Reacción seleccionada Monitoreo espectrometría de masas para Absolute Proteína cuantificación

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la cromatografía líquida, la monitorización de reacciones seleccionadas o L-C-S-R-M para cuantificar la abundancia absoluta de proteínas objetivo dentro de muestras biológicas complejas. Después de la selección de los objetivos peptídicos, se sintetizan patrones de péptidos externos crudos y se utilizan para desarrollar ensayos de SRM mediante cromatografía líquida, espectrometría de masas o LCM ms. Los ensayos resultantes se utilizan para realizar análisis cualitativos lc, SRM de muestras biológicas preparadas.

Si se detecta el péptido diana derivado de la muestra biológica, las muestras biológicas se analizan mediante ensayos cuantitativos lc SRM mediante la adición de una serie de dilución de isótopos estables de patrones de péptidos internos. En última instancia, lc SRM se puede utilizar para cuantificar con precisión proteínas a partir de una amplia variedad de muestras biológicas y para respaldar las investigaciones de una amplia variedad de proteínas objetivo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los inmunoensayos, es que el desarrollo del ensayo es relativamente rápido y económico, y los ensayos resultantes son susceptibles de multiplexación y no son vulnerables a la reactividad cruzada de anticuerpos.

Para comenzar, prepare los estándares de péptidos liofilizados como se describe en el protocolo de texto. Luego agregue 100 microlitros de solución de acetonitrilo de ácido fórmico a cada M de patrón de péptido liofilizado para producir una concentración de péptido de 10 micromolares. Agite las muestras durante dos minutos y bájese.

Sonicarlos durante cinco minutos para asegurarse de que la disolución del péptido sea completa. Extraer los péptidos disueltos y concentrar la mezcla resultante en un concentrador de vacío hasta un volumen final de 80 microlitros. Añadir 20 microlitros de nitrilo acetil para disolver cualquier péptido precipitado.

La muestra ahora contiene 10 micromolares de cada péptido, así como un 20% de nitrilo acetilo de volumen a volumen y se puede utilizar Para preparar los patrones de péptidos internos y externos, analice las mezclas de los patrones de péptidos externos en aproximadamente uno a 10 picomoles de cada péptido por inyección mediante espectrometría de masas de escopeta utilizando un sistema de HPLC de nanoflujo acoplado a un espectrómetro de masas cuádruple triple. Como se detalla en el protocolo de texto, asegúrese de que cada ejecución de LCMS incluya un gradiente lineal de 60 minutos, un paso de regeneración de columna y un paso de equilibrio de ree de columna. Analice los datos de escopeta resultantes utilizando la base de datos, buscando en las secuencias de los estándares de péptidos externos.

Revise manualmente todas las identificaciones de péptidos para asegurarse de que todas sean inequívocas, descartando cualquier identificación de péptidos ambigua. Utilice las identificaciones de péptidos Ms de escopeta para construir una biblioteca de espectro utilizando un programa de software como Skyline Line. Prepare una lista de transiciones lc SRM utilizando las tres a 10 transiciones más intensas por ion precursor.

Utilice las listas de transición resultantes para realizar el análisis lc SRM de las mezclas de los patrones de péptidos externos. Revise manualmente los datos L-C-S-R-M resultantes y elimine los ensayos de bajo rendimiento. Preparar las muestras biológicas.

Primero, coseche las celdas como se describe en el protocolo de texto. Agregue 400 microlitros de tampón de lisis de urea recién preparado y mezcle cada muestra con un pipeteo suave. Transfiera cada muestra a un tubo de dos mililitros que tiene un tapón de rosca con una junta tórica que contiene aproximadamente 100 microlitros de perlas de sílice de circonio de 0,1 milímetros, células de lyce mediante el vórtice de las muestras durante cinco minutos a velocidad completa.

Sonicar las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente para ayudar a la homogeneización y la maduración de las proteínas. A continuación, realice un ensayo de concentración de proteínas de los lisados, como un ensayo de ácido bissy para el análisis cualitativo. Prepárese para alícuotas de 200 microgramos de lisado celular para una serie de diluciones de isótopos estables.

Agregue la serie de dilución de isótopos estables de la mezcla de ecomolares de los patrones de péptidos internos a las muestras. Reduzca los residuos de cisteína proteica añadiendo 0,7 microlitros de un DTT molar a cada muestra e incubando las muestras a 60 grados centígrados durante 30 minutos. Alquile cistinas proteicas añadiendo siete microlitros de acetamida ITO tamponada a cada muestra e incubando las muestras a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad.

Para cada una de las muestras, agregue 482 microlitros de hees de 100 milimolares ajustados con hidróxido de sodio para que la concentración final de urea sea de un molar. A continuación, tres veces, digiere las proteínas en péptidos. Agregue ocho microlitros de 0,5 microgramos por microlitro de tripsina de grado de secuenciación a cada muestra que contenga lisado celular.

A continuación, incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 18 horas. Después de la incubación, agregue 440 microlitros de 2% de volumen a centrífuga de ácido fórmico de volumen todas las muestras a 21.000 G durante 20 minutos a temperatura ambiente para granular cualquier precipitado que obstruya la fase sólida de un cartucho C 18 SPE. Extraiga cada una de las NTINA de SUP utilizando una ráfaga de cartucho C 18 SPE desechable.

Humedecer la columna aplicando un mililitro de tampón B y equilibrarla aplicando dos veces un mililitro de tampón a. Forzar las fases móviles a través del cartucho C 18 SPE utilizando una superficie plana hasta el bulbo de goma y un colector de extracción. Aplique la muestra y posteriormente lave el cartucho con un mililitro de tampón A, eluya dos veces los péptidos aplicando un mililitro de tampón B. Concentre lentamente cada ilu en un concentrador de vacío hasta un volumen final de 100 microlitros para evaporar el nitrilo acetilo.

A continuación, añada dos microlitros, el 5%volumen a volumen de ácido fórmico en nitrilo acetil a cada muestra. Analice las muestras utilizando L-C-S-R-M cualitativo como antes. Para el análisis cuantitativo L-C-S-R-M, se ejecutó la serie de dilución de isótopos de cada muestra biológica y se utilizó espectrometría de masas de escopeta para analizar los patrones de péptidos externos.

Las 10 transiciones más intensas por precursor fueron seleccionadas para L-C-S-R-M. A continuación, se utilizó L-C-S-R-M para analizar los patrones de péptidos externos. Las identificaciones peptídicas resultantes deben ser inequívocas.

El análisis cualitativo L-C-S-R-M de las muestras biológicas generalmente resultó en más señal de fondo, pero la mayoría de los objetivos peptídicos se identificaron con confianza. El L-C-S-R-M cuantitativo se realizó utilizando patrones de péptidos internos introducidos en las muestras biológicas. Los valores de abundancia de proteínas resultantes fueron consistentes en todas las réplicas biológicas y en los dos péptidos diana por proteína diana.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar y realizar ensayos L-C-S-R-M para cuantificar la abundancia absoluta de proteínas objetivo dentro de muestras biológicas complejas.