Modelo de polarizado Neural tisular basada Silk-colágeno-Engineered 3D

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el proceso de ingeniería de tejidos cerebrales en 3D. Esto se logra preparando primero los andamios porosos a partir de una solución de seda utilizando una técnica de lixiviación con sal. El segundo paso es precortar los andamios en forma de rosquilla y prepararlos para el cultivo celular mediante esterilización y recubrimiento con poli de licina o PDL.

A continuación, los andamios preparados se siembran con neuronas corticales primarias de rata recién aisladas. El paso final es la incrustación de colágeno de los andamios y la transferencia a las placas de cultivo. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia se utiliza para mostrar el crecimiento neuronal y el desarrollo de las redes neuronales.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de enfermedades cerebrales que afectan al cerebro, ya que esta técnica puede utilizarse como base para desarrollar nuevos modelos de investigación sobre el Parkinson o el Alzheimer. Antes de comenzar, prepare la solución de seda al 6% como se describe en el protocolo de texto y guárdela a cuatro grados centígrados. Para preparar andamios porosos, primero tamizando, el cloruro de sodio granular y recolectando gránulos de entre 500 y 600 micrómetros de diámetro.

Vierta 30 mililitros de la solución de seda en el molde de politetrafluoroetileno o PTFE y luego esparza 60 gramos de cloruro de sodio tamizado uniformemente. La solución. Incubar durante 48 horas a temperatura ambiente para polimerizar la seda.

Coloque el andamio que contiene el molde en un horno a 60 grados centígrados durante una hora para finalizar la reticulación de la seda y evaporar el líquido restante. A continuación, sumerja la combinación de molde y andamio en un vaso de precipitados de dos litros de agua destilada durante 48 horas. Para lixiviar la sal, cambie el agua dos o tres veces al día.

Retira el andamio del molde y córtalo en trozos pequeños. Primero con un punzón de biopsia de cinco milímetros de diámetro. A continuación, corte el andamio para que tenga dos milímetros de altura y retire el centro de cada pieza con un punzón de biopsia de dos milímetros.

Esterilizar los andamios en clave en un ciclo húmedo durante 20 minutos. Dentro de una campana de cultivo celular, coloque un par de pinzas esterilizadas, medios de cultivo celular y los andamios del autoclave. Retire una placa de 96 pocillos de su envoltura y colóquela dentro para sembrar los andamios.

Primero coloque un andamio estéril por pocillo. En la placa de 96 pocillos, agregue medio de cultivo celular para sumergir los andamios e incube a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos para equilibrarlos durante al menos 30 minutos. Después de la incubación, aspire el exceso de medio de los andamios.

A continuación, añada dos veces 10 a las seis células neuronales corticales de rata en 100 microlitros de medio neurobasal por andamio. Regrese la placa a la incubadora y déjela toda la noche para permitir que las celdas se adhieran al andamio. A la mañana siguiente.

Aspire cuidadosamente las células no adheridas y reemplácelas con 200 microlitros de cultivo celular fresco. Medio. Incuba a 37 grados centígrados durante un breve período. A continuación, aspire el medio de los pocillos con pinzas estériles.

Transfiera los andamios que contienen celdas a los pozos vacíos de los 96. A continuación, coloque en cada andamio 100 microlitros de hielo recién diluido, tres miligramos por mililitro de solución de colágeno de cola de rata. Regrese las células a la incubadora a 37 grados centígrados para permitir la polimerización del colágeno durante 30 minutos.

Retire la placa de la incubadora y agregue 100 microlitros de cultivo celular precalentado. Medio por retorno de pozo. Gire la placa hacia la incubadora durante el período deseado de crecimiento celular, reemplazando la mitad del medio de cada pocillo con medio fresco todos los días durante un máximo de una semana.

En estos andamios altamente porosos, las células neuronales se pueden cultivar a una alta densidad demostrada. Estos son los resultados de viabilidad celular. Un día después de la siembra, aparecen células vivas marcadas con di acetato fluorescente en andamio de seda y yoduro de propidio verde.

En rojo, observe el alto porcentaje de células vivas que se ven con un aumento bajo. Esta figura muestra la compartimentación de los cuerpos celulares neuronales y los procesos axonales dentro del andamio en forma de rosquilla. Los cuerpos celulares neuronales permanecen unidos al andamio de seda, como se ve aquí un día después de la siembra, las células se tiñen inmunológicamente para beta tres tubulina y aparecen de color verde.

Como era de esperar, las células han poblado densamente el andamio en el séptimo día de cultivo. Por el contrario, la matriz de colágeno en el hueco central del andamio proporciona soporte para el crecimiento axonal extenso. Aquí se muestra la malla axonal.

Siete días después de la siembra. Esta película muestra un escaneo Z confocal de la ventana central de colágeno del andamio que contiene las células de la red neuronal que se marcaron mediante tinción para beta tres tubulina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar las construcciones de tejido 3D similares al cerebro.