La fabricación de una funcionalizado magnética bacteriana NANOCELULOSA con nanopartículas de óxido de hierro

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar nanocelulosa bacteriana, o BNC, y hacerla magnética mediante la impregnación in situ con nanopartículas de óxido de hierro. Las membranas magnéticas BNC están diseñadas para atraer y retener localmente las células magnetizadas contra el flujo hemodinámico. La principal ventaja del BNC magnético sintetizado en este procedimiento es que proporciona un tratamiento mínimamente invasivo cerca de los aneurismas cerebrales.

Los tratamientos convencionales de los aneurismas cerebrales, como el clipaje y la emulación del núcleo neural y vascular, son invasivos y traumáticos, y no son adecuados en la mayoría de los pacientes con mayor riesgo. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de las enfermedades vasculares, ya que los injertos vasculares, hechos de andamios magnéticos, pueden acelerar la curación al mejorar la retención celular en el sitio de la lesión. Comience este procedimiento con la preparación del medio de cultivo líquido como se describe en el protocolo de texto.

Transfiera dos mililitros del medio de cultivo líquido a cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Tome dos colonias con una aguja inoculadora de las placas de Petri inoculadas paso a paso y colóquelas en el primer pocillo de la placa de cultivo de tejidos. Repita el mismo procedimiento para los 23 pozos restantes.

Incubar la placa de cultivo de tejidos a 30 grados centígrados durante siete días. Esto producirá un total de 24 películas BNC con un diámetro de 16 mm y un espesor de aproximadamente 2 a 3 mm. Recoja las películas BNC del medio de crecimiento y esterilícelas en 200 mililitros de solución de hidróxido de sodio al uno por ciento durante una hora a 50 grados Celsius para eliminar todos los rastros de G.Xylinus.

Deseche la solución y agregue 200 mililitros de solución de hidróxido de sodio al uno por ciento recién preparada. Repita el mismo proceso una vez más o hasta que las películas de BNC en solución adquieran un aspecto translúcido. Enjuague las películas BNC con agua tres veces y guárdelas en agua de alta pureza a temperatura ambiente.

Asegúrese de que las películas BNC estén completamente sumergidas en el agua y no se dejen secar en ningún momento. A continuación, autoclave las películas BNC a 121 grados centígrados durante 20 minutos. Para comenzar la síntesis, burbujee 1000 mililitros de agua de alta pureza con gas nitrógeno para eliminar el oxígeno disuelto en el agua y reemplazarlo con nitrógeno.

Utilice un matraz de fondo redondo de tres cuellos para preparar una solución en una proporción molar de 2 a 1 de cloruro de hierro 3 hexahidratado y cloruro de hierro 2 tetrahidratado, diluido con el agua desoxigenada de alta pureza. Utilice 2 cuellos del recipiente para proporcionar una entrada y salida constantes de gas nitrógeno conectando el suministro de gas nitrógeno a una aguja perforada en un tapón de tabique y fijada al cuello del recipiente. Coloque una película BNC en el recipiente con los reactivos.

Asegúrese de que la muestra esté completamente sumergida en el líquido. Luego, llene todas las juntas de vidrio con grasa para aspiradoras. Conecte el cuello restante del recipiente a un tubo de condensador cubierto con un tubo de secado lleno de sulfato de calcio anhidro.

Deje correr el agua a través del tubo del condensador. A continuación, caliente la solución en un baño de aceite de silicona a 80 grados centígrados, utilizando una placa calefactora agitadora y mantenga esta temperatura. Utilice una pequeña barra magnética para mezclar los reactivos a 350 R.P.M. durante 5 minutos.

Asegúrese de que el BNC esté adecuadamente impregnado con la solución ferrosa y que los reactivos estén completamente disueltos. Aumente la velocidad de agitación a 700 R.P.M.In un intervalo de tiempo de cinco minutos, agregue cinco mililitros de hidróxido de amonio a los 10 mililitros de solución ferrosa usando una aguja de pipeteo que se haya perforado en un tapón de tabique. Después de la adición del hidróxido de amonio, el color de la solución cambia de amarillo-naranja a negro.

