Name: Simple y asistida por ordenador de pruebas olfativas para Ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprende a realizar pruebas olfativas simples y asistidas por ordenador en ratones para evaluar discriminación, preferencia y sensibilidad olfatoria. Este método utiliza análisis de video con Image J para estudiar comportamientos innatos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo está financiado por la Fundación Nacional Suiza (31_138429) y la Fundación Synapsis para apoyar la investigación sobre la enfermedad de Alzheimer.

Todos los procedimientos con animales están en conformidad con la Directiva de la UE 2010/63 / UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos y son aprobados por el Comité local de Cuidado de Animales (Cantón de Friburgo, Suiza). 1. Preparación Animal <ol><li> Los animales experimentales <ol><li> Realizar experimentos sobre tipo salvaje adulto de sexo masculino y de ratones transgénicos (C57BL / 6 de fondo) de 3-5 meses de edad. Los tres grupos de ratones corresponden a los controles de tipo salvaje (littermate grupo A, Jagged1 flox / flox 19) y dos líneas condicionales de ratón KO (grupo B, C y Jagged1ncKO, Jagged1gcKO). </li><li> Los ratones en condiciones de laboratorio estándar en una habitación ventilada, con un ciclo de oscuridad / luz controlada 12 horas y proporcionan alimento y agua ad libitum. </li></ol></li></ol> 2. Configuración Experimental <ol><li> Arena Experimental <ol><li> Para el ámbito experimental, utilizar una jaula ratón esterilizada limpia (36 cm largo x 20.5 cm de ancho x 13.5 cm de altura) (Figura 1). </li><li> Asigne a cada ratón a una jaula numerada con ropa de cama fresca, 3 cm de alto. Si se vuelven a utilizar jaulas, como en la prueba de sensibilidad al olor, tome las siguientes medidas para evitar la contaminación cruzada entre los olores y ratones. <ol><li> Marque el lado del agua. </li><li> Limpiar las paredes estrechas de las jaulas con dos papeles de seda rociadas con 70% de etanol, uno para cada lado. </li><li> Apilar las jaulas de acuerdo con el genotipo de los ratones y almacenar temporalmente bajo una campana laminar. </li></ol></li></ol></li><li> Cámara <ol><li> Montar una cámara en un trípode personalizada con el objetivo a 58 cm de la parte inferior de la jaula (Figura 1A). Fijar la posición del trípode y la jaula y delimitar con marcas para permitir que la cámara se centra en la parte superior de la jaula. </li><li> Grabar videos en 320 píxeles x 240 píxeles, 15,08 fotogramas por segundo como archivos MOV. </li></ol></li><li> Olores <ol><li> Resuspender el scents, cuando se indique, en el disolvente en el que son solubles. </li><li> Para la prueba de preferencia de uso de mantequilla de maní. Resuspender la mantequilla de cacahuete en aceite de cacahuete (10% w / v). </li><li> Para la utilización prueba de evitación puro 2-metilbutírico (2-MB) ácido (98%). </li><li> Para la prueba de sensibilidad, utilizar orina femenina de la misma colonia ratón y de fondo (C57BL / 6). <ol><li> Por conveniencia recoger la orina 1-2 días antes de la prueba olfativa. Restringir y mantenga pulsado el ratón debajo de la capilla con su vientre encima de la rejilla de la jaula. Bajo la rejilla jaula colocar una placa de Petri de plástico para recoger las gotas de orina. </li><li> Recoger la orina de cada mujer en un tubo de 1,5 ml y mezclar todas las muestras de orina para normalizar la variabilidad entre animales. Almacenar a -20 ° C hasta su uso. </li><li> En el día del experimento, descongelar la orina y realizar 4 diluciones en agua doblemente destilada a un factor de dilución de 10 (1:10, 1: 100, 1: 1.000; 1: 10.000). </li></ol></li></ol></li></ol>3. Las pruebas olfativas Nota: En este protocolo olores han sido elegidos deliberadamente que se perciben como atrayentes fuertes (mantequilla de maní y orina femenina) o