Plantillas distintivo acción capilar por micro-canales en hueso como puede mejorar el reclutamiento de células para la Restauración del Gran Bony Defecto

El objetivo general de este procedimiento es crear un microambiente de molde óseo que tenga la capacidad de restaurar el hueso faltante o dañado. Esto se logra primero dando forma y modificando una esponja de poliuretano para que encaje dentro de un área defectuosa. El segundo paso es cubrir uniformemente la esponja de poliuretano con una lechada viscosa de hidroxiapatita y dejar que se seque.

El paso final es centrar el recubrimiento de hidroxiapatita en un horno muscular de alta temperatura. En última instancia, se fabrica una plantilla similar a un hueso con microcanales diseñados con una alta capacidad de absorción y retención celular. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el alcance de sal o las técnicas de impresión 3D, es que el ingeniero de microcanales en el tra induce la acción capilar.

Este método puede ayudar a abordar los principales retos en el campo de la medicina regenerativa, como la reconstrucción de defectos óseos craneales, maxilofaciales y segmentarios. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de las deformidades congénitas. Las plantillas son completamente personalizables en forma y tamaño, y la acción capilar fomentará la migración celular a larga distancia.

Aunque este método proporciona información sobre la regeneración ósea, también se puede aplicar a otros sistemas de cultivo, como la plataforma de cultivo de cáncer en 3D. Comience recortando esponjas de poliuretano con 80 poros por pulgada en formas de puente con dimensiones de 3,5 centímetros de alto por cinco centímetros de ancho por 1,5 centímetros de profundidad. A continuación, prepare 100 mililitros de una solución de hidróxido de sodio al 4%.

Usando un vaso de precipitados de 150 mililitros. Sumerge las esponjas en la solución de hidróxido de sodio y exprime el aire de la trampa hasta que las esponjas estén completamente empapadas. Una vez saturado, coloque el vaso de precipitados con las esponjas en un calor ultrasónico a 42 kilohercios durante 15 a 20 minutos sin calor.

Cuando termine, enjuague las esponjas con agua destilada durante cinco a 10 minutos mientras enjuaga, exprima las esponjas y deje que se expandan de cinco a siete veces para eliminar cualquier hidróxido de sodio residual dentro de las esponjas. Retire el exceso de agua de las esponjas con toallas de papel y luego colóquelas en un horno a 60 a 80 grados centígrados para terminar de secar. Para comenzar a hacer la suspensión de hidroxiapatita, primero pese un vaso de precipitados de 50 mililitros con una barra agitadora magnética.

A continuación, agregue 20 mililitros de agua destilada en el vaso de precipitados. Coma el agua en un plato caliente a una temperatura de 120 a 140 grados centígrados y revuelva con el agitador magnético. Cuando el agua comienza a hervir a 0,3 gramos de alcohol polivinílico en polvo en el agua destilada mientras se agita a 300 a 400 RPM.

Revuelva hasta que el polvo se haya disuelto por completo y la solución esté clara. Luego apague el fuego y agregue 0.1 gramos de polvo de carboximetilcelulosa de sodio de viscosidad ultra baja mientras continúa revolviendo a 400 a 500 RPM hasta que la solución se vuelva clara. Una vez más, una vez disuelta, enfríe la mezcla a temperatura ambiente.

A continuación, agregue 0,3 gramos de dispersante poliacrílico de amonio mientras revuelve a 300 a 400 RPM. Revuelva hasta que se disuelva por completo y luego agregue 0,2 gramos de glicerina mientras revuelve a 300 a 400 RPM. Revuelve la mezcla hasta que se haya disuelto por completo.

A continuación, pesa 10 gramos de polvo de hidroxiapatita de tamaño nanométrico y añádelo lentamente al vaso de precipitados mientras remueves a 600 a 900 rpm. Continúa removiendo durante cinco minutos. A continuación, coloque la mezcla en un ultrasonido y sonique durante cinco minutos Para asegurar la dispersión de cualquier aglomeración del polvo de apetito hidroxi, luego agregue cinco mililitros adicionales de agua destilada a la mezcla mientras revuelve a 600 a 900 RPM y caliente a 90 a 100 grados Celsius sigue agitando la mezcla usando un agitador magnético a 600 a 800 RPM a 90 a 100 grados Celsius.

