Name: Modelo de polarizado Neural tisular basada Silk-colágeno-Engineered 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprende a construir tejido neural 3D usando andamios de seda porosa con lixiviación salina y neuronas corticales de rata. Este modelo permite estudiar redes neuronales y enfermedades neurodegenerativas como Parkinson y Alzheimer.

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Agradecemos al laboratorio del Dr. Stephen Moss por proporcionar tejidos cerebrales embrionarios de rata. M.D.T. diseñó el protocolo original. Este trabajo fue financiado por el Centro de Recursos de Ingeniería de Tejidos P41 de los Institutos Nacionales de Salud Grant EB002520. K.C. recibió una beca postdoctoral de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) (CH 1400/2-1).

El protocolo de aislamiento de tejido cerebral fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Tufts y cumple con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión B2011-45). 1. Preparación de la Seda Andamios <ol><li> Preparación de la solución de seda de los capullos Bombyx mori como se describió previamente 19,20. <ol><li> Corte cada capullo en 8 partes iguales utilizando tijeras. Utilice unos 11 capullos de 5 g de capullos fragmentados. (15 minutos) </li><li> Prepare 2 L de M Na 2 CO 3 solución de 0,02 y ponerla a hervir utilizando una placa caliente. (15 minutos) </li><li> Pesar 5 g de capullos fragmentadas y hervirlas en Na 2 CO 3 solución durante 30 minutos. Revuelva la seda hirviendo cada par de minutos con una espátula. Este paso, también llamada de-engomado, purifica fibroína de seda de proteínas hidrófilas, sericins. (30 minutos) </li><li&gt; Escurra la fibroína a mano y enjuague en agua destilada al menos tres veces para lavar cualquier sericina restante y productos químicos. (5 minutos) </li><li> Coloque la fibroína húmedo en una placa de Petri y se seca el extracto fibroína en la campana de flujo O / N. </li><li> Al día siguiente, pesa la masa fibroína seco y colocar la fibroína en un vaso de vidrio. (15 minutos) </li><li> Con el fin de disolver la fibroína en solución 9,3 M LiBr, calcular el volumen requerido (en ml) de LiBr multiplicando la masa de fibroína seca por 4. Verter lentamente solución de LiBr sobre la fibroína de seda y sumergir todas las fibras de fibroína usando una espátula. Cubrir el vaso para evitar la evaporación y colocarlo a 60 ° C durante 4 horas para permitir que las fibras se disuelven. (15 minutos) </li><li> El uso de la jeringa, recoja la solución fibroína del vaso de precipitados y cargarlo en los MWCO 3.500 casetes de diálisis. Realizar la diálisis frente a agua destilada durante 48 horas. Cambie el agua cada dos horas. </li><li> El uso de la jeringa, recoger la solución de fibroínalos cassettes en 50 ml tubos cónicos y se centrifuga dos veces a 9.000 rpm (~ 12.700 xg) a 4 ° C durante 20 min. Verter el sobrenadante en un tubo nuevo después de cada etapa de centrifugación y desechar el sedimento. (40 min) </li><li> Medir la concentración de la fibroína mediante la estimación del peso en seco. Vierta 1 ml de solución de seda en una barca pesar. Secar la muestra en el horno a 60 ° C durante 2 hr. Pesar la fibroína de seda seco y calcular la concentración de la solución de fibroína de seda multiplicando el peso obtenido por 100. La concentración esperada de solución de seda es 6-9% (w / v). </li><li> Ajustar la concentración de seda a 6% (w / v) mediante la dilución en agua destilada. Punto de detención: La fibroína de seda líquida se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de un mes, en un recipiente cerrado. </li></ol></li><li> Preparación de andamios porosos de solución de seda. <ol><li> Tamizar la NaCl granular para separar los gránulos de tamaño de 500-600 micras, que se utilizará en pasos posteriores. Deseche el gránulos de tamaño por debajo de 500 micras y por encima de 600 micras. (15 minutos) </li><li> Verter 30 ml de solución de seda 6% en el molde de politetrafluoroetileno (PTFE) (Figura 1). Esparcir suavemente 60 g de tamizado NaCl sobre la seda. Toque