Name: Reacción seleccionada Monitoreo espectrometría de masas para Absolute Proteína cuantificación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a cuantificar proteínas mediante cromatografía líquida y monitoreo de reacción seleccionada (SRM) en muestras biológicas complejas. Este método ofrece cuantificación absoluta precisa y rápida.

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Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de los NIH, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas.

Los autores no tienen nada que revelar.

Cuantificación de proteínas absoluta es esencial para una gama muy diversa de aplicaciones biomédicas como la validación de biomarcadores y el modelado vía de transducción de señales. Recientemente, la proteómica dirigidos utilizando LC-SRM se ha beneficiado de las mejoras a las numerosas tecnologías, incluyendo la preparación de péptidos estándar, HPLC, QqQ-MS, y el análisis de datos LC-SRM. En consecuencia, se ha convertido en una alternativa poderosa para inmunoensayos. Los inmunoensayos pueden ser extremadamente sen...

Experimentos proteómicos que utilizan espectrometría de masas (MS) se pueden diseñar para utilizar ya sea no específica (shotgun) o métodos específicos. Proteómica Descubrimiento generalmente se basa en la escopeta de abajo hacia arriba MS, ya sea mediante el uso de un modo de adquisición de datos dependiente tradicional, o utilizando una de las técnicas de datos independiente de reciente desarrollo (por ejemplo, MS E, SWATH) 1,2. Proteómica de escopeta es una poderosa herramienta para la identificación de péptidos de alto rendimiento y la cuantificación relativa, pero es generalmente inadecuado para la cuantificación absoluta o para dirigir pequeños conjuntos, definidos (~ decenas) de las proteínas. El método MS más utilizado para la proteómica dirigidos se selecciona reacción monitoreo (SRM) debido a su alta sensibilidad, velocidad y rango dinámico 3-5. Alternativas a SRM incluyen el monitoreo de reacción en paralelo, que se aprovecha de alta resolución, escaneo de MS total de 6. SRM se realiza generalmente mediante un rever nano-flujocromatografía SED-fase líquida de alto rendimiento (nano-RP-LC) acoplada a un instrumento de ionización por electrospray nano-(nano-ESI) fuente de iones unido a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (QqQ-MS). En un experimento típico, las proteínas de la muestra se digiere proteolíticamente, y los péptidos resultantes se separaron cromatográficamente, desorbidos, y ionizados. Los iones precursores resultantes son m / z filtrada por el primer cuadrupolo (Q1) y fragmentado en el segundo cuadrupolo (q2) al chocar con un gas de colisión. Los iones de fragmentos resultantes son m / z-filtrada en la tercera cuadrupolo (Q3) y se cuantifica por un dynode. Cada par precursor y el ion fragmento se conoce como una transición, y cada transición se controla por un período determinado de tiempo (el tiempo de permanencia; típicamente 2-50 ms). Durante LC-SRM, los ciclos QqQ-MS a través de una lista predefinida de transiciones (el ciclo de trabajo es típicamente ≤3 seg), y se produce un cromatograma de cada transición. Strateg Alternativas para la cuantificación de proteínas suelen utilizar inmunoensayos tales como transferencias de puntos, transferencias de Western, ELISA, microarrays de anticuerpos, microarrays de proteínas de fase inversa, inmunoensayos de microfluidos, ELISA digitales, e inmunoensayos basados ​​en microesferas 7. Los mejores inmunoensayos pueden ser significativamente más sensible que la LC-SRM, y rendimiento de la muestra de inmunoensayos pueden ser significativamente mayor que la de LC-SRM 5. Sin embargo, los inmunoensayos en desarrollo pueden ser costosos y / o requiere mucho tiempo, y los ensayos resultantes pueden ser vulnerables a la reactividad cruzada y / o interferencia, incompatible con la célula / tejido de lisis / métodos de homogeneización, y / o no susceptible de multiplexación 5,8. Algunos de estos problemas pueden abordarse mediante el acoplamiento de técnicas en anticuerpos y basados ​​en MS. Por ejemplo, las proteínas diana pueden enriquecerse utilizando inmunoprecipitación antes de la proteólisis y LC-SRM 9-12. Alternativamente, la técnica emplea SISCAPA inmunoprecipitación posterior a la proteólisis en el péptido level 13,14. Además de immunoenrichment estrategias, immunodepletion de las proteínas de alta abundancia puede ser empleado para aumentar la sensibilidad LC-SRM mediante la reducción de la interferencia por coeluyentes analitos 15,16. La cuantificación de proteínas basado en MS se puede dividir en la cuantificación relativa y absoluta, y también en el etiquetado de isótopos de etiqueta libre y estable (por ejemplo, etiquetado metabólico, etiquetado química, y de la proteína marcada con pesado y de péptidos estándares internos). Técnicas de la etiqueta libre pueden ser útiles para la cuantificación de proteínas relativo, pero no son adecuados para la cuantificación absoluta precisión. En comparación, las técnicas de etiquetado han reducido de error asociado con la preparación de muestras y MS varianza, y se utilizan a menudo para la cuantificación relativa de proteínas 17. Por ejemplo, isótopo estable marcado proteoma normas (SILAP) preparado utilizando una línea celular humana se cultivaron permitido la cuantificación relativa de biomarcadores potenciales a través de LC-SRM de suero humano 18. Precisa cuantificación de proteínas absoluta por la EM requiere que las normas internas, cuantificado, proteína o péptido marcado isotópicamente purificada y se enriquecerán-en muestras biológicas antes de la EM. La incorporación de isótopo pesado estándares internos marcados en un flujo de trabajo LC-SRM permite la cuantificación absoluta que se ha demostrado ser altamente reproducible y transferible entre los laboratorios 16,19. Isótopos estables etiquetados normas internas para la cuantificación absoluta de proteínas por MS incluyen normas de péptidos preparados mediante síntesis en fase sólida 20, proteínas compuestas de normas péptido proteasa escindible concatenados 21, y las normas de la proteína de