Para evaporar el contenido de agua, mida el peso total, incluido el vaso de precipitados y la mezcla, de vez en cuando hasta obtener una proporción de polvo a líquido de 1,75 a 1,80. Como se describe en el protocolo de texto adjunto, deje que la lechada se enfríe a temperatura ambiente antes de usarla para la capa de recubrimiento, las esponjas de poliuretano preparadas con la suspensión de hidroxi apetito usando una espátula de acero inoxidable hasta que la lechada se distribuya homogéneamente por toda la esponja de poliuretano en una placa de vidrio. A continuación, sople ligeramente las esponjas con un compresor de aire para garantizar la interconectividad, la uniformidad y los poros abiertos.

Si no se logra un co homogéneo, las plantillas recubiertas de hidrogel colapsarán durante el proceso de ING y también pueden agrietarse durante la manipulación debido a las bajas restricciones de fabricación. Además, un recubrimiento homogéneo es fundamental para crear microcanales dentro de tally. Seque las plantillas recubiertas de HA durante un mínimo de cinco horas a 20 a 25 grados centígrados con una suave circulación de aire.

Aumente este tiempo para plantillas más grandes. Después del proceso de secado, coloque las plantillas recubiertas de HA en un crisol Illumina. A continuación, colóquelos en un horno de alta temperatura y siga el perfil de centrado de ocho pasos descrito en el protocolo de texto adjunto.

Agregue 10 mililitros de pre osteoblástico mc tres células T tres a 1 millón de células en un solo pocillo dentro de una placa de seis pocillos. Luego coloque la plantilla en forma de puente de tres centímetros por cuatro centímetros por un centímetro verticalmente en la placa de seis pocillos. Coloque una pata de la plantilla en un pozo que contenga la suspensión de la celda y la otra pata en un vacío adyacente.

Pues permita que la plantilla absorba la suspensión celular durante 10 minutos en una cabina de bioseguridad. A continuación, añada cinco mililitros de medio adicional al pocillo que se llenó originalmente con la suspensión de la celda. Después de cinco minutos adicionales, agregue cinco mililitros de medio al otro pocillo que no se llenó originalmente con la suspensión de celdas.

A continuación, coloque la instalación en una incubadora. Cambie los medios cada dos días durante siete días. Al final del experimento, fije las celdas y el andamio durante 20 a 30 minutos sumergiéndolos en un vaso de precipitados lleno de etanol al 100%.

Teñir el andamio enjuagado con hemat toin stain durante uno o dos minutos. Luego enjuáguelo durante uno o dos minutos sumergiendo nuevamente el andamio en un vaso de precipitados con agua destilada dos veces después del enjuague, deshidrate el andamio en celdas sumergiendo el andamio en etanol al 70% durante uno o dos minutos. Luego, transfiera el andamio a etanol al 95% durante uno o dos minutos adicionales.

Finalmente, coloque el andamio en etanol al 100% durante dos minutos. A continuación, contratiñe la construcción con e, s e Y durante uno o dos minutos. Luego enjuáguelo durante uno o dos minutos sumergiendo nuevamente el andamio en un vaso de precipitados con agua destilada dos veces.

Después del enjuague, deshidrate el andamio sumergiéndolo en una serie de etanol graduado antes de incrustar la resina. Finalmente, incruste el andamio en una resina acrílica para seccionar y obtener imágenes. La plantilla de microambiente biogénico que se muestra aquí a través de varias etapas de fabricación consiste en una red trabecular porosa completamente interconectada similar a la del hueso trabecular.

Esta plantilla tiene varios componentes estructurales, incluidos poros primarios interconectados de 300 a 400 micras de diámetro, microcanales de 25 a 70 micras de diámetro y nanoporos de 100 a 400 nanómetros de diámetro en la superficie, que permiten que las células se anclaran. La plantilla de microambiente biogénico admite la siembra de células a través de la acción capilar en todas las regiones del andamio. Inmediatamente después de la saturación completa, la distribución celular se puede ver claramente después de la tinción y el corte del andamio con hemat, toin y eoína.

El número de celdas en cada región de la plantilla se cuantificó y se rastreó después de tres días de cultivo. Después de siete días de cultivo, cada trabécula fue envuelta por matrices extracelulares e incrustada con células. Una vez dosificada, esta técnica se puede realizar en tres días si se realiza correctamente.

Al obtener este procedimiento, es importante recordar mantener la proporción correcta de polvo a agua y mantener un recubrimiento homogéneo después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el sistema de balanceo dinámico o el sistema de cultivo giratorio, para responder preguntas adicionales relacionadas con las respuestas celulares.