Name: Planar Sistema de Difusión de degradado para Investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprende a crear una cámara de difusión planar para investigar quimiotaxis en matrices de colágeno 3D usando microscopía confocal. Este método permite visualizar y rastrear el desplazamiento celular en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer a los Dres. Jonathan Reichner y Angle Byrd por su perspicacia en los experimentos con células. El Programa de Becas de Investigación de Posgrado (GRFP) de la Fundación Nacional de Ciencias apoyó este trabajo.

Diseño de molde 1. 3D y Refacciones <ol><li> Molde <ol><li> Antes de trabajar, obtener un kit de elastómero de silicona, una cámara de imágenes de células vivas, un cubreobjetos de vidrio de 22 mm, y un cubo de metal de aluminio mecanizado con dimensiones de 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Prepare la cámara de imágenes de células vivas para el moldeo mediante la colocación de cubreobjetos en el soporte inferior y el montaje del resto de la cámara de la manera indicada por el vendedor. </li><li> A continuación, utilizando unas pinzas, coloque el cubo de metal de aluminio mecanizado en el medio de la vivienda en vivo cámara de imágenes de células y en la parte superior del cubreobjetos, y luego dejar de lado. </li><li> Mezclar las soluciones de elastómero de silicona de acuerdo con el protocolo del fabricante para hacer 5 ml de elastómero. </li><li> Usando una espátula de laboratorio desechable, vierta la solución de elastómero de silicona en la configuración de cámara imágenes de células vivas y garantizar que no se mueva colocado cubo de metal de aluminio mecanizado. Coloque el sistema sobre la mesa del laboratorio, en un lugar seguro O / N para el curado. </li><li> A la mañana siguiente, deconstruirla cámara de imágenes de células vivas, según lo recomendado por el fabricante y sacar del molde utilizando fórceps. Con unas pinzas, extraiga con cuidado el cubo de metal de aluminio mecanizado de molde. Ir al fregadero y enjuague el molde con agua desionizada. Coloque el molde sobre una toalla de papel para secarse. </li><li> Una vez seco, utilizando un cuchillo manía, corte ranuras a través del molde, espaciados 2,34 mm de distancia de cada extremo longitudinal, en el interior del molde de silicona. Asegúrese de que las estancias de molde en un lugar seguro y seco hasta que esté listo para construir el sistema para un experimento. </li></ol></li><li> Hidrófilas e hidrófobas Glass Preparación Cubreobjetos <ol><li> Para permitir que la matriz de colágeno a que se adhieran a una superficie, crear cubreobjetos hidrófilos: <ol><li> Utilizando una pipeta desechable, mida 150 l de 3-aminopropil-trimetoxisilano y se vierte la solución en un tubo de 50 ml. Añadir 30 ml de etanol al 100% al tubo de 50 ml con una segunda pipeta desechable y cierre la tapa. Vortex la solución durante 2 min, asegurando un mezclado completo. Pnuestra solución en una placa de Petri de vidrio y dejar de lado. </li><li> Verter 15 ml de 100% de alcohol etílico en una segunda placa de Petri y dejar de lado (asegúrese de etiquetar los platos). </li><li> Usando una nueva pipeta desechable, mida 30 ml de agua desionizada y se vierte la solución en un tubo de 50 ml. A continuación, utilizando una nueva medida pipeta desechable a cabo 1.875 l de glutaraldehído y se vierte la solución en el mismo tubo de 50 ml y cierre la tapa. Vortex la solución durante 2 min, asegurando un mezclado completo. Vierta la mezcla en tercera placa de Petri, y dejar de lado. </li><li> Con unas pinzas, saca uno 22 mm cubreobjetos de cristal redondo y enjuague ambos lados con 100% de mezcla de etanol con una pipeta desechable. </li><li> Coloque cubreobjetos de vidrio enjuagado en 3-aminopropil-trimetoxisilano con 30 ml de etanol al 100% plato solución y deje reposar en la solución durante 5 minutos. </li><li> Con unas pinzas, sacar cubreobjetos de vidrio y aclarar de nuevo con una solución de etanol al 100% con la pipeta desechable. </li><li> Caída cubreobjetos enjuagados en 1875l de glutaraldehído y 30 ml de la mezcla de agua desionizada y dejar de lado durante 30 minutos. </li><li> Después de 30 minutos, retire cubreobjetos de vidrio con unas pinzas y enjuague con agua desionizada y coloque sobre el tejido seco O / N para secar a temperatura ambiente. </li><li> Inmersión cubreobjetos Repetir y moverse durante tantos cubreobjetos según sea necesario con las mismas soluciones generadas. </li></ol></li><li> Hacer cubreobjetos hidrofóbicos por el protocolo dado. <ol><li> Añadir 500 l de tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, 100 l de ácido acético y 19,4 ml de hexano en un tubo de 50 ml y agitar durante 2 min. Vierta la solución en vidrio placa de Petri y dejar de lado. </li><li> Con unas pinzas limpias, sacar un cubreobjetos de vidrio y colocar en una solución mixta preparada durante 2 min. Transcurridos 2 minutos, sacar cubreobjetos de vidrio con unas pinzas y enjuague con agua desionizada con una pipeta desechable y lugar cubreobjetos sobre el tejido seco O / N para secar a temperatura ambiente. Cubreobjetos tienda en platos de plástico Petri hasta su uso. </li><li> DIPP cubreobjetos Repitación y en movimiento para tantos cubreobjetos según sea necesario con las mismas soluciones generadas. </li></ol></li></ol></li></ol> Asamblea 2. Molde <ol><li> Antes de utilizar moldes, con una pipeta desechable enjuague el molde con un 90% de alcohol etílico en un contenedor para desechos químicos. A continuación, colocar el molde en una placa de Petri llena de agua desionizada y deje reposar O / N. </li><li> Tome el molde de la solución utilizando pinzas y colocar sobre una toalla para secar al aire antes de iniciar el montaje del molde. </li><li> Mientras el molde es de secado al aire, cortar los cubreobjetos hidrófilos cuadrados en dos rectángulos ligeramente mayores que 3,95 mm x 5,99 mm usando una herramienta de diamante-trazado de alta precisión. Deslice cada cubreobjetos corte rectangular en las ranuras cortadas en el molde de silicona. </li><li> Da la vuelta al molde boca abajo y aplicar grasa de vacío a lo largo de la parte inferior del molde de silicona con una pipeta desechable. A continuación, dar la vuelta al molde de vuelta del lado derecho hacia arriba y presione la parte inferior del molde sobre las cubiertas de vidrio hidrofílicos circulareslos labios para crear un sello. </li><li> Con guantes desechables, recoger el molde montado y colocar en un plato desechable Petri y luego en un bio-capucha. Encienda la lámpara de Bio-campana UV durante 1 hora para esterilizar el