longitud completa 22. Target modificación covalente de proteínas y preparación de la muestra incompleta (es decir, la lisis incompleta de la muestra y de la homogeneización, y la solubilización incompleta de proteínas, la desnaturalización, la alquilación, y la proteolisis) puede socavar la cuantificación exacta. P Internanormas rotein son los menos propensos a ser afectados por la mayor parte de estos problemas potenciales, pero por lo general son los más difíciles de preparar. Una alternativa es analizar cada proteína diana utilizando múltiples estándares de péptidos internos que están diseñados para incluir residuos flanqueantes nativas amino- y carboxi-terminal. Independientemente de que se emplea el tipo de patrón interno, se debe claveteado-en las muestras biológicas en un punto temprano como durante la preparación de la muestra como sea posible. Además, las técnicas de preparación de muestras múltiples (por ejemplo, diferentes condiciones de desnaturalización) deben ser probados. El uso de múltiples técnicas experimentales ortogonales (experimental de validación cruzada) es una estrategia viable para superar la mayor cuantificación potencial desafía 23-25. LC-SRM cuantificación de proteínas es una técnica altamente flexible que se ha utilizado en una amplia variedad de aplicaciones. En particular, se ha utilizado para estudiar péptidos y proteínas dentro de biomarcadoresmuestras clínicas tales como suero, biopsias de núcleo, y aspirados con aguja fina 5. LC-SRM también se ha utilizado para medir la estequiometría de los complejos de proteínas 5,26, para detectar neurotoxinas botulínicas 27, para cuantificar la dinámica de fosforilación de proteínas dentro de las vías de señalización 5, y para cuantificar los cambios en la conformación de la proteína 28. Nuestro laboratorio está utilizando LC-SRM para cuantificar las proteínas de señalización que median la quimiotaxis de macrófagos para apoyar el desarrollo de simulaciones vía quimiotaxis. El esquema general del protocolo (Figura 1) comienza con la clasificación de los péptidos diana tentativas. Posteriormente, los estándares de péptidos externos crudo se sintetizan y se utilizan para desarrollar ensayos LC-SRM para los análisis cualitativos de muestras biológicas. Si se detecta el péptido diana derivado de muestra biológica, los estándares de péptido interno marcado con pesados ​​purificados se preparan para cuantitativo LC-SRM. Este protocolo se puede utilizar para accurately cuantificar proteínas a partir de una amplia variedad de muestras biológicas, y para apoyar las investigaciones de una amplia variedad de dianas proteicas.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrilo (ACN), grado LC-MS</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>BCA (ácido bicinconínico) kit de ensayo de proteínas</td><td>Fisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Perlas para batir perlas, zirconio-sílice, 0,1 mm</td><td>Productos BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de bestatina</td><td>Sigma</td><td>B8385-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo celular DMEM (con glucosa, sin L-glutamina)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo celular EDTA, 500 mM, pH8</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo celular suero fetal bovino (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo celular L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo celular solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo celular Tinción de viabilidad de azul de tripano, 0.4% w/v</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Celómetro Auto T4 contador de células</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Celómetro Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Celómetro Auto T4 cámaras de conteo desechables</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico, grado LC-MS, ampollas</td><td>Fisher</td><td>A117-10X1AMP</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro, mejorado por Neubauer, 0,1 mm de profundidad</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0640030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M, pH 7,2</td><td>Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico, 37% p/p</td><td>VWR</td><td>BDH3028-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas basado en láser</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>LC capilar de sílice recubierta, 50 y micro; m id</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>vial LC, muestreador automático, polipropileno de 12 mm x 32 mm</td><td>SUN SRI</td><td>200-268</td><td></td></tr><tr><td>LC vial tapón de rosca, muestreador automático, precortado PTFE/silicona</td><td>SUN SRI</td><td>500-061</td><td></td></tr><tr><td>Luciferasa, de Photinus pyralis</td><td>Sigma</td><td>L9506-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina A</td><td>EMD Millipore</td><td>516481-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de pH colorpHast (pH 0.0-6.0)</td><td>EMD Chemicals</td><td>9586-1</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop cóctel inhibidor de fosfatasa</td><td>Roche</td><td>04906837001</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, C18 1 ml cartucho de 100 mg</td><td>Waters</td><td>WAT023590</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, colector de extracción, 20 posiciones</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, bombilla de goma de superficie plana</td><td>Fisher</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>concentrador</td> de vacío Fisher <td>SPD111V</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA), grado LC-MS</td><td>Fisher</td><td>A116-50</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, grado de secuenciación, modificado</td><td>Tubo Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td> destaponadora para tubos Micrónicos</td><td>USA Scientific</td><td>1765-4000</td><td></td></tr><tr><td>Tubos, microcentrífuga de 2 ml, junta tórica con tapón de rosca, estéril</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U0631-500g</td><td></td></tr><tr><td>Agua, grado LC-MS</td><td>Fisher</td><td>W6-1</td><td></td></tr></tbody></table>