en el recipiente para obtener una capa uniforme de sal. Incubar 48 horas a RT para polimerizar el seda. </li><li> Coloque el molde de PTFE que contiene andamio en el horno a 60 ° C durante 1 hora para finalizar la polimerización y se evapore todo el líquido restante. </li><li> Coloque el contenido del molde de PTFE en un vaso de precipitados que contenía 2 L de agua destilada durante 48 horas para lixiviar la sal. Cambie el agua 2-3 veces al día. Retirar los andamios de esponja de los moldes cuando la sal está completamente lixiviado punto de detención:. Las esponjas se pueden almacenar sumergido en agua a 4 ° C en un recipiente cerrado para evitar que los andamios de la deshidratación. </li><li> Cuando esté listo, cortar los andamios con 5 mm punzón de biopsia de diámetro. Precortadas los andamios para alcanzar unos 2 mm de altura. PuNCH ​​a cabo el centro del andamio con el punzón de biopsia 2 mm de diámetro (Figura 2A). (1 hr) </li><li> Autoclave los andamios sumergidas en agua para esterilizarlos (ciclo de mojado, 121 ° C, 20 min) punto de detención:. Las esponjas se pueden almacenar sumergido en agua a 4 ° C en un recipiente cerrado para evitar que los andamios de la deshidratación. </li><li> Antes de la siembra de células planeado, sumerja los andamios en solución estéril 0,1 mg / ml de poli-D-lisina (PDL). Incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar los andamios 3 veces con tampón fosfato salino (PBS) para eliminar PDL no unido. (30 minutos) </li></ol></li></ol> 2. Aislamiento de rata neuronas corticales <ol><li> Diseccionar cortezas del día embrionario 18 ratas (E18) Sprague-Dawley como se describe anteriormente por Pacifici y Peruzzi 27 después de obtener animales protocolo aprobado. (2 hr) </li><li> Incubar 10 cortezas en 5 ml de tripsina al 0,25% con 0,3% de DNasa I (de páncreas bovino) durante 20 min a 37 ° C. </li><li> Inactivar la tripsina mediante la adición de un volumen igual de / proteína de soja ml 1 mg. </li><li> Se tritura las cortezas utilizando 10 ml de pipeta Pasteur por pipeteando arriba y abajo 20 veces hasta que se genera una suspensión de células individuales. Sea amable y evitar la formación de burbujas de aire. (10 minutos) </li><li> Centrifugar la suspensión celular a 127 xg durante 5 min. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento celular en 10 ml de medio de cultivo (medio Neurobasal, suplemento de B27 1x, 1x Glutamax, 1% penicilina / estreptomicina). Contar las células. La concentración celular esperada es de aproximadamente 2x10 7 / ml. (20 min) </li></ol> 3. Construir Asamblea y Cultura <ol><li> Andamios siembra con las células. <ol><li> Mueva los andamios estériles y todos los utensilios necesarios dentro de una campana de cultivo celular. Usando pinzas estériles colocan los andamios en una placa de cultivo celular de 96 pocillos de asignar un andamio por pocillo. (10 minutos) </li><li> Sumergir los andamios en medio de cultivo celular para equilibrar ellos antes de la cavidad de la semillaEn g. Incubar durante 1 hora a 37 ° C. (10 minutos) </li><li> Aspirar el exceso de medio a partir de los andamios. </li><li> Aplicar 100 l de suspensión de células / andamio. (10 minutos) </li><li> Se incuban las células a 37 ° CO / N para permitir la unión de las células al andamio. </li><li> A la mañana siguiente aspirar las células no inscritos y aplicar 200 l / pocillo de medio de cultivo fresco. (10 minutos) </li></ol></li><li> Andamio incrustación con matriz de colágeno. (2 hr) <ol><li> Coloque 10x PBS, agua, NaOH 1 N y cola de rata I colágeno en hielo. Preparar una solución de trabajo de colágeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mantener en hielo hasta las construcciones de células sembradas están listas (hasta 1 hora). </li><li> Retire las construcciones de seda sembrado de células de la incubadora y aspirar el exceso de medio. </li><li> Usando pinzas estériles transfieren los andamios a los pozos vacíos en la placa de bien y se sumergen cada andamio en 100 l de solución de colágeno 3 mg / ml. Coloque la placa de cultivo de tejidos