molde antes de que ocurra la experimentación. </li></ol> 3. El colágeno mezcla y Matrix 3D <ol><li> Antes de preparar la mezcla de colágeno, manchas y preparar células para obtener imágenes de acuerdo con protocolos estándar 28. </li><li> Utilizando técnicas de laboratorio estándar y protocolos de 29,30, en un bio-campana, mezclar los medios de comunicación celulares y quimioatrayente en un tubo de 15 ml a la concentración deseada quimioatrayente. Pipeta 5 ml de solución de concentración quimioatrayente medios celda específica en un tubo de 15 ml y mover la solución en un baño de agua caliente. </li><li> Con una pipeta, extraer 5 ml de medio de células sólo en un segundo tubo de 15 ml y colocar en un baño de agua caliente para calentar la solución para experimentos de microscopía. </li><li> En un bio-hood, pipeta de 30 l de 10x tampón fosfatosolución ed (PBS) en el tubo micro centrífuga. Añadir 6 l de 1 N de hidróxido de sodio (NaOH) en mismo tubo de centrífuga micro y agitar durante 15 seg. </li><li> Obtener colágeno I solución de cola de rata de la nevera y pasar a la bio-campana utilizando técnicas de laboratorio estándar y protocolos 29. Asegúrese de que el colágeno está frío. Pipetear 168,3 l de colágeno en mismo tubo micro centrífuga. </li><li> A continuación, añadir 18 l de color amarillo-verde microesferas modificado carboxilato fluorescentes utilizando una pipeta para el mismo tubo micro centrífuga. Vortex el tubo de centrífuga micro con todas las soluciones para 30 seg. </li><li> Añadir 77,7 l de mezcla de células deseada de células medios de comunicación (aproximadamente 2 x 10 6 células / ml de concentración) en el tubo de micro centrífuga y mezclar usando punta de la pipeta durante 20 s. Según sea necesario, alterar la densidad de la matriz siguiendo la mezcla de colágeno de encargo adaptado para la adición de perlas fluorescentes y mesa de la viabilidad celular (Tabla 1). </li><li> Pipetear 300 &amp; #181; l de mezcla de células de colágeno en el centro bien (bien # 2) del conjunto de molde preparado. Colocar el molde sobre un plato Petri desechable y moverlo en una incubadora estándar durante 20 min a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Retire sistema de incubadora y colocar de nuevo en bio-capucha. Con unas pinzas, retire los dos cubreobjetos hidrofóbicos por apriete sobre la parte superior de cada cubreobjetos y tirando hacia arriba y lejos del molde. </li><li> Mover todo el sistema para la microscopía y la imagen deseada para asegurar lados del molde de colágeno son todavía recto para permitir un gradiente de difusión planar. </li><li> Con el sistema aún bajo el microscopio, usando una 100 l de un solo canal pipeta, añadir 100 l de medio celular en el pocillo # 1. A continuación, utilizando un 100 l de un solo canal pipeta añadir 100 l de los medios de comunicación celular con la concentración deseada en quimioatrayente bien # 3. </li><li> Inmediatamente después de la adición de soluciones en ambos pozos, comenzar de imágenes. </li></ol> 4. Imagen y DifusiónModelado <ol><li> Si uno quiere encontrar el coeficiente de difusión para la densidad de colágeno específico para calcular la concentración específica, siga el protocolo a continuación: <ol><li> Siga el protocolo dado anteriormente titulado &quot;Mezcla Colágeno y Matrix 3D&quot;, en lugar de generar medios de comunicación celular con la concentración quimioatrayente deseada, haga rodamina 5 M en un tubo de 15 ml utilizando cálculos y protocolos 30 estándar. </li><li> Image las matrices de colágeno 3D con un sistema confocal montados en un microscopio invertido usando un láser de argón (488 nm) para capturar la fluorescencia. Imagen cada 2 o 3 segundos para un máximo de 7 horas. </li></ol></li><li> Para Modelado Difusión: Usando el modelo matemático se muestra a continuación, escribir un código de software computacional para el procesamiento y análisis con estos pasos generales. <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol><li> Importación de imágenes en el software computacional para cambio de escala y la normalización de la inten máximosidad. Convertir imágenes a un color gris-mapa de la imagen para seleccionar el borde. Recogida de un eje a lo largo del centro de la imagen, a la derecha del centro y a la izquierda del centro. </li><li> Utilizando el código de software computacional, trazar la intensidad normalizada, junto con la verdadera intensidad y la diferencia entre los dos. </li><li> A continuación, introducir los parámetros necesarios para el montaje (concentración, tiempo y longitud). </li><li> Trazar la concentración normalizada frente al tiempo y el perfil de concentración a través del eje x con un ajuste polinómico a los datos. </li><li> Calcular el coeficiente de difusión utilizando el código de software computacional. </li></ol></li></ol> 5. Las mediciones experimentales <ol><li> Haciendo referencia de nuevo a la ecuación de difusión, reescribir la ecuación para hallar la concentración específica en cualquier ubicación dentro del sistema como se muestra a continuación. <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> Dónde: L = Longitud del XXmatriz de colágeno e x = ubicación bajo investigación D = coeficiente de difusión t = tiempo transcurrido </li><li> Durante los experimentos de quimiotaxis, garantizar para registrar el tiempo específico que el momento de quimioquinas fue añadido al sistema. Una vez detectado el movimiento de la migración celular, asegúrese de grabar la grabación de lapso de tiempo confocal, y tenga en cuenta la hora y lugar de la orilla donde se produjo la imagen. </li><li> Durante el análisis de datos, conecte el observado transcurrido el tiempo, la ubicación y el coeficiente de difusión para la célula específica en la ecuación para encontrar la concentración específico normalizado en cualquier punto dentro del colágeno tanto para la difusión y experimentos celulares. </li></ol> 6. Seguimiento de la migración de células Utilizando TFM <ol><li> Para el seguimiento de la migración de células usando técnicas de TFM / DVC siguen el protocolo a continuación: <ol><li> Después de la adición de la concentración deseada en quimioatrayente bien # 3, comience imágenes de las matrices de colágeno en 3D con un sistema confocal montado en un micr invertidaoscope para encontrar una celda para investigar. </li><li> Una vez que se encuentra una célula en movimiento, colocar la célula en el medio del campo de vista y utilizar un motor piezoeléctrico (a la imagen en el eje z), imagen cada 1 o 2 min. </li><li> Para el cálculo de generación de la fuerza y la deformación celular, generar un código computacional para encontrar los desplazamientos de los granos de fluorescencia siguiendo los protocolos TFM / DVC 31. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Adzick, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+and+Cellular+Biology+of+Wound+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair.</a> Ann Surg. 225 (2), 236(1997).</li>