reacción seleccionada monitoreo espectrometría de masas para absolute proteína cuantificación

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

La cuantificación absoluta de proteínas diana dentro de muestras biológicas complejas es fundamental para una amplia gama de aplicaciones clínicas y de investigación. Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para el desarrollo y la aplicación de ensayos cuantitativos mediante espectrometría de masas (MS) de monitorización de reacciones seleccionadas (SRM). En primer lugar, los probables péptidos diana cuantitativos se identifican sobre la base de numerosos criterios. Esto incluye la identificación de péptidos proteotípicos, evitar sitios de modificación postraduccional y analizar la unicidad del péptido objetivo con respecto a la proteína objetivo. A continuación, se sintetizan patrones de péptidos externos crudos y se utilizan para desarrollar ensayos SRM, y los ensayos resultantes se utilizan para realizar análisis cualitativos de las muestras biológicas. Por último, se preparan y utilizan patrones de péptidos internos marcados con isótopos pesados purificados, cuantificados y para realizar ensayos SRM de series de dilución de isótopos. Se presenta el análisis de todos los datos de EM resultantes. Este protocolo se utilizó para analizar con precisión la abundancia absoluta de proteínas de la vía de señalización de quimiotaxis dentro de las células RAW 264.7 (una línea celular de monocitos de ratón/macrófagos). Se describe en detalle la cuantificación de Gi2 (una proteína G heterotrimérica α subunidad).

El desarrollo de modelos computacionales de predicción de las vías de transducción de señales es uno de los objetivos fundamentales de la biología de sistemas 53. Desafortunadamente, incluso para las vías de señalización que han sido estudiados extensamente y tienen una alta significación clínica, todavía no es generalmente posible predecir cuantitativamente el comportamiento de vía en respuesta a las perturbaciones (por ejemplo, esto es cierto para la MAPK / ERK vía 54). Recientemente, un...