de regresoen la incubadora durante 30 minutos para permitir la polimerización del colágeno. </li><li> Aplicar 100 l de medio de cultivo celular pre-calentado / pocillo. Cultura los constructos durante una semana cambiando el medio cada día mediante la sustitución de sólo la mitad del volumen del medio. </li></ol></li></ol> 4. Análisis de Microscopía <ol><li> Tinción vivo / muerto (1 hora) <ol><li> Preparar la solución madre de yoduro de propidio (PI) 1 mg / ml (1,5 mM) en agua destilada. </li><li> Preparar solución madre de diacetato de fluoresceína (FDA) 2 mg / ml en acetona. </li><li> Preparar la solución de trabajo que contiene 10 PI M y 0,15 M FDA diluido en PBS. Pre-calentar la solución a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Se lavan las células con PBS precalentado para eliminar las esterasas de suero. Aspirar el PBS. </li><li> Aplique la solución pre-calentado a trabajar en las células durante 2 minutos y lavar con PBS. </li><li> Utilice microscopio de epifluorescencia a la imagen de las células (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). La mancha se mantiene estable durante 40 min. Tinción prolongada puede resultar en la tinción inespecífica que resulta de la captación de PI por las células y co-localización de PI / FDA en las células. </li></ol></li><li> Inmunoticción <ol><li> En el punto de tiempo deseado de la cultura fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 30 min a TA. Debido a la toxicidad de la PFA humos de la etapa de fijación se debe realizar en la campana de humos química. </li><li> Lave los andamios con 3x PBS punto de detención:. Las construcciones fijas-PFA se pueden almacenar en PBS a 4 ° C durante varios días antes de proceder con nuevas medidas. </li><li> Incubar los andamios en el 0,2% Tritón, 0,25% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS que contenía anticuerpo primario O / N a 4 ° C. </li><li> El día siguiente descarta la solución de tinción y lavar los andamios 3 x 30 min con PBS para eliminar el anticuerpo primario no unido. </li><li> Se incuban las muestras con el anticuerpo secundario diluido en 0,2% Triton, 0,25% de BSA en PBS durante 2hr a RT. </li><li> Retirar la solución de tinción y lavar los andamios 3 x 30 min con PBS para eliminar el anticuerpo secundario no unido. </li><li> Imagen de los andamios utilizando un microscopio confocal con objetivo 20X tomando 100 micras z secciones de la muestra con 1 m paso. Para visualizar las neuritas delgadas la resolución de la imagen debe ser de un mínimo de 1.024 x 1.024 píxeles. </li></ol></li><li> ARN, ADN y el aislamiento de proteínas Nota: RNA, DNA y el aislamiento de proteínas se realiza usando un kit comercial DNA Mini AllPrep / ARN / proteína de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> Usando pinzas estériles transfieren los andamios de placa de cultivo a un tubo estéril de 2 ml. Coloque un andamio por tubo. </li><li> Añadir 200 l de tampón RLT a cada tubo. </li><li> Interrumpir el constructo fragmentando con micro tijeras estériles. </li><li> Para homogeneizar el tejido interrumpido, transferir el contenido del tubo para la columna de centrifugación. Haga girar durante 2 minutos a toda velocidad en una microcentrífuga.El lisado se homogeneizó a medida que pasa a través de la columna de centrifugación. </li><li> Recoger el flujo a través y utilizarla inmediatamente para aislar RNA, DNA y proteínas siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Cuantificar el rendimiento de los ácidos nucleicos cualquier otro método compatible (por ejemplo, NanoDrop). </li><li> Cuantificar el rendimiento de proteína utilizando ensayo de proteína BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Medir el resultado de ensayo usando lector de microplacas a 562 nm de longitud de onda. Nota: El rendimiento esperado de los ácidos nucleicos y proteína por construcción en relación con la densidad celular se muestra en la Figura 4. </li></ol></li></ol>

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La publicación de este video-artículo es patrocinado por Corning.