<li>Reddi, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+an+unconventional+approach+to+isolation+of+first+mammalian+morphogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+F.+R%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens.</a> Cytokine Growth F. R. 8 (1), 11-20 (1997).</li>
<li>Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cancer.</a> Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).</li>
<li>Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+effect+of+chemotaxis+on+glioblastoma+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression.</a> AIChE J. 57 (3), 778-792 (2011).</li>
<li>Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gradient+sensing%3A+towards+building+predictive+models+of+chemotaxis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 284-291 (2012).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Cristini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+Instability+and+Cancer+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Morphologic Instability and Cancer Invasion.</a> Clin. Cancer Res. 11 (19), 6772-6779 (2005).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell%27s+sense+of+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell's sense of direction.</a> Science. 284 (5415), 765-770 (1999).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+under+agarose%3A+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li>
<li>Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+controlled+molecular+gradients+in+3D+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generating controlled molecular gradients in 3D gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 91 (6), 754-759 (2005).</li>
<li>Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor-induced+cell+motility+in+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Growth factor-induced cell motility in tumor invasion.</a> Acta Oncol. 41 (2), 124-130 (2002).</li>
<li>Wilkinson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+leukocyte+locomotion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 216 (1-2), 139-153 (1998).</li>
<li>Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multichamber+fluidic+device+for+3D+cultures+under+interstitial+flow+with+live+imaging%3A+development%2C+characterization%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (5), 982-991 (2010).</li>
<li>Noo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20 (8), 826-830 (2002).</li>
<li>Shao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab Chip. 9 (21), 3118-3125 (2009).</li>
<li>Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+agarose-based+microfluidic+platform+with+a+gradient+buffer+for+3D+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies.</a> Biomed. Microdevices. 11 (4), 827-835 (2009).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat. Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Sixt, M., Lammermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+chemotactic+leukocyte+migration+in+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments.</a> Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J. Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell. Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).</li>
<li>Gilbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+diffusion+through+collagen+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Macromolecular diffusion through collagen membranes.</a> Int. J. Pharm. 47 (1-3), 79-88 (1988).</li>
<li>Ramanujan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+convection+in+collagen+gels%3A+implications+for+transport+in+the+tumor+interstitium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium.</a> Biophys. J. 83 (3), 1650-1660 (2002).</li>
<li>Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusivity+of+125I-calmodulin+through+collagen+membranes%3A+effect+of+source+concentration+and+membrane+swelling+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio.</a> Biomaterials. 7 (4), 263-267 (1986).</li>
<li>Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+modifications+of+collagen+gels%3A+impact+on+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion.</a> Biopolymers. 89 (2), 135-143 (2008).</li>
<li>Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-stimulated+chemotaxis+of+human+neutrophils+in+a+3-D+conjoined+fibrin+gel+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay.</a> J. Immunol. Methods. 180 (2), 193-211 (1995).</li>
<li>Sundd, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+paxillin+in+rolling+neutrophils+by+dual-color+quantitative+dynamic+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting.</a> Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Volume+Transfers+with+Serological+Pipettes+and+Micropipettors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors.</a> J. Vis. Exp. (63), 2754(2012).</li>
<li>Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. , Elsevier Science. (2010).</li>
<li>Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fast+Iterative+Digital+Volume+Correlation+Algorithm+for+Large+Deformations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mech%22%5BJournal%5D)">A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations.</a> Exp. Mech. In press, (2014).</li>
<li>Shenoy, V., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Macromolecules+in+Collagen+and+Hyaluronic+Acid%2C+Rigid-Rod-Flexible+Polymer+Composite+Matrixes%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes.</a> Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).</li>
<li>Leddy, H., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Molecular+Diffusion+in+Articular+Cartilage+Measured+using+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los pasos más críticos para experimentos de difusión de éxito con o sin células son: establecer correctamente el conjunto de molde; el desarrollo de la destreza manual necesaria para evitar daños durante la extracción de cubreobjetos hidrófobos; asegurando que encontrar una muy buena línea de salida lineal para calcular correctamente el coeficiente de difusión; corregir los cálculos experimentales de colágeno y quimioatrayente; utilizar correctamente el sistema de imágenes de células vivas para asegurar la matriz no se ...