repelente fuerte (ácido 2-MB) 15. Es importante para llevar a cabo la preferencia y las pruebas de sensibilidad a los olores agradables antes de la prueba de evitación para eliminar la posibilidad de cualquier interferencia con el comportamiento olfativo. Sin embargo, en aras de la simplicidad, en este trabajo, prueba de preferencia y la evitación será tanto se describe en la prueba de percepción. Cada sesión de comportamiento comienza con una fase de habituación. <ol><li> La habituación fase <ol><li> Colocar el animal en la jaula asignado limpia y se deja explorar durante 5 min (Figura 1B). Desde el entorno de la jaula experimental es familiar a la jaula de alojamiento, este corto período de tiempo es suficiente para permitir la habituación. </li><li> Si se completa la prueba de sensibilidad en un solo día, realice habituación sólo una vez antes de la application de la más alta olor diluido. Si la prueba de sensibilidad se lleva a cabo en diferentes días, en cada día se necesita una fase de habituación en una nueva jaula limpia. </li></ol></li><li> Prueba de Percepción <ol><li> Después de la habituación, activar la cámara e inmediatamente pipetear 60 l de la agradable aroma (mantequilla de maní) y 60 l de la olor neutro (agua del grifo) sobre las paredes opuestas de la jaula en alrededor de 10 cm desde la parte inferior (Figura 1C). </li><li> Deje que el ratón explorar los olores durante 2 min (Figura 1D). A partir de entonces, apague la cámara. </li><li> En este punto, continúe con la próxima ratón a partir de la fase de habituación. Realizar la prueba de evitación exactamente de la misma manera mediante la aplicación de 60 l de la olor repelente (ácido 2-MB) y 60 l de agua. </li></ol></li><li> Prueba de sensibilidad <ol><li> Evaluar el umbral de atracción de ratones macho a concentraciones crecientes de orina femenina en el siguiente orden: 1: 10.000; 1: 1.000; 1: 100; 1:10 y en la orina pura. </li><li> Después de la habituación, exponer cada ratón para la mayor dilución pipeta por el experimentador como se describe anteriormente en 3.2.1. </li><li> Registre el comportamiento exploratorio de la orina frente de agua, dentro de un plazo de 2 minutos en una cámara de vídeo. Después de todas las cohortes ratones son la prueba de la mayor dilución (1: 10.000), exponerlo a una mayor concentración de la orina, como se indicó anteriormente. </li></ol></li></ol> 4. Post-hoc de análisis de datos Nota: Todas las pruebas de comportamiento descritos se procesan post hoc siguiendo las instrucciones de análisis de datos. <ol><li> Abrir archivos MOV en ImageJ para sistemas Windows <ol><li> Instalar Quick Time para Java usando la configuración personalizada de http://www.apple.com/quicktime/download. </li><li> Instale el plugin de Quick Time desde el sitio web ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html). </li><li> Importe el QTJava.zip (C: Archivos de programa QuickTime QTSystem) en las extens bibliotecaión de ImageJ (.ImageJ jre lib ext). </li><li> Copiar también el QTJava.zip en la carpeta plugins y cambiarle el nombre como QTJava.jar. </li><li> Instale los seis guiones adjuntos en la carpeta Macros (ImageJ plugins Macros). </li><li> Abrir ImageJ y compilar y ejecutar el plugin de Quick Time, a partir de entonces cerca ImageJ. </li><li> Reabrir ImageJ y abra el archivo MOV utilizando Archivo&gt; Importar&gt; usando Quick Time. </li></ol></li><li> Ajuste de vídeo <ol><li> Una vez que el archivo de vídeo se abre en ImageJ, cortar el vídeo con el fin de obtener una constante exploración 2 min desde el momento en que el experimentador ha pipetearon los odorantes en la jaula (T0). Identificar la estructura correspondiente al T0 y quitar los marcos anteriores utilizando incrementos de 1 (ImageJ imagen Pilas ToolsSlice removedor). Utilice el mismo comando para eliminar todas las tramas que