Aquí describimos las pautas para ensamblar un modelo de tejido 3D compartimentado similar al cerebro. El modelo se caracteriza por un cultivo denso y polarizado de neuronas que da como resultado el desarrollo de dos compartimentos morfológicamente diferentes: uno que contiene cuerpos celulares densamente empaquetados, el segundo que contiene redes axonales puras. En general, la arquitectura del andamio y el patrón de crecimiento imitan el tejido cortical del cerebro, incluidas las seis capas laminares y los tractos de materia blanca21.
El modelo de tejido a base de proteína de seda en forma de rosquilla permite modificar y ajustar las propiedades mecánicas, las formas estructurales versátiles, los rellenos de hidrogel y los componentes celulares. Por lo tanto, este modelo de tejido establece una plataforma base para una amplia gama de estudios. La seda es un candidato favorable para las plataformas de biomateriales debido a su biocompatibilidad, procesamiento a base de acuosos y robustas propiedades mecánicas y de degradación22. La matriz de seda también sirve como un ancla estable para reducir la contracción del gel de colágeno con el tiempo en cultivo. Las propiedades como la concentración de seda y la porosidad del andamio utilizado en este modelo se han ajustado previamente para lograr un crecimiento celular óptimo y propiedades mecánicas que dan como resultado una elasticidad tisular similar a la del cerebro18,23,24. Sugerimos mantener estos parámetros constantes para garantizar el resultado exitoso y la reproducibilidad de los experimentos.
La formación de la red neuronal 3D se logró combinando dos tipos de biomateriales con diferentes propiedades mecánicas: un andamio rígido para proporcionar anclaje neuronal y una matriz de gel más suave para permitir la penetración y conectividad de axones en 3D. Las preferencias selectivas de materiales del andamio de seda y el hidrogel blando proporcionan el principio subyacente para compartimentar las neuronas de las conexiones axonales. Debido a la naturaleza inerte del andamio de seda, se requiere funcionalización con poli-D-lisina para la unión neuronal. Sin embargo, se pueden aplicar otros factores promotores de la adhesión celular como RGD25 o fibronectina26. Para lograr la formación de la red 3D, el andamio de seda debe llenarse con hidrogel de manera oportuna tan pronto como las neuronas se adhieran al andamio. Asimismo, el relleno de la matriz de colágeno puede ser reemplazado por otros hidrogeles, lo que permite el estudio de la influencia de los entornos extracelulares 3D en la formación de redes axonales para servir como plataforma para evaluar nuevos hidrogeles en términos de compatibilidad neuronal. Además, además de las neuronas corticales de rata, se pueden utilizar otras fuentes neuronales como las neuronas del hipocampo o las neuronas derivadas de células pluripotentes inducidas (iPSc). Además, el modelo de tejido se puede utilizar para estudiar las interacciones heterocelulares mediante la inclusión de células gliales junto con neuronas y para construir tejidos similares al cerebro más complejos.
Como se mostró anteriormente, nuestro modelo se puede utilizar para evaluar la funcionalidad neuronal en microambiente 3D con una variedad de ensayos como viabilidad celular, expresión génica, LC-MS / MS y electrofisiología, lo que demuestra la relevancia fisiológica del modelo18. Otros métodos, que se utilizan con frecuencia para evaluar construcciones de ingeniería tisular en 3D, como la inmunotinción y la microscopía8,9,11 , también se pueden utilizar para evaluar la distribución celular y la extensión de la formación de redes axonales. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, debido a la alta densidad de la matriz de colágeno, la penetración de anticuerpos y la profundidad de las imágenes se limitan a unos pocos cientos de micrómetros. Además, la relación señal/ruido puede verse afectada por una fluorescencia de fondo inespecífica. Esto se puede superar mediante el uso de trazadores de células lipofílicas y proteínas fluorescentes expresadas genéticamente que disminuyen la necesidad de inmunotinción11. Alternativamente, la imagen se puede realizar con microscopía de 2 fotones en lugar de la técnica habitual de un fotón, que puede reducir la pérdida de señal, el fotoblanqueo y puede extenderse a varios cientos de micrómetros de profundidad.