El movimiento preferido de las células hacia un gradiente de concentración, conocido como quimiotaxis, juega un papel importante en los procesos patológicos y fisiológicos en el cuerpo. Tales ejemplos son la piel y la mucosa cicatrización de la herida 1, 2 morfogénesis, la inflamación 3, y 4,5 el crecimiento del tumor. También se ha demostrado que las células cancerosas pueden migrar a través de ambas estrategias individuales y colectivas a la migración celular 6. Además, los mecanismos de inestabilidad difusionales pueden inducir la separación de células individuales o agrupados a partir de un cuerpo / objeto tumoral y luego puede emigrar hacia una fuente de nutrientes y por lo tanto invadir áreas 7 y tejidos más amplios. Además, se ha demostrado que diversos mecanismos de migración pueden ser activos en 2D y en 3D, debido a las diferentes funciones de las moléculas de adhesión 8. Por lo tanto, un movimiento para fisiológicamente relevante en ensayos in vitro para investigar la motilidad celular en un measureabley manera simple es de importancia en la comprensión de los fenómenos movimiento celular 9. Desafortunadamente, la dificultad en el análisis de la migración celular, un ensayo de quimiotaxis integral cuantificable por lo general requiere un método laborioso de largo, fundada en la medición de los modelos de la motilidad celular y los fenómenos de transporte imparciales. Enfoques experimentales anteriores para investigar la quimiotaxis de células incluyen la cámara de Boyden 10 y el que se ensaya agarosa 11. Sin embargo, dentro de estos primeros ensayos, los experimentos de migración celular no controlan el movimiento con respecto al tiempo. Más, importante, los gradientes de concentración utilizados para los experimentos fueron bien definidos o no completamente entendidas, mientras que sólo el mantenimiento de la señalización por no más de unas pocas horas. Por otra parte, los intentos de la cámara de quimiotaxis temprana restringen la migración de células de dos dimensiones y no permitieron una para supervisar la cinética de la migración 12. En cuanto a la cámara de Boyden, un ensayo de punto finalno permitiría al investigador para observar la migración visualmente y no podía diferenciar directamente quimiotaxis (movimiento direccional) de chemokinesis (movimiento aleatorio). Además, varias variables diferencias en el tamaño de poro y el grosor de las membranas hechos a la cámara muy difícil de reproducir fácilmente y ocultan la reacción migrante de las células a quimiocinas 13,14. Con la nueva comprensión de la microfluídica, nuevas cámaras y micro-dispositivos se han investigado como un instrumento para investigar la locomoción celular bajo condiciones de flujo intersticiales o quimiotaxis 15,16. Bajo estos nuevos dispositivos, nuevas métricas de células se introdujeron e investigados, como el efecto del esfuerzo cortante en un celular 17,18. Desafortunadamente, las cámaras de quimiotaxis de microfluidos pasadas y actuales limitan estudios de la migración de células a los sustratos-2D un retroceso importante ya que muchos procesos biológicos, incluyendo la invasión celular tumoral y la metástasis, y immigración celular inmune, implica la migración 3D. -Cámaras donde una solución quimioatrayente está en contacto con un gel que contiene células 3D también han sido reportados también observación directa 19,20. Estas cámaras tienen dos compartimentos, uno que contiene un quimioatrayente y uno que contiene células, se unió al lado de uno otro horizontalmente 21 o como anillos concéntricos 22. Estos sistemas se apuntaban en la dirección correcta, pero no mantienen un sistema de quimiotaxis por un período prolongado de tiempo. Además, los investigadores también han examinado la difusividad a través de membranas de colágeno en las células de diálisis, así como la difusión de moléculas trazadoras a través de muestras de colágeno sometido a la presión hidrostática 23-25. Algunos experimentos de difusión en geles de colágeno se basan en modificaciones físicas y químicas del gel utilizando campos magnéticos y la incorporación química 26. Un método popular para modelar difusividad en collatejidos indíge- se basa en la imagen de fluorescencia de fotoblanqueo punto continuo. Este método ha revelado anisotropía en los coeficientes de difusión de macromoléculas en tejidos de colágeno orientadas. Sin embargo, photobleaching se ha utilizado en el cartílago articular y no colágeno matrices. Aunque similares, los experimentos de modelización necesarias deben ser realizadas a través de la comprensión específicamente el coeficiente de difusión de los geles de colágeno. Más importante aún, los sistemas no utilizan un método para medir la generación de fuerza de la célula. Desafortunadamente, la mayoría de los sistemas parecen faltar uno o dos elementos clave para un sistema ideal: la que permite el seguimiento de la célula, una comprensión gradiente de difusión con un factor quimiotáctico través de la matriz, relativamente sencilla configuración con una facilidad de la reproducibilidad, la minimización de interacciones célula-célula, y la capacidad de medir unidades dimensionales para la cuantificación (es decir, velocidad, fuerza, concentración específica). Moghe et al. </em&gt; 27 propuso un sistema que cumple la mayoría de estos requisitos en el que las células se dispersan inicialmente en todo el gel en lugar de concentrados en la superficie del filtro, pero era difícil de medir las fuerzas que la célula genera. Para este propósito, se presenta un sistema de difusión de gradiente plana para investigar la quimiotaxis en una matriz de colágeno en 3D, lo que permite superar las limitaciones modernas cámara de difusión de los ensayos existentes, que se basa en la microscopía de lapso de tiempo, junto con las técnicas de análisis de imagen para medir celular fuerzas en un entorno 3D. Este protocolo proporciona una manera simple, pero innovadora de la creación de una cámara de difusión 3D simple que se puede utilizar para investigar la quimiotaxis 3D en diferentes células.