superan la exploración 2 min. </li><li> Asegúrese de que la jaula está centrado y si es necesario, utilice la Imagen&gt; Transformar&gt; comando Rotar para alinearlo. </li></ol></li><li> Véaseo Procesamiento Nota: El procesamiento de vídeo es totalmente asistida por ordenador y usa comandos macros que acompañan este documento. <ol><li> Con el fin de restringir el área en la jaula de un 127 píxeles x 218 píxeles Tamaño de ejecutar el Paso 1 macro desde el Plugin&gt; Macros&gt; Ejecutar comando. Mueva el rectángulo fijo sobre la jaula (Figura 2, Paso 1). </li><li> Recortar el área de la jaula en la región de interés (ROI) con el Paso 2 macro (Figura 2, Paso 2). </li><li> Utilice la macro Paso 3 para extraer la imagen del ratón del fondo mediante la asignación de una señal de umbral, eliminación de puntos y el filtrado de la varianza de la señal. Los valores de salida en la trama eje Z indican los valores de gris medio, correspondiente a la intensidad de la sombra del ratón en movimiento dentro de la ROI de la &quot;cámara de agua&quot; durante la exploración 2 min. Copie los resultados en una hoja de cálculo denominada según el retorno de la inversión en un archivo de hoja de cálculo (Figura 2, Paso 3). </li><li> Utilice el Paso 4 macro paraextraer los valores medios de grises el ratón en la ROI &quot;cámara de olor&quot;. Copie los resultados en una hoja de cálculo denominada según el retorno de la inversión en la misma hoja de cálculo como en 4.3.3 (Figura 2, Paso 4). </li><li> Con el fin de restringir aún más el análisis del movimiento del ratón en el retorno de la inversión &quot;perímetro agua&quot; utilizar el Paso 5 macro. Copie el resultado en la hoja de cálculo llamado según el retorno de la inversión en la misma hoja de cálculo como en 4.3.3 (Figura 2, Paso 5). </li><li> Para restringir el análisis del movimiento del ratón en el retorno de la inversión &quot;olor perímetro&quot; utilizar el Paso 6 macro. Copie el resultado en la hoja de cálculo llamado de acuerdo con el archivo de hoja de cálculo de retorno de la inversión como en 4.3.3 (Figura 2, Paso 6). </li><li> Procesar todos los vídeos y comprobar la consistencia en el número de fotogramas por animales. Aquí, registrar todos los animales de 1810 tramas correspondientes a una sesión de exploración de 2 min. </li><li> Para cada animal y para cada tipo de ROI con marcos va de gris mediolues mayor que 0. Divide el número de fotogramas por los valores correspondientes a 1 segundo y obtener los segundos transcurridos en cada retorno de la inversión. </li></ol></li></ol> 5. Análisis estadístico <ol><li> Para cada prueba verificar la homogeneidad de la varianza dentro de grupos / genotipos mediante la prueba de Bartlett utilizando la fórmula disponible en http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/. </li><li> En la prueba de la atracción y evitación, realizar comparaciones entre los tiempos pasados ​​con agua frente olor dentro de un grupo utilizando la prueba t de Student no direccional asumiendo varianzas iguales o desiguales en función de los resultados de la prueba de Bartlett. Compare los tiempos pasados ​​con los olores restados por el tiempo que pasa con el agua entre los genotipos mediante un modelo lineal con la prueba post-hoc de Bonferroni. </li><li> En la prueba de sensibilidad a analizar las comparaciones del tiempo pasado con el olor restado del tiempo pasado con finalesr entre los grupos en un diluciones específicas de la orina por un modelo lineal con la prueba post-hoc de Bonferroni. Comparar la sensibilidad entre los grupos a las concentraciones crecientes de olor en un 2-Way ANOVA con repeticiones con test post-hoc de Bonferroni. </li><li> La interacción entre genotipos y tratamientos en la prueba de la atracción y la evasión son investigados por 2 vías ANOVA con test post-hoc de Bonferroni. </li></ol>