Este protocolo describe cómo realizar ensayos de cuantificación absoluta de proteínas objetivo dentro de muestras biológicas complejas utilizando la monitorización de reacciones seleccionadas. Se utilizó para cuantificar con precisión las proteínas de la vía de señalización de la quimiotaxis de los macrófagos de ratón. Se describe en detalle la selección de péptidos objetivo, el desarrollo de ensayos y los ensayos cualitativos y cuantitativos.

Reacción seleccionada Monitoreo espectrometría de masas para Absolute Proteína cuantificación

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar cromatografía líquida y monitoreo de reacción seleccionada, o L-C-S-R-M, para cuantificar la abundancia absoluta de proteínas diana en muestras biológicas complejas. Tras la selección de los péptidos diana, se sintetizan estándares péptídicos externos crudos y se utilizan para desarrollar ensayos SRM mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas, o LC-MS. Los ensayos resultantes se emplean para realizar un análisis cualitativo de LC y SRM en muestras biológicas preparadas.Si se detecta el péptido diana derivado de la muestra biológica, las muestras biológicas se analizan mediante ensayos cuantitativos de SRM con cromatografía líquida (lc SRM) mediante la adición de una serie de dilución con isótopos estables de estándares internos de péptidos. En última instancia, la lc SRM puede utilizarse para cuantificar con precisión proteínas procedentes de una amplia variedad de muestras biológicas y para apoyar investigaciones sobre una amplia gama de dianas proteicas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los inmunoensayos es que el desarrollo del ensayo es relativamente rápido y económico, y lo

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

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Normas de isótopos estables y de captura de anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) enriquecimiento de las parejas de afinidad de los péptidos con una dilución de isótopos estables de espectrometría de masas (MRM-MS) para proporcionar una medición cuantitativa de los péptidos como sustitutos de sus respectivas proteínas. A continuación se describe el protocolo de uso de partículas magnéticas en un formato parcialmente automatizado.

La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

Presentamos un protocolo para identificar y cuantificar los componentes en mezclas de especies que poseen proteínas similares. La espectrometría de masas detecta péptidos para su identificación y proporciona una cuantificación relativa por proporciones de áreas de picos. Como alimento de herramienta para la detección de fraudes, el método puede detectar un 1% de caballo en la carne de vacuno.

La determinación de las especies y cuantificación de mezclas Uso de MRM espectrometría de masas de los péptidos Aplicada a la autenticación de carne

Aquí, describimos un análisis cromatográfico juntado con la separación de movilidad de iones precursores de péptidos seguida por la alta resolución (~ 30.000) MS-detección de fragmentos de péptidos para la cuantificación de normas péptido con púas en un anticuerpo monoclonal Digest.

Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica

Se presenta un protocolo para la extracción completa de lípidos, metabolitos y proteínas de tejidos biológicos utilizando una muestra.

Un método de extracción fraccionada simple para el análisis comprensivo de metabolitos, lípidos y proteínas a partir de una sola muestra

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

Aquí, presentamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en el metabolismo central de carbono y energía en reacciones de síntesis de proteínas libres de células. La mezcla de síntesis sin células se deriva con anilina para una separación efectiva utilizando cromatografía líquida de fase inversa y luego se cuantifica mediante espectrometría de masas utilizando estándares internos etiquetados isotópicamente.

Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas

El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.

Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido

El protocolo tiene como objetivo introducir el uso de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo para el monitoreo de reacción múltiple (MRM) de proteínas de muestras clínicas. Hemos proporcionado un flujo de trabajo sistemático desde la preparación de muestras hasta el análisis de datos para muestras clínicas con todas las precauciones necesarias a tomar.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa utilizando la detección basada en el monitoreo de reacciones múltiples de proteínas del tejido cerebral humano

Se presenta un protocolo para la determinación de biomarcadores de baja abundancia a partir de muestras de suero seco ejemplificado con el péptido liberador de progastrina biomarcador (ProGRP). Las perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos se utilizan para la limpieza selectiva y el enriquecimiento de un péptido ProGRP proteotípico. El péptido capturado se analiza posteriormente mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem.

Micromuestreo en análisis de proteínas basado en espectrometría de masas dirigida de proteínas de baja abundancia

Aprende a cuantificar proteínas mediante cromatografía líquida y monitoreo de reacción seleccionada (SRM) en muestras biológicas complejas. Este método ofrece cuantificación absoluta precisa y rápida.

Reacción seleccionada Monitoreo espectrometría de masas para Absolute Proteína cuantificación

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