<table><tbody><tr><td>Kit de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning Corp</td><td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td><td>una mistura de dos partes con una mezcla 10:1</td></tr><tr><td>Cámara de imagen de células vivas</td><td>Instrumento de célula viva</td><td>CM-B18-1</td><td>CMB para 18&nbsp; cubreobjetos redondos mm</td></tr><tr><td>22&nbsp; mm Cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific NC0180281</td><td></td><td>Neuvitro Corp. cubreobjetos 22&nbsp; mm 1.5</td></tr><tr>Cubo <td></td><td></td><td></td>metálico<td>de aluminio mecanizado</td></tr><tr><td>Navaja multiusos Hobby</td><td>X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>3-(aminopropil) trimetoxisilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00216A-10</td><td>Glutaraldehído, grado EM, 8%</td></tr><tr><td>Tubo de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Piso estándar modelo y centrífugas de mesa</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A Placas de</td><td>Petri reutilizables: Completas (60 x 15&nbsp; mm)</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td>Pinzas de punta fina</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-105A</td><td>Rectángulo; 30 x 22&nbsp; milímetro; Espesor Nº 1</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctilo</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Ácido acético Reactivo ACS, &ge; 99.7%</td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td>anhidro, 95%</td></tr><tr><td>Alcohol etílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 pruebas, para biología molecular</td></tr><tr><td>Herramienta de trazado de diamante de alta precisión</td><td>Lunzer</td><td>PV-081-3</td><td>Trazador de punta extendida recta, .020" (.50&nbsp; mm) de diámetro por .200" (5.0&nbsp; mm) longitud de la punta</td></tr><tr><td>Grasa de vacío</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5C</td><td>Grasa de alto vacío</td></tr><tr><td>Tubo de 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml con superficie hidrofóbica biológicamente inerte</td></tr><tr><td>10x solución tamponada de fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td>1,37 m de cloruro de sodio, 0,027 m de cloruro de potasio y 0,119 m de tampón de fosfato</td></tr><tr><td>1&nbsp; N hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38215</td><td>Concentrado de hidróxido de sodio</td></tr><tr><td>Colágeno I, cola de rata</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>Cola de rata&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-332</td><td>Volumen: 2,0 ml; O.D. x L: 13&nbsp; x&nbsp; 40&nbsp; milímetro; estéril; envoltura</td></tr><tr> simple<td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Microesferas modificadas con carboxilato</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; F-8813</td><td>Microesferas modificadas con carboxilato, 0,5 y micro; m, fluorescente amarillo-verde (505/515), 2% de sólidos</td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689</td><td>Rhodamine B para fluorescencia</td></tr></tbody></table>