<ol><li>Doty, R. L., Kamath, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influences+of+age+on+olfaction%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cognitive+Science%22%5BJournal%5D)">The influences of age on olfaction: a review.</a> Cognitive Science. 5, 20(2014).</li>
<li>Mesholam, R. I., Moberg, P. J., Mahr, R. N., Doty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+in+neurodegenerative+disease%3A+a+meta-analysis+of+olfactory+functioning+in+Alzheimer%E2%80%99s+and+Parkinson%E2%80%99s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Olfaction in neurodegenerative disease: a meta-analysis of olfactory functioning in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases.</a> Archives of Neurology. 55 (1), 84-90 (1998).</li>
<li>Moberg, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Dysfunction+in+Schizophrenia%3A+A+Qualitative+and+Quantitative+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Olfactory Dysfunction in Schizophrenia: A Qualitative and Quantitative Review.</a> Neuropsychopharmacology. 21 (3), 325-340 (1999).</li>
<li>Kovács, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+olfactory+dysfunction+in+aging+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of olfactory dysfunction in aging and neurodegenerative disorders.</a> Ageing Research Reviews. 3 (2), 215-232 (2004).</li>
<li>Barrios, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+and+neurodegeneration+in+HD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Olfaction and neurodegeneration in HD.</a> Neuroreport. 18 (1), 73-76 (2007).</li>
<li>Doty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+in+Parkinson%E2%80%99s+disease+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Olfaction in Parkinson’s disease and related disorders.</a> Neurobiology of Disease. 46 (3), 527-552 (2012).</li>
<li>Doty, R. L., Shaman, P., Dann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+University+of+Pennsylvania+Smell+Identification+Test%3A+a+standardized+microencapsulated+test+of+olfactory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Development of the University of Pennsylvania Smell Identification Test: a standardized microencapsulated test of olfactory function.</a> Physiology & Behavior. 32 (3), 489-502 (1984).</li>
<li>Devanand, D. p, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Deficits+in+Patients+With+Mild+Cognitive+Impairment+Predict+Alzheimer%E2%80%99s+Disease+at+Follow-Up%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Olfactory Deficits in Patients With Mild Cognitive Impairment Predict Alzheimer’s Disease at Follow-Up.</a> American Journal of Psychiatry. 157 (9), 1399-1405 (2000).</li>
<li>Conti, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+Identification+Deficit+Predicts+Clinical+Conversion+from+Mild+Cognitive+Impairment+to+Dementia+Due+to+Alzheimer%E2%80%99s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Clinical+Neuropsychology%22%5BJournal%5D)">Odor Identification Deficit Predicts Clinical Conversion from Mild Cognitive Impairment to Dementia Due to Alzheimer’s Disease.</a> Archives of Clinical Neuropsychology. 28 (5), 391-399 (2013).</li>
<li>Keller, A., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+Smelling+Through+Genetics%3A+Mammalian+Odor+Perception%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Better Smelling Through Genetics: Mammalian Odor Perception.</a> Current opinion in neurobiology. 18 (4), 364-369 (2008).</li>
<li>Brai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+activity+in+the+olfactory+bulb+is+odour-dependent+and+contributes+to+olfactory+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Notch1 activity in the olfactory bulb is odour-dependent and contributes to olfactory behaviour.</a> European Journal of Neuroscience. 40 (10), 3436-3449 (2014).</li>
<li>Larson, J., Hoffman, J. S., Guidotti, A., Costa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+discrimination+learning+deficit+in+heterozygous+reeler+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Olfactory discrimination learning deficit in heterozygous reeler mice.</a> Brain Research. 971 (1), 40-46 (2003).</li>
<li>Alonso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Discrimination+Learning+Increases+the+Survival+of+Adult-Born+Neurons+in+the+Olfactory+Bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory Discrimination Learning Increases the Survival of Adult-Born Neurons in the Olfactory Bulb.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10508-10513 (2006).</li>
<li>Wesson, D. W., Keller, M., Douhard, Q., Baum, M. J., Bakker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+urinary+odor+discrimination+in+female+aromatase+knockout+%28ArKO%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+behavior%22%5BJournal%5D)">Enhanced urinary odor discrimination in female aromatase knockout (ArKO) mice.</a> Hormones and behavior. 49 (5), 580-586 (2006).</li>
<li>Kobayakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+versus+learned+odour+processing+in+the+mouse+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb.</a> Nature. 450 (7169), 503-508 (2007).</li>
<li>Witt, R. M., Galligan, M. R., Despinoy, J., Segal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Behavioral+Testing+in+the+Adult+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (23), (2009).</li>
<li>Lee, A. W., Emsley, J. G., Brown, R. E., Hagg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+olfactory+sensitivity+and+apparent+speed+of+forebrain+neuroblast+migration+in+three+inbred+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Marked differences in olfactory sensitivity and apparent speed of forebrain neuroblast migration in three inbred strains of mice.</a> Neuroscience. 118 (1), 263-270 (2003).</li>
<li>Page, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computerized+assessment+of+social+approach+behavior+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Computerized assessment of social approach behavior in mouse.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 3, 48(2009).</li>
<li>Nyfeler, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged1+signals+in+the+postnatal+subventricular+zone+are+required+for+neural+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Jagged1 signals in the postnatal subventricular zone are required for neural stem cell self-renewal.</a> Embo J. 24 (19), Available from:
	
