Planar Sistema de Difusión de degradado para Investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3D

El objetivo general de este procedimiento es crear una cámara de difusión de gradiente cepilladora para investigar los impuestos de la quimioterapia en una matriz de colágeno en 3D. Esto se logra fabricando primero un molde de silicona 3D con el uso de una cámara de imágenes de células vivas. El segundo paso es hacer cubreobjetos hidrófilos e hidrofóbicos y usarlos para ensamblar el molde de silicona 3D.

A continuación, la mezcla de células de colágeno se añade al compartimento central y se deja polimerizar. El paso final es quitar los deslizamientos de la cubierta hidrofóbica del molde después de la incubación y agregar medios simples a un depósito y medios con atrayente de quimioterapia al otro depósito. En última instancia, la microscopía confocal se utiliza para rastrear la quimiotaxis celular a lo largo del tiempo y visualizar el desplazamiento del movimiento celular dentro de la matriz de colágeno.

La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes como la cámara de boin y el micro atletismo, es que permite una configuración sencilla para investigar la migración en el espacio 3D con un gradiente de difusión simple, sin necesidad de utilizar una pipeta desechable. Mide 150 microlitros de amino selina A-P-T-M-S y viértelo en un tubo de 50 mililitros. A continuación, añada 30 mililitros de etanol al 100% al tubo con una segunda pipeta desechable y cierre la tapa.

Agite la solución durante dos minutos para asegurar una mezcla completa. A continuación, vierta la solución en una placa de Petri de vidrio y déjela a un lado. A continuación, vierta 15 mililitros de alcohol 100% etílico en una segunda placa de Petri y colóquela con la primera placa utilizando una nueva pipeta desechable.

Mide 30 mililitros de agua desionizada y vierte la solución en un tubo de 50 mililitros. A continuación, utilice una nueva pipeta desechable para añadir 1.875 mililitros de aldehído pegamento al tubo y cierre la tapa. Agite la solución durante dos minutos y luego vierta la mezcla en una tercera placa de Petri.

Con unas pinzas, saque 1 cubreobjetos de vidrio redondo de 22 milímetros y enjuague ambos lados con la mezcla de etanol al 100%. Con una pipeta desechable, coloque la tapa del vidrio de enjuague en el primer plato que contenga aminoselina y déjela reposar en la solución durante cinco minutos con pinzas. Saque el engobe de la cubierta de vidrio y enjuáguelo nuevamente con etanol 100%.

A continuación, deje caer la tapa de vidrio enjuagada en el plato con glutaraldehído y déjelo a un lado durante 30 minutos. Después de 30 minutos, retire el cubreobjetos de vidrio con pinzas y enjuáguelo con agua desionizada. Coloque el cubreobjetos enjuagado sobre un pañuelo para que se seque durante la noche a temperatura ambiente.

Para preparar cubreobjetos hidrofóbicos, primero agregue 500 microlitros de TTS, 100 microlitros de ácido acético y 19,4 mililitros de heane en un tubo de 50 mililitros y vórtelo durante dos minutos. A continuación, vierta la solución en una placa de Petri de vidrio y use pinzas limpias para dejar caer una cubierta de vidrio en la solución preparada y déjela allí durante dos minutos. Después de dos minutos, saque el cubreobjetos de vidrio con pinzas y enjuáguelo con agua desionizada con una pipeta desechable, coloque el cubreobjetos sobre un pañuelo de papel y déjelo secar a temperatura ambiente durante la noche.

Guarde los cubreobjetos secos en una placa de Petri de plástico hasta que los necesite para comenzar, ensamble la cámara de imágenes de células vivas como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, mezcle las soluciones de elastómero de silicona de acuerdo con las instrucciones del fabricante para hacer cinco mililitros de elastómero. A continuación, utilice una espátula de laboratorio desechable para verter lentamente la solución de elastómero de silicona en la configuración de la cámara de imágenes de células vivas para no alterar los componentes del molde.

Deje el molde a un lado en un lugar seguro para seleccionar la temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, saque el molde con pinzas y extraiga con cuidado el cubo de metal de aluminio mecanizado del molde. A continuación, vaya al fregadero y enjuague el molde con agua desionizada, y luego coloque el molde sobre una toalla de papel para que se seque.

