró comportamiento de evitación frente a este olor.
En la prueba de sensibilidad, el umbral de atracción se obtuvo restando el tiempo empleado con orina del tiempo empleado con agua, siendo la orina preferida frente al agua en una dilución de uno a 1000. Mientras tanto, ambos grupos experimentales, B y C, necesitaron una concentración 100 veces mayor para mostrar preferencia. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un par de horas si se lleva a cabo correctamente; posteriormente, siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el aprendizaje olfativo y la extinción para investigar la plasticidad y el aprendizaje olfativo.
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Descripción general
Este estudio presenta una prueba olfativa sencilla diseñada para ratones, que permite evaluar la discriminación olfativa, preferencia, evitación y sensibilidad a un olor novedoso en comparación con el agua. El método es eficiente para un solo experimentador y se basa en el análisis de video asistido por computadora.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Análisis del comportamiento
- Prueba olfativa
Antecedentes
- El experimento tiene como objetivo evaluar los comportamientos olfativos innatos en ratones.
- Consiste en la exposición a un olor novedoso y un control neutro (agua).
- El comportamiento se registra y analiza para determinar preferencias o aversiones.
- Este método utiliza un entorno familiar para los ratones, lo que mejora la fiabilidad de los resultados.
Objetivo del estudio
- Evaluar la discriminación olfativa en ratones.
- Evaluar las conductas de preferencia y evitación olfativa.
- Medir la sensibilidad olfativa a olores novedosos.
Métodos Utilizados
- Se expone a los ratones a un atrayente o apelante novedoso y a agua.
- Las sesiones conductuales se graban utilizando una cámara de video.
- Se realiza el análisis de video mediante el software Image J con macros.
- Los resultados se analizan para determinar el tiempo dedicado a cada olor.
Resultados Principales
- Los resultados indican comportamientos de preferencia o evitación frente a olores en comparación con el agua.
- Las respuestas conductuales varían entre diferentes genotipos.
- El método permite un montaje rápido y la finalización de experimentos.
- El análisis asistido por computadora mejora la precisión de los resultados.
Conclusiones
- La prueba olfativa es un método confiable para evaluar el comportamiento olfativo en ratones.
- El uso de una arena familiar simplifica el proceso experimental.
- Este enfoque puede ser beneficioso para diversos estudios conductuales en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La disfunción olfativa es un biomarcador temprano en modelos de enfermedades neurodegenerativas, lo que hace que los ensayos confiables de olfacción en roedores sean fundamentales para la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos para el sistema nervioso central. Este método permite una evaluación rápida y reproducible de la percepción y sensibilidad innata al olor sin necesidad de restricción de alimento o agua, facilitando el cribado de alto rendimiento de intervenciones genéticas o farmacológicas. Al cuantificar las respuestas conductuales a atrayentes, repelentes y umbrales de sensibilidad, proporciona una desvinculación mecanicista de riesgos para dianas implicadas en la disfunción de la red olfativa.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la vinculación del genotipo con el comportamiento olfativo, permitiendo la validación funcional de dianas en las vías olfativas.
- Valor operativo: Utiliza entornos familiares y una habituación mínima, reduciendo la variabilidad inducida por el estrés y mejorando la reproducibilidad del ensayo entre diferentes genotipos.
- Valor predictivo: Detecta cambios en la preferencia u evitación de olores en modelos knockout, lo que apoya la desviación temprana de dianas asociadas a indicaciones neurodegenerativas o psiquiátricas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera métricas cuantitativas de tiempo empleado mediante análisis asistido por computadora con ImageJ, lo que permite comparaciones objetivas de las respuestas a olores entre grupos experimentales.
- Valor operativo: Requiere únicamente jaulas estándar, lecho, aromas y una cámara de video, lo que posibilita su implementación escalable en laboratorios de descubrimiento sin necesidad de equipo especializado.
- Valor predictivo: Permite la caracterización de respuesta frente a dosis en pruebas de sensibilidad, ayudando en la optimización de compuestos al definir rangos de concentración efectivos para comportamientos inducidos por odorantes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con los déficits olfativos humanos como biomarcadores prodrómicos, mejorando la relevancia traslacional de los modelos murinos en la investigación de enfermedades neurodegenerativas.
- Valor operativo: Permite pruebas longitudinales de sensibilidad mediante series de diluciones sucesivas, apoyando el seguimiento de la progresión en estudios preclínicos de eficacia.
- Valor predictivo: Identifica umbrales específicos por genotipo para la detección de olores, lo que ayuda en la estratificación de pacientes y en la selección de objetivos alineados con biomarcadores.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se enmarca en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos prometedores, proporcionando lecturas conductuales que orientan las decisiones de avance o interrupción antes de la inversión en compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la medición de la discriminación y preferencia olfativa innata, aclarando la función de los genes en las vías de procesamiento sensorial.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados (tiempo en zonas con olor frente a zonas con agua) que permiten comparaciones fiables de los efectos de compuestos o genotipos.
- Análisis: El análisis asistido por ordenador ofrece mediciones reproducibles basadas en umbrales, que facilitan la comparación estadística entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al modelar la pérdida de sensibilidad olfativa, una característica predictiva de la neurodegeneración clínica.
- Reutilización Empresarial: Reutilizable en múltiples tipos de pruebas (preferencia, evitación, sensibilidad) y cepas de ratones, funcionando como una capacidad de plataforma en lugar de un ensayo de uso único.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la función del circuito olfativo.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y la reproducibilidad mediante tiempos de exposición fijos, análisis ciego de videos y controles internos con agua.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la triage rápida de objetivos mediante fenotipificación conductual de bajo costo y alta reproducibilidad.
- Impacto en la cartera: Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo al identificar objetivos cuya modulación rescata o recapitula fenotipos olfativos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de roedores, observación del comportamiento y software básico de seguimiento por video (ImageJ).
- Depende de una iluminación constante, posición de la cámara (58 cm por encima de la jaula) y preparación del odorante (por ejemplo, diluciones de aceite de mantequilla de maní, series de dilución de orina).
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de habituación y el análisis en ciego para minimizar el sesgo del operador.
- La adaptación entre sistemas modelo requiere la validación de la relevancia del odorante (por ejemplo, feromonas o sustancias aversivas específicas de la especie).
- Limitación práctica: la sensibilidad del ensayo depende de la administración precisa del odorante y de la limpieza entre ensayos para prevenir la contaminación cruzada, especialmente en pruebas de sensibilidad.