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16163386"">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16163386"</a> 3504-3515 (2005).</li>
<li>Tong, M. T., Peace, S. T., Cleland, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+mechanisms+of+olfactory+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Properties and mechanisms of olfactory learning and memory.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Steinlechner, S. Chapter 2.12 - Biological Rhythms of the Mouse. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123820082000179">http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123820082000179</a> 383-407 (2012).</li>
<li>Corthell, J., Stathopoulos, A., Watson, C., Bertram, R., Trombley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Bulb+Monoamine+Concentrations+Vary+with+Time+of+Day%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory Bulb Monoamine Concentrations Vary with Time of Day.</a> Neuroscience. 247, 234-241 (2013).</li>
<li>Lehmkuhl, A. M., Dirr, E. R., Fleming, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+assays+for+mouse+models+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51804(2014).</li>
</ol>

No hay conflicto de intereses.

Las pruebas que se proponen en este protocolo permiten evaluar diferentes aspectos del comportamiento olfativo innata en ratones: la percepción de los olores, la discriminación entre los olores frente a agua y la sensibilidad a los olores. Este protocolo se puede aplicar a cualquier olor de acuerdo con la preferencia y la escala de evitación previamente demostrado 15. Dado que el protocolo se basa en la actividad exploratoria es importante que los ratones no muestran ningún deterioro motor o la ansiedad que p...

El olfato es una de las funciones sensoriales más desarrollados e importantes en los mamíferos. Cualquier alteración en la actividad olfativa puede afectar la ingesta de alimentos, el comportamiento social y, en el peor de los casos, incluso la supervivencia. En los seres humanos, el deterioro del olfato es dependiente de 1 año y es considerado un fuerte predictor de trastornos neurológicos 2-6. La prueba de identificación del olfato desarrollado por la Universidad de Pennsylvania representa actualmente una de las pruebas más utilizadas, no invasivos y cuantificables, de diagnóstico que pueden evaluar los déficits neurológicos primeros 7 y predecir con alta probabilidad la progresión de la demencia 8,9. La accesibilidad del sistema olfativo y la prominencia del olfato en los roedores, ha desatado una intensa línea de investigación frente a los mecanismos de las funciones olfativas subyacentes 10. Hemos demostrado anteriormente que la pérdida de la función del recept señalizacióno Notch1 afecta evitar olfativa 11. En este protocolo que utilizamos ratones que carecen del ligando de señalización, Jagged1, en neuronas o células gliales para estudiar el rendimiento olfativo. Olfato innato se define por tres parámetros como la percepción, la discriminación entre los olores y la sensibilidad olfativa 4. Pruebas olfativas en roedores se puede hacer en una variedad de maneras y algunos estudios de comportamiento hacer uso de olfatómetros, que proporcionan el olor al animal en un concentraciones de vapor específicas y en un marco de tiempo precisa 12 - 14. Sin embargo, esta instrumentación es caro y puede estar disponible sólo en instalaciones especializadas. En nuestro trabajo, ofrecemos un protocolo de prueba olfativa simple, rápida y reproducible, que se lleva a cabo utilizando aromas volátiles. Las pruebas descritas percepción medida para un atrayente o un olor repelente y evaluar la discriminación entre el olor y 11,15,16 agua. Usando la misma configuración, wE también puede medir la sensibilidad a un olor a diferentes concentraciones 16,17. El procesamiento post-hoc asistida por ordenador de vídeo, inspirado en la obra de la página y sus colegas 18, ofrece resultados sin la necesidad de cegamiento experimental y permitiendo una sola persona para llevar a cabo todo el experimento. Este protocolo está destinado a proporcionar un punto de partida para estudiar el comportamiento olfativo en ratones.