Una vez seco, use un cuchillo multiusos para pasatiempos para cortar ranuras separadas por 2,34 milímetros de cada extremo longitudinal dentro del molde de silicona. Asegúrese de que el molde permanezca en un lugar seguro y seco hasta que lo necesite para el experimento antes de usarlo. Enjuague el molde con etanol al 90% y coloque el molde en una placa de Petri llena de agua desionizada para que se asiente durante la noche.

A la mañana siguiente, transfiere el molde a una toalla de papel y deja que se seque al aire mientras se seca. Utilice una herramienta de trazado de diamantes de alta precisión para cortar el cuadrado. La cubierta hidrofílica se desliza en dos rectángulos, ligeramente más grandes que 3,95 milímetros por 5,99 milímetros.

A continuación, deslice cada uno de los deslizamientos de la cubierta del rectángulo cortado en las ranuras, corte el molde de silicona, voltee el molde al revés y aplique grasa al vacío a lo largo de la parte inferior del molde de silicona con una pipeta desechable. A continuación, voltee el molde hacia atrás con el lado derecho hacia arriba y presione la parte inferior del molde sobre el cubreobjetos circulares de vidrio hidrófilo. Para crear un sello, prepare una mezcla de medio y atrayente de quimioterapia en un tubo de 15 mililitros a la concentración deseada, pipetee cinco mililitros de la mezcla en un nuevo tubo de mililitros y cinco mililitros de medio simple en un segundo tubo.

Coloque ambos tubos en un baño de agua calentado a 37 grados centígrados. A continuación, pipetee 30 microlitros de 10 XPBS en un tubo de microcentrífuga. Agregue seis microlitros de una solución normal de hidróxido de sodio en el mismo tubo de microcentrífuga y vórtice durante 15 segundos.

A continuación, añada 18 microlitros de carboxilato fluorescente verde amarillo, microesferas modificadas a un tubo de microcentrífuga y 168,3 microlitros de hielo frío. Colágeno de cola de rata tipo uno. Agita la mezcla durante 30 segundos.

A continuación, añade 77,7 microlitros de la pila deseada. Escriba a dos veces 10 a las seis celdas por mililitro en el medio al tubo de micro centrífuga y mezcle. Con la punta de una pipeta durante 20 segundos, pipetee 300 microlitros de la mezcla de células de colágeno en el pocillo central del conjunto de molde preparado.

Luego coloque el molde en una placa de Petri desechable y muévalo a una incubadora estándar durante 20 minutos a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono Después del período de incubación, use pinzas para quitar ambos cubreobjetos hidrofóbicos sujetándolos a la parte superior de cada cubreobjetos y luego tirando hacia arriba y lejos del molde. Mueva todo el sistema al microscopio y examine la cámara para asegurarse de que los lados del molde de colágeno aún estén rectos, lo que permite un gradiente de difusión del cepillo con un sistema aún bajo el microscopio. Agregue 100 microlitros de medio celular en el primer pocillo.

A continuación, agregue 100 microlitros de medio celular con la concentración deseada de quimioatrayente en el pocillo del otro lado de la matriz. Realice un seguimiento de la migración celular en referencia a las microesferas marcadas con fluorescencia, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. La serie de imágenes presentadas aquí muestra la difusión del rumine moviéndose a través de un gel de colágeno de un miligramo por mililitro.

Este ejemplo muestra el verdadero gradiente de difusión plana del sistema, que también se puede esperar de cualquier atrayente de quimioterapia introducido. En el ejemplo que se muestra aquí, la intensidad de la señal ruminal se midió a lo largo del tiempo en las ubicaciones identificadas por los cuadrados rojos. La concentración en cada una de estas ubicaciones se muestra en este gráfico como una línea separada, que cuando se mide en estado estacionario, produce un gradiente de concentración lineal basado en la posición en el gel.

Esta relación permanece lineal en un rango de concentraciones de matriz de colágeno, lo que hace que este sistema sea muy útil para experimentos con células. En esta imagen, se muestra un neutrófilo de color rojo dentro de una matriz de colágeno dispersa con microesferas de color verde fluorescente que se utilizan como referencias de posición. Las siguientes tres imágenes muestran la migración dirigida del neutrófilo a medida que se desplaza por un gradiente de atrayente de quimioterapia, que se representa con la flecha blanca.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear una cámara de difusión simple para investigar la migración celular en una matriz de colágeno en 3D.