En resumen, el tejido similar al cerebro a base de seda y colágeno ofrece una plataforma robusta para estudiar las redes neuronales en 3D y es un punto de partida para el desarrollo de modelos más avanzados de trastornos neurológicos en el futuro. Independientemente del modo de evaluación, la relativa simplicidad de este modelo de tejido respalda su utilidad, éxito y reproducibilidad.

El sistema nervioso central (CNS) puede ser afectada por una variedad de trastornos que implican vascular, estructural, funcional, infeccioso o degenerativo. Se estima que unos 6,8 millones de personas mueren cada año como consecuencia de los trastornos neurológicos, lo que representa una carga socioeconómica en crecimiento en todo el mundo 1. Sin embargo, sólo unos pocos de los trastornos tienen tratamientos disponibles. Por lo tanto, hay una necesidad crítica de estrategias terapéuticas innovadoras para pacientes que sufren de trastornos neurológicos. Desafortunadamente, muchas terapias orientados SNC fracasan durante los ensayos clínicos, en parte debido a la utilización de los modelos de investigación pre-clínicos inadecuados, que no permiten la evaluación de los efectos agudos y crónicos con lecturas funcionales fisiológicamente relevantes. A pesar de los esfuerzos de investigación significativos en las últimas décadas, hay una gran cantidad desconocida acerca de la estructura y función del sistema nervioso central. Con el fin de obtener más conocimientos, modelos animales son frecuentemente nosed modelar estados patológicos, tales como lesión cerebral traumática (TBI) o demencia, sobre todo en los estudios preclínicos. Sin embargo, los animales difieren significativamente de los seres humanos, tanto en la anatomía del sistema nervioso central, así como en función, expresión génica y el metabolismo 2-4. Por otra parte, los cultivos 2D in vitro son el método común para investigar la biología celular y se utilizan de forma rutinaria para el descubrimiento de fármacos. Sin embargo, los cultivos celulares 2D carecen de la complejidad y la relevancia fisiológica en comparación con cerebro humano 5-7. Mientras que no hay sustituto para el bajo costo y la sencillez de los estudios de cultivo celular en 2D o la complejidad proporcionada por los modelos animales, la ingeniería de tejidos 3D podría generar mejores modelos de investigación para cerrar la brecha que existe entre el 2D in vitro e in vivo enfoques. La ingeniería de tejidos 3D proporciona condiciones experimentales más fisiológicamente relevantes obtenidos por las interacciones célula-célula en 3D y señales extracelulares proporcionadas por los biomateriales. Despite la evidencia significativa detrás del valor de las culturas en 3D, en la actualidad hay sólo unos pocos modelos de tejido 3D SNC como madre derivadas de células culturas organoides 8-10, neurospheroids 11 y se dispersaron culturas hidrogel 12,13. Métodos técnicos avanzados, incluyendo la litografía de múltiples capas 14, y la impresión 3D 15 se han utilizado para el estudio de los pulmones, el hígado y el tejido renal. Sin embargo, hay una falta de modelos 3D del SNC que permitan el crecimiento neuronal compartimentada, como imitando la arquitectura cortical y la biología. Separado el crecimiento de las neuritas de los cuerpos celulares neuronales se ha demostrado previamente en cultivos 2D mediante el uso de microfabricación 16,17 permitiendo el estudio de rastreo tracto axón, el influjo de calcio, arquitectura de red y actividades. Esta idea nos inspiró para desarrollar un tejido neural polarizado 3D donde se encuentran los cuerpos celulares y tractos axonales en diferentes compartimentos que imitan la arquitectura de capas del cerebro 18 </sup&gt;. Nuestro enfoque se basa en el uso de diseño único andamio de seda que tiene capacidad de alta densidad de células en un volumen confinado y permite consecuencia de densa red axonal en un gel de colágeno. Aquí se demuestra el procedimiento de montaje completo del tejido cerebral como incluyendo la fabricación de andamios y la cultura neuronal.