planar sistema de difusión de degradado para investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3d

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

La importancia de la migración celular se puede ver a través del desarrollo de la vida humana. Cuando las células migran, generan fuerzas y transfieren estas fuerzas a su área circundante, lo que lleva al movimiento y la migración de las células. Para comprender los mecanismos que pueden alterar y/o afectar la migración celular, se pueden estudiar estas fuerzas. En teoría, la comprensión de los mecanismos y fuerzas fundamentales que subyacen a la migración celular promete enfoques efectivos para tratar enfermedades y promover el trasplante celular. Desafortunadamente, las cámaras de quimiotaxis modernas que se han desarrollado generalmente están restringidas a dos dimensiones (2D) y tienen gradientes de difusión complejos que hacen que el experimento sea difícil de interpretar. Con este fin, hemos desarrollado, y describimos en este artículo, una cámara de visión directa para estudios de quimiotaxis, que permite superar los obstáculos modernos de las cámaras de quimiotaxis capaces de medir las fuerzas celulares y la concentración específica dentro de la cámara en un entorno 3D para estudiar la migración celular 3D. Más convincente, este enfoque permite modelar con éxito la difusión a través de matrices de colágeno en 3D y calcular el coeficiente de difusión de un quimioatrayente a través de múltiples concentraciones diferentes de colágeno, al tiempo que mantiene el sistema simple y fácil de usar para el análisis de microscopía de fuerza de tracción (TFM) y correlación de volumen digital (DVC).

La capacidad de este ensayo para evaluar con precisión la migración de la célula depende de una buena configuración del sistema. Por lo tanto, es fundamental para el maquillaje asegúrese de diseñar el molde sistema de difusión precisa y tener mucho cuidado en la colocación de cubreobjetos tanto hidrofóbicos e hidrofílicos, como se ilustra en la Figura 1. Si el sistema está diseñado correctamente y durante la etapa de modelado asegurando la difusión de encontrar una muy buena línea de salida lineal, uno ...

La migración celular es una parte importante del desarrollo humano y de la vida. Con el fin de comprender los mecanismos que pueden alterar la migración celular, presentamos un sistema de difusión de gradiente planar para investigar la quimiotaxis en una matriz de colágeno en 3D, lo que permite superar las limitaciones de la cámara de difusión moderna de los ensayos existentes.

Planar Sistema de Difusión de degradado para Investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