<table><tbody><tr><td>Jaula para ratones</td><td>Italplast (Italia)</td><td>1144B</td><td>36 cm de largo x 20,5 cm de ancho x 13,5 cm de alto</td></tr><tr><td>Ropa de cama de madera astillada</td><td>Abedd (Austria)</td><td>LTE E-001</td><td>3 cm de altura</td></tr><tr><td>Mantequilla de cacahuete</td><td>Migros (Suiza)</td><td>NA</td><td>1:10</td></tr><tr><td>2-metilbutírico</td><td>Sigma Aldrich (Suiza)</td><td>W269514</td><td>Pura</td></tr><tr><td>Orina de hembras fértiles de la misma cepa de ratón</td><td>NA</td><td></td><td>NA Serie de dilución</td></tr><tr><td>Cámara Olympus</td><td>(EE. UU.)</td><td>Camedia C-8080</td><td>Archivos MOV</td></tr><tr><td>Quicktime para Java (Windows)</td><td>Apple (EE. UU.)</td><td>Complemento de</td><td>video NA para visualizar archivos MOV</td></tr><tr><td>ImageJ para Windows</td><td>NIH (EE. UU.)</td><td>NA</td><td>Procesamiento/análisis de video</td></tr></tbody></table>

simple y asistida por ordenador de pruebas olfativas para ratones

Simple and Computer-assisted Olfactory Testing for Mice

El olfato está altamente conservada entre las especies y se requiere para la reproducción y la supervivencia. En los seres humanos, el olfato es también uno de los sentidos que se ve afectado con el envejecimiento y es un fuerte predictor de enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, las pruebas de olfato se utiliza como un método de diagnóstico no invasivo para detectar déficits neurológicos desde el principio. Con el fin de comprender los mecanismos subyacentes de sensibilidad olfativa red, la investigación olfativa en roedores ha cobrado impulso en la última década. A continuación, presentamos un método muy simple, eficiente en tiempo y reproducible prueba olfativa de innata percepción del olor y la sensibilidad en los ratones sin la necesidad de cualquier restricción de alimentos o agua antes. Las pruebas se realizan en un ambiente familiar a los ratones, requieren sólo los olores y una sesión de 2 minutos de exposición odorante. Se lleva a cabo el análisis, post-hoc, utilizando comandos asistida por ordenador en ImageJ y puede ser, por lo tanto,, Llevado a cabo de principio a fin por un investigador. Este protocolo no requiere ningún hardware o configuración especial y está indicado para cualquier laboratorio interesado en probar la percepción olfativa y sensibilidad.

La prueba mide la percepción de la atracción a la mantequilla de maní y la evitación de ácido 2-MB. Tres grupos de ratones se prueban y el tiempo pasado en el &quot;olor perímetro&quot; se cuantifican en comparación con agua. En la prueba de preferencia, el grupo de control A muestra preferencia significativa al olor en comparación con agua (8 t = 2,52, p &lt;0,05). Por otra parte, el grupo B no muestra ningún interés significativo para la mantequilla de maní y pasa más tiempo con agua (t 6 = 3.22,...

Presentamos una prueba olfativa sencilla e imparcial en ratones. Con este protocolo, la discriminación olfativa, la preferencia, la evitación y la sensibilidad a un olor nuevo en comparación con el agua se pueden evaluar en sesiones conductuales únicas. Este método está indicado para un solo experimentador y el análisis se basa en el procesamiento de vídeo asistido por ordenador.