<table><tbody><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223530</td><td></td></tr><tr><td></td><td>LiBr Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>MWCO 3500 casetes de diálisis&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>66110</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Fisher Scientific</td><td>Centrífuga Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>5804 R</td><td>Tamiz Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Nº 270, Nº 35, Nº 30</td></tr><tr><td>Molde</td><td></td><td></td> de PTFE <td>fabricado internamente (<fuerte>Figura 1</fuerte>) 10 cm de diámetro, 2 cm de altura</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia 5&#160; mm</td><td>Instrumento de precisión mundial</td><td>501909</td><td></td></tr><tr><td>punzón de biopsia 2&#160; mm</td><td>Instrumento de precisión mundial</td><td>501908</td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>concentración final 10&#160; &#956; g/ml, disuelto en agua</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNasa</td><td>Roche 10104159001</td><td></td><td>concentración final 0,3%</td></tr><tr><td>Proteína de soja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522-100MG</td><td>concentración final 1&#160; mg/ml</td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>calentar hasta 37&#160; &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>B27 suplemento 50x</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I, cola de rata, 100&#160; mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>concentración final 3&#160; mg/ml</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>corrosivo</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-10MG</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>Diacetato de fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Olympus MVX10</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>tóxico, concentración final 4%</td></tr><tr><td>Bovino Albúmina sérica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>anti-& beta; IIITubulina anticuerpo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2200</td><td>conejo 1:500</td></tr><tr><td>anti-conejo Alexa-546</td><td>Sondas moleculares</td><td>A11010</td><td>suero de cabra 1:250</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 microscopio confocal</td><td>Leica</td><td></td><td>objetivo 20X</td></tr><tr><td>QIAtrituradora</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep ADN/ARN/Proteína Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico, puro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c/2000 Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de proteínas BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas Spectramax M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>absorbancia 562 nm</td></tr><tr><td>Micro Tijeras, Económicas, Tipo Vannas</td><td>TedPella</td><td>1346</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo de polarizado neural tisular basada silk-colágeno-engineered 3d

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

A pesar de los enormes esfuerzos por descifrar la anatomía, composición y función del cerebro, sigue siendo el órgano menos comprendido del cuerpo humano. Para obtener una comprensión más profunda del sistema neuronal, los científicos pretenden reconstruir de manera simplista el tejido ensamblándolo in vitro a partir de bloques de construcción básicos utilizando un enfoque de ingeniería de tejidos. Nuestro grupo desarrolló un modelo 3D similar al cerebro basado en seda y colágeno que se asemeja a la materia blanca y gris de la corteza. El modelo consiste en una esponja porosa de seda, que se presiembra con neuronas derivadas del cerebro de rata, inmersas en una matriz de colágeno suave. Se observa el crecimiento neuronal polarizado y la formación de redes con localización axonal y de cuerpo celular por separado. Esta arquitectura compartimentaria permite el desarrollo único de nichos que imitan el tejido neuronal nativo, lo que permite la investigación sobre el ensamblaje de redes neuronales, la guía axonal, las interacciones célula-célula y célula-matriz y las funciones eléctricas.