Continúe revolviendo la solución a 80 grados centígrados durante otros cinco minutos. Evite las agitaciones a alta velocidad para mantener la integridad de la muestra. Baje la temperatura de la solución a 30 grados centígrados usando la parte inferior de control de temperatura de la placa caliente de agitación y siga revolviendo durante otros cinco minutos.

A continuación, apague la placa calefactora. En este punto, las nanopartículas de óxido de hierro se han incorporado a la malla BNC. A continuación, enfríe la mezcla a temperatura ambiente y transfiérala a un matraz recipiente para separar las nanopartículas magnéticas, o MNP, y el BNC con un fuerte imán permanente.

Para hacer esto, mantenga el imán cerca del recipiente para mantener los MNP y BNC en su lugar mientras decanta el sobrenadante. Vuelva a suspender los MNP y BNC en 100 mililitros de agua. Agite suavemente la solución para eliminar todos los MNP que no estén fuertemente incorporados en el BNC.

A continuación, decanta el sobrenadante de nuevo sujetando los MNP y el BNC en su lugar con el imán. Lavar las MNPs y el BNC varias veces con agua hasta que el sobrenadante alcance el PH neutro, medido con una tira colorimétrica. Separe el BNC funcionalizado magnético, o MBNC, de los MNP, usando pinzas, y enjuague los MBNC varias veces con agua hasta que el agua salga clara.

Esterilice el MBNC exponiéndolo durante la noche para U.V.Store el MBNC en 20 mililitros de agua desoxigenada de alta pureza que se haya esterilizado en autoclave a 120 grados centígrados durante 20 minutos. Asépticamente, sumerja la muestra en un uno por ciento de polietilenglicol, o PEG, y revuelva durante dos horas a temperatura ambiente. El recubrimiento con PEG mejora la biocompatibilidad y la estabilidad de las nanopartículas de óxido de hierro depositadas en el BNC a medida que se distribuyen a través de la red tridimensional MBNC.

Aquí se muestra el aspecto macroscópico del BNC. El recipiente de cultivo da la forma de las películas. La microscopía electrónica de barrido revela que la microestructura del BNC de aproximadamente 50 nanómetros de diámetro forma cintas finas, que crean poros abiertos en toda la red.

La funcionalización magnética del BNC proporciona una estructura fibrilar menos compactada en comparación con el BNC. Las nanopartículas de óxido de hierro se localizan preferentemente entre los poros formados por el entrelazado de fibrillas. La topografía de microscopía de fuerza atómica detectó el gradiente de fuerza magnética caracterizado por dos dominios a través de la superficie MBNC.

Un campo magnético de alta intensidad, mostrado en amarillo, y un campo magnético de intensidad débil, mostrado en verde. La presencia de dominios magnéticos observados con MFM se confirma mediante datos de magnetómetro de muestra vibrante que muestran que las nanopartículas de óxido de hierro son superparamagnéticas, lo que hace que el BNC sea magnético. La integridad del ADN en las células del músculo liso aórtico humano se conserva después de un período de incubación de 24 horas, cuando se cultivan en ausencia y presencia de BNC o MBNC, como es evidente cuando se comparan con las células que se sometieron a un tratamiento con peróxido de hidrógeno.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer que una nanocelulosa bacteriana sea magnética para aplicaciones en la reconstrucción de vasos sanguíneos dañados. Tuvimos la idea de este método cuando necesitábamos inducir un gradiente de densidad de nanopartículas magnéticas que debían dispersarse dentro de la compleja matriz de la red de nanocelulosa bacteriana. La integración de las nanopartículas de óxido de hierro en esta red requirió que lleváramos a cabo un método durante la síntesis del BNC.

En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque hay una serie de pasos complejos para impregnar nanopartículas de óxido de hierro en BNC.