Simple y asistida por ordenador de pruebas olfativas para Ratones

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en evaluar la discriminación olfativa innata, la preferencia u oposición olfativa y la sensibilidad olfativa en ratones. Esto se logra exponiendo al ratón a un atrayente o estímulo novedoso y a un olor neutro, que es el agua. Mientras tanto, una cámara de video registra la sesión de comportamiento. A continuación, se analiza el video en Image J utilizando los macros proporcionados para obtener el tiempo dedicado a los parámetros de olor y agua. Los resultados muestran el comportamiento de preferencia o evitación frente a olores en comparación con el agua entre diferentes genotipos, según el análisis posterior asistido por computadora. La principal ventaja de la prueba olfativa frente al uso de una arena especializada y olfativa es que utiliza una arena familiar, por lo que su finalización es rápida y su montaje sencillo.Además, utiliza hardware económico, demostrando que el procedimiento lo realizará Emmanuel Abry, estudiante de mi laboratorio. Para este experimento, utilice ratones macho de entre tres y cinco meses de edad, C57 negro, seis de tipo silvestre y ratones transgénicos. Esta demostración utiliza dos líneas knock-out y controles de camada.Para las arenas experimentales, utilice jaulas esterilizadas y limpias para ratones con tres centímetros de cama. A continuación, prepare el montaje de la cámara. Colóquela a 58 centímetros sobre el piso de la jaula mediante un soporte personalizado de trípode.Haga algunas marcas en la superficie de trabajo para indicar la posición que debe tener la jaula. Para una imagen central, configure la cámara para grabar un video de 320 por 240 píxeles a aproximadamente 15 cuadros por segundo. Para preparar al sujeto de prueba, tenga concentrados de cada aroma almacenados en disolvente siempre que sea posible.Para la prueba de preferencia, prepare una solución al 10% peso por volumen de mantequilla de maní en aceite de maní. Para la prueba de evitación, tenga lista una solución al 98% de ácido butírico metílico. Para la prueba de sensibilidad, recolecte orina de hembras de un ratón de la misma cepa uno o dos días antes de la prueba.Sujete a una hembra con su abdomen por encima de la rejilla de la jaula y recolecte gotas de su orina en un recipiente de plástico. Recolecte muestras de varias hembras para normalizar. Debido a la variabilidad individual, reúna todas las muestras en un tubo de 1,5 mililitros y almacénelas a menos 20 grados Celsius.Para comenzar, habitúe a los animales colocando uno en una jaula limpia y permita que explore. Durante cinco minutos, el ambiente de la jaula de prueba debe ser similar al de la jaula de origen. Repita la fase de habituación una vez en cada día de prueba; cuando finalice el período de habituación, comience la grabación y pipetee 60 microlitros de un olor agradable.En este caso, coloque mantequilla de maní en una pared y, en la pared opuesta, agregue con pipeta la misma cantidad de agua. Aplique las gotas de un olor neutro aproximadamente a 10 centímetros de altura en cada pared. Ahora permita que el animal explore durante dos minutos, luego detenga la grabación y devuelva al ratón a su jaula de origen.Repita el proceso con cada ratón que se vaya a probar, utilizando siempre jaulas de prueba nuevas. De tres a cinco días después de realizar todas las pruebas de preferencia, lleve a cabo la prueba de evitación utilizando una jaula de prueba nueva.Para cada ratón, realice la prueba de evitación. Al igual que en la prueba de atracción, solo sustituya el aroma agradable por el aroma de evitación, que es el ácido 2-metilbutírico. Para la prueba de sensibilidad, se puede reutilizar una jaula entre ensayos para el mismo ratón.Marque entonces el lado del agua de la jaula y prepárese para limpiar las paredes cortas con papel impregnado en etanol al 70 % entre cada prueba. El día del experimento, prepare cuatro concentraciones de la orina mediante una serie de diluciones de diez veces. Utilizando agua doblemente destilada como en la prueba de evitación, habitúe a cada animal a su jaula de prueba durante cinco minutos.Luego exponga a cada ratón primero a la orina en la dilución más alta, que es de uno a 10.000. Durante la grabación, aplique la dilución de orina a la jaula de prueba y aplique agua a la pared opuesta. Como se hizo para otras pruebas, permita que el animal explore.Durante dos minutos. Posteriormente, transfiera el animal a una jaula limpia para ratón. Después de que todos los animales hayan estado expuestos a la concentración más baja, limpie todas las paredes de la jaula de prueba y repita el ensayo en cada ratón utilizando la orina con la siguiente concentración más alta.Continúe este proceso hasta que se analice la orina pura. Después de recopilar todos los datos de un experimento, abra los videos en ImageJ para realizar ajustes y procesamiento, cuyos detalles se proporcionan en el protocolo escrito utilizando los protocolos descritos. Dos líneas knockout diferentes.Los grupos B y C se compararon con el grupo control de camada A. Se utilizó una prueba T de Student no direccional con varianza igual o desigual para comparar el tiempo empleado entre el olor y el agua dentro de los genotipos. Compare el comportamiento entre genotipos utilizando un ANOVA unifactorial. Ambos grupos experimentales, B y C, no mostraron preferencia por el olor atractivo. En la prueba de evitación, la respuesta frente al olor repulsivo del ácido 2-metilbutírico fue la esperada para los grupos A y B, pero el grupo C no mostró comportamiento de evitación frente a este olor.En la prueba de sensibilidad, el umbral de atracción se obtuvo restando el tiempo empleado con orina del tiempo empleado con agua, siendo la orina preferida frente al agua en una dilución de uno a 1000. Mientras tanto, ambos grupos experimentales, B y C, necesitaron una concentración 100 veces mayor para mostrar preferencia. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un par de horas si se lleva a cabo correctamente; posteriormente, siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el aprendizaje olfativo y la extinción para investigar la plasticidad y el aprendizaje olfativo.