El objetivo general de este procedimiento es crear una cámara de difusión con gradiente plano para investigar quimiotaxis en una matriz tridimensional de colágeno. Esto se logra primero fabricando un molde de silicona 3D utilizando una cámara para imágenes de células vivas. El segundo paso consiste en preparar cubreobjetos hidrófilos e hidrófobos y utilizarlos para armar el molde de silicona 3D.A continuación, se añade la mezcla de células y colágeno al compartimento central y se deja polimerizar. El último paso consiste en retirar las cubiertas hidrófobas del molde tras la incubación y añadir medio simple a un reservorio y medio con quimioatractante al otro reservorio. Finalmente, se utiliza microscopía confocal para rastrear la quimiotaxis celular a lo largo del tiempo y visualizar el desplazamiento del movimiento celular dentro de la matriz de colágeno.La principal ventaja de esta técnica frente a técnicas existentes como la cámara de Boyden y la microdiálisis, es que permite un montaje sencillo para investigar la migración en un espacio tridimensional con un gradiente de difusión simple, sin utilizar una pipeta desechable. Mida 150 microlitros de la amino selina A-P-T-M-S y viértalos en un tubo de 50 mililitros. A continuación, añada 30 mililitros de etanol al 100 % al tubo con una segunda pipeta desechable, y cierre la tapa.Vortex la solución durante dos minutos para asegurar una mezcla completa. Luego, vierta la solución en una placa de Petri de vidrio y déjela a un lado. A continuación, vierta 15 mililitros de alcohol etílico al 100 % en una segunda placa de Petri y colóquela junto con la primera placa utilizando una pipeta desechable nueva.Mida 30 mililitros de agua desionizada y vierta la solución en un tubo de 50 mililitros. A continuación, utilice una pipeta desechable nueva para añadir 1,875 mililitros de glu aldehído al tubo y cierre la tapa. Agite la solución en vórtex durante dos minutos y luego vierta la mezcla en una tercera placa de Petri.Con unas pinzas, retire un cubreobjetos redondo de vidrio de 22 milímetros y enjuague ambas caras con una mezcla de etanol al 100 %. Mediante una pipeta desechable, coloque el cubreobjetos enjuagado en el primer recipiente que contiene silano amino y déjelo sumergido en la solución durante cinco minutos, utilizando las pinzas. Saque el cubreobjetos y enjuáguelo nuevamente con etanol al 100 %.Luego, coloque el portaobjetos de vidrio enjuagado en el recipiente con glutaraldehído y déjelo reposar durante 30 minutos. Pasados los 30 minutos, retire el portaobjetos de vidrio con pinzas y enjuáguelo con agua desionizada. Coloque el portaobjetos enjuagado sobre un papel de absorción para que seque durante la noche a temperatura ambiente.Para preparar cubreobjetos hidrofóbicos, primero agregue 500 microlitros de TTS, 100 microlitros de ácido acético y 19,4 mililitros de heptano en un tubo de 50 mililitros y mezcle mediante vortex durante dos minutos. Luego vierta la solución en una placa de Petri de vidrio y use pinzas limpias para colocar un cubreobjetos de vidrio en la solución preparada y déjelo durante dos minutos. Pasados los dos minutos, retire el cubreobjetos con las pinzas y enjuáguelo con agua desionizada utilizando una pipeta desechable, coloque el cubreobjetos sobre un papel absorbente y deje que se seque a temperatura ambiente durante la noche.Guarde los portaobjetos secos en un plato de Petri de plástico hasta que sean necesarios para comenzar. Arme la cámara de imagenología de células vivas según se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, mezcle las soluciones de elastómero de silicona según las instrucciones del fabricante para preparar cinco mililitros de elastómero. Luego, utilice una espátula desechable para verter lentamente la solución de elastómero de silicona en el montaje de la cámara de imagenología de células vivas, sin perturbar los componentes del molde.Coloque el molde en un lugar seguro para mantenerlo a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, retire el molde con pinzas y extraiga cuidadosamente el cubo de aluminio mecanizado del molde. A continuación, vaya al fregadero y enjuague el molde con agua desionizada, luego coloque el molde sobre una toalla de papel para que se seque.Una vez seco, utilice un cúter de manualidades para cortar ranuras espaciadas 2.34 milímetros entre sí desde cada extremo longitudinal dentro del molde de silicona. Asegúrese de mantener el molde en un lugar seguro y seco hasta su uso, antes del experimento. Enjuague el molde con etanol al 90% y colóquelo en una placa de Petri llena con agua desionizada para que repose durante la noche.A la mañana siguiente, transfiera el molde a una toalla de papel y deje que se seque al aire mientras el molde se seca. Utilice una herramienta de corte de diamante de alta precisión para cortar el cuadrado. Divida las laminillas hidrófilas en dos rectángulos, ligeramente más grandes que 3,95 milímetros por 5,99 milímetros.Luego, deslice cada uno de los portaobjetos rectangulares cortados en las ranuras talladas en el molde de silicona, dé la vuelta al molde boca abajo y aplique grasa de vacío a lo largo de la parte inferior del molde de silicona utilizando una pipeta desechable. A continuación, gire nuevamente el molde derecho y presione la parte inferior del molde sobre el portaobjetos circular de vidrio hidrofílico. Para crear un sello, prepare una mezcla de medio y quimioatractante en un tubo de 15 mililitros a la concentración deseada, pipete cinco mililitros de la mezcla en un tubo nuevo de mililitro y cinco mililitros de medio simple en un segundo tubo.Coloque ambos tubos en un baño de agua calentado a 37 grados Celsius. A continuación, pipete 30 microlitros de 10 XPBS en un tubo de microcentrífuga. Añada seis microlitros de una solución de hidróxido de sodio 1 N al mismo tubo de microcentrífuga y mezcle mediante vortex durante 15 segundos.Luego, agregue 18 microlitros de microesferas carboxiladas modificadas fluorescentes verde amarillo a un tubo de microcentrífuga y 168,3 microlitros de colágeno de cola de rata tipo uno frío con hielo. Vortexee la mezcla durante 30 segundos.A continuación, agregue 77,7 microlitros del tipo celular deseado a una concentración de dos veces 10 a la seis células por mililitro en medio, en el tubo de microcentrífuga y mezcle. Con una punta de pipeta, transfiera 300 microlitros de la mezcla de colágeno y células al pozo central del ensamblaje de molde preparado durante 20 segundos.Luego, coloque el molde sobre una placa de Petri desechable y colóquelo en un incubador estándar durante 20 minutos a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Después del período de incubación, use pinzas para retirar ambos cubreobjetos hidrófobos sujetando la parte superior de cada cubreobjeto y luego tirando hacia arriba y alejándolos del molde. Mueva todo el sistema al microscopio y examine la cámara para asegurarse de que los lados del molde de colágeno sigan siendo rectos, permitiendo así un gradiente de difusión plano con el sistema aún bajo el microscopio. Añada 100 microlitros de medio celular en el primer pocillo.A continuación, agregue 100 microlitros de medio celular con la concentración deseada de quimioatractivo en el pocillo del otro lado de la matriz. Siga la migración celular con respecto a las microesferas marcadas con fluorescencia según se describe en el protocolo de texto adjunto. La serie de imágenes presentadas aquí muestra la difusión de rumina a través de un gel de colágeno de un miligramo por mililitro.Este ejemplo muestra el gradiente verdadero de difusión planar del sistema, que también puede esperarse de cualquier quimioatractivo introducido. En el ejemplo mostrado aquí, la intensidad de la señal rumina se midió a lo largo del tiempo en las ubicaciones identificadas por los cuadrados rojos. La concentración en cada una de estas ubicaciones se muestra en esta gráfica como una línea separada, que, cuando se mide en estado estacionario, produce un gradiente de concentración lineal basado en la posición en el gel.Esta relación permanece lineal en un rango de concentraciones de matriz de colágeno, lo que hace que este sistema sea muy útil para experimentos con células. En esta imagen, se muestra un neutrófilo coloreado en rojo dentro de una matriz de colágeno dispersa con microesferas fluorescentes verdes que se utilizan como referencias de posición. Las siguientes tres imágenes muestran la migración dirigida del neutrófilo mientras se desplaza hacia arriba de un gradiente de quimioatractivo, que se representa mediante la flecha blanca.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear una cámara de difusión sencilla para investigar la migración celular en una matriz tridimensional de colágeno.