simple-and-computer-assisted-olfactory-testing-for-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Propiedades fundamentales, sin embargo, exclusiva del sistema olfativo de roedores han llevado a su estudio cada vez mayor entre los biólogos. Una evaluación relativamente simple de su función se necesita también. A continuación se describen las pruebas sensibles para la caracterización de la sensibilidad del ratón olfativo y preferencias.

Pruebas del comportamiento olfativo en el ratón adulto

El deterioro de la función olfativa es una característica común en muchos trastornos neurodegenerativos, como las enfermedades de Parkinson, Alzheimer y Huntington. En el presente artículo, describimos un conjunto de pruebas para evaluar la discriminación y detección del olfato en ratones que pueden utilizarse para medir las capacidades olfativas en modelos murinos de enfermedades neurodegenerativas.

Los ensayos olfativos para modelos de ratón de Enfermedades Neurodegenerativas

Este manuscrito describe un protocolo para examinar el sistema olfativo de los roedores. La prueba de habituación/deshabituación olfativa permitirá a los investigadores determinar si un ratón se habitúa a un olor presentado repetidamente y si el ratón demuestra deshabituación cuando se le presenta un olor nuevo.

Las pruebas para detectar olor Discriminación y habituación en ratones

Las anormalidades cognitivas atencionales que cambian de conjunto son una característica central de muchas enfermedades psiquiátricas. Aquí, presentamos el desarrollo de un nuevo sistema automático para el estudio efectivo de las habilidades de cambio de configuración atencional, las funciones ejecutivas y otras habilidades cognitivas en ratones con alta validez traslacional para estudios en humanos.

Una operante intra / extra-dimensional Conjunto de cambio de tareas para ratones

Aquí capacitamos a ratones en una tarea de aprendizaje asociativo para probar la discriminación de olor. Este protocolo permite también estudios sobre cambios estructurales inducidos por el aprendizaje en el cerebro.

Una prueba objetiva y Reproducible de aprendizaje olfativo y discriminación en ratones

Este artículo proporciona una descripción detallada de un nuevo protocolo de sesgo de juicio del ratón. También se demuestra la sensibilidad de esta tarea de excavación olfativa al estado afectivo y se discute su utilidad en diversos campos de investigación.

Evaluación del sesgo de juicio del ratón a través de una tarea de excavación olfativa

Este artículo proporciona una descripción detallada de la prueba de alimentos enterrados y el experimento de discriminación social de olores para evaluar los efectos de la exposición a contaminantes ambientales inhalados en la función olfativa en ratones.

Estudio de los efectos de los contaminantes ambientales inhalados sobre la función olfativa en ratones

Este protocolo describe la construcción de un olfatómetro para experimentos de comportamiento olfativo de pasa/no pasa. Se proporcionan instrucciones paso a paso, junto con imágenes, para garantizar la construcción exitosa del olfatómetro. También se incluye información para solucionar los problemas encontrados durante el proceso.

Construcción de un olfatómetro para estudios de comportamiento olfativo de roedores

Aquí, presentamos un protocolo de una prueba de preferencia olfativa que permite la evaluación de los sesgos olfativos negativos hacia los estímulos olfativos apetitivos y aversivos en modelos de depresión en ratones.

Una prueba de preferencia olfativa para medir los sesgos hedónicos olfativos en modelos murinos de depresión

En este artículo se presenta un protocolo para un temor prueba contextual y complementada acondicionado mediante un sistema de análisis de vídeo para evaluar el aprendizaje del miedo y la memoria en ratones.

Contextuales y complementada el condicionamiento del miedo de prueba utilizando un sistema de análisis de vídeo en ratones

Aprende a realizar pruebas olfativas simples y asistidas por ordenador en ratones para evaluar discriminación, preferencia y sensibilidad olfatoria. Este método utiliza análisis de video con Image J para estudiar comportamientos innatos.

Simple y asistida por ordenador de pruebas olfativas para Ratones

Explorar más videos