planar-gradient-diffusion-system-to-investigate-chemotaxis-3d

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un método para el montaje de gradientes adhesivas y soluble en una cámara de microscopía para estudios en vivo de células de migración se describe. El entorno de ingeniería combina superficies antiincrustantes y pistas adhesivas con gradientes de solución y por lo tanto permite determinar la importancia relativa de las señales de orientación.

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

La migración celular es un fenómeno biológico que está involucrada en una gran cantidad de fisiológicos, tales como la curación de heridas y las respuestas inmunitarias, y los procesos fisiopatológicos, como el cáncer. El ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es una herramienta versátil para analizar las propiedades migratorias de diferentes tipos de células dentro de un entorno fisiológico-como 3D.

Análisis de la migración de células dentro de una matriz de colágeno tridimensional

Las propiedades mecánicas y la microestructura de la matriz extracelular afectan fuertemente a la migración de las células 3D. Un método in vitro para estudiar el comportamiento de la migración celular espaciotemporal en entornos biofísico variables, tanto a la población y los niveles de células individuales, se describe.

Gel System Concentric para estudiar el papel de Biofísica de Matrix Microambiente en la migración de células en 3D

El colágeno es un componente central de la ECM, y proporciona indicaciones esenciales para varios procesos celulares que van desde la migración a la diferenciación y la proliferación. Aquí se incluye es un protocolo para la incorporación de las células dentro de los hidrogeles de colágeno en 3D, y una técnica más avanzada para la generación de matrices de colágeno aleatorios o alineados utilizando PDMS microcanales.

Preparación de geles de colágeno en 3D y microcanales para el estudio de las interacciones 3D<em&gt; En Vivo</em

ensayos de quimiotaxis visuales son esenciales para una mejor comprensión de cómo las células eucariotas controlar la migración de células direccional quimioatrayente mediada. A continuación, se describen los métodos detallados para: 1) en tiempo real, monitoreo de alta resolución de múltiples ensayos de quimiotaxis, y 2) visualizar simultáneamente el gradiente quimioatrayente y la dinámica espacio-temporal de los acontecimientos en las células HL60 neutrófilos como señalización.

Imaging G acoplados a proteínas mediada por el receptor de quimiotaxis y sus eventos de señalización en células HL60 neutrófilos como

Este artículo proporciona el método detallado de realizar un ensayo rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando el aislamiento de neutrófilos a bordo de la sangre entera y la prueba de quimiotaxis en un único chip microfluídico.

Un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre

Este protocolo describe un ensayo de invasión vertical invertido que podría ser utilizado para cuantificar la capacidad de migración y la invasión de las células en un entorno tridimensional conservando el microambiente celular. Este ensayo es adecuado para las células raras o sensibles.

Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

Describimos un método para construir dispositivos para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares. Este dispositivo permite el análisis de las respuestas celulares a señales solubles en microambientes 3D con degradados de quimioattractant definidos. Los organoides son mejores que las células individuales en la detección de entradas ruidosas débiles.

Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant

Aquí, proporcionamos un método para analizar el comportamiento del crecimiento de axons en matrices 3D, imitando su desarrollo natural.

Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso

La migración celular colectiva en el desarrollo, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer a menudo se guía por los gradientes de los factores de crecimiento o moléculas de señalización. Aquí se describe un sistema experimental que combina la microscopía de tracción con un sistema microfluídico y una demostración de cómo cuantificar la mecánica de la migración colectiva bajo gradiente bioquímico.

Microscopía de tracción integrada con microfluídicos para la migración colectiva quimiotáctica

Aquí describimos métodos que utilizan la microscopía de lapso de tiempo y contraste de fase para crear imágenes de macrófagos peritoneales residentes del ratón en un complemento quimiotáctico gradiente C5a. Los protocolos se pueden extender a otras células inmunitarias.

Imágenes de lapso de tiempo de Macrófago de ratón Chemotaxis

Aprende a crear una cámara de difusión planar para investigar quimiotaxis en matrices de colágeno 3D usando microscopía confocal. Este método permite visualizar y rastrear el desplazamiento celular en tiempo real.

Planar Sistema de Difusión de degradado para Investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3D

Explorar más videos