Solid esponjas de seda de precorte a la forma de rosquilla representa una idea única y simple para lograr una arquitectura compartimentada se asemeja tejido neural (Figura 2A). La estructura altamente porosa del andamio con el tamaño de poro de aproximadamente 500 micras en el área de resultados excepcionalmente alta superficie que permiten la siembra y el crecimiento de células de alta densidad dentro de un pequeño volumen (2x10 7 / ml) (Figura 2B). Además, la alta porosidad del andamio permite la difusión irrestricta de nutrientes y desechos resultantes de la viabilidad superior de los cultivos de células densas más de marcos de tiempo extendidos. Tras la siembra de las neuronas adjuntar rápida y uniformemente a la superficie de los poros de andamios. Después de la unión celular es completa y las células se equilibran en el sustrato de seda, el andamio esponja se llena con la matriz de colágeno suave con el fin de proporcionar un entorno 3D para la formación de la red axonal (Figura 3 </strong&gt;). En ausencia de la matriz de colágeno de la compartimentación de los axones y cuerpos celulares no es posible, ya que las neuronas crecen extensiones sólo en la superficie de los poros que resultan en redes mixtas como se encuentra con las superficies 2D (Figura 3B). En contraste, el gel de colágeno proporciona una malla que soporta extensa crecimiento axonal en 3D, mientras que los cuerpos celulares neuronales permanecer unidos a la andamio de seda (Figura 3C). Este patrón de crecimiento conduce a la compartimentación de los cuerpos celulares y redes axonal puros (Figura 3D), que se asemeja a la materia gris y blanca de la corteza del cerebro. Aparte de microscopía, las construcciones se pueden evaluar con una variedad de otros métodos 18, dependiendo de la pregunta detrás del experimento. Por ejemplo, el aislamiento de ADN, ARN y proteínas de las construcciones se puede realizar fácilmente utilizando kits comerciales (Figura 4). El rendimiento de ácidos nucleicos y de proteínas PEr constructo depende del número de células sembradas inicialmente en los andamios de seda. Los más células sembradas mayor es el rendimiento de ADN, ARN y proteínas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig1.jpg" /> Figura 1. molde de PTFE utilizado para la preparación de andamios esponja de seda Las dimensiones:.. 10 cm de diámetro, 2 cm de altura <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig2.jpg" /> Figura 2. 3D modelo de tejido cerebral similares. (A) poroso andamio esponja seda. (B) en vivo tinción / muertos de las neuronas en el día 1 en la siembra en andamio de seda antes de colágeno incrustar (células-verde vivo, células de color rojo-muertos). Los paneles en el lado derecho muestran la magnification del área capturada en cuadros rojos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig3.jpg" /> Figura 3. Neuronal consecuencia compartimentada en el modelo de tejido cerebral como 3D (A) compartimentos de andamios:. Compartimiento del cuerpo de las células rojas, compartimento azul-axonal. (B) el patrón de crecimiento neuronal en el día 1 tras la siembra antes de la incrustación de colágeno. (C). Consecuencia neuronal en el día 7 tras la siembra en el compartimiento del cuerpo celular. (D) consecuencia neuronal en el día 7 tras la siembra en el compartimiento axonal. Verde -. ΒIIITubulin <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta</a>cifra. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig4.jpg" /> Figura 4. Rendimiento esperado de (A) ARN y ADN y proteínas (B) por construcción en relación con la cantidad de células sembradas por andamio (± DE, n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .</a>

La comprensión de las complejas acciones del cerebro requiere herramientas de investigación avanzadas. Aquí demostramos un novedoso modelo de ingeniería 3D basado en colágeno de seda de tejido neuronal que se asemeja a una arquitectura similar a la del cerebro. El modelo se puede utilizar para estudiar el ensamblaje de redes neuronales, la guía axonal, las interacciones célula-célula y la actividad eléctrica.

Modelo de polarizado Neural tisular basada Silk-colágeno-Engineered 3D

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el proceso de ingeniería de tejidos tridimensionales similares al cerebro. Esto se logra primero preparando andamios porosos a partir de una solución de seda mediante una técnica de lixiviación con sal. El segundo paso consiste en cortar previamente los andamios en formas de dona y prepararlos para el cultivo celular mediante esterilización y recubrimiento con poli-d-lisina o PDL.A continuación, los andamios preparados se siembran con neuronas corticales primarias de rata recién aisladas. El paso final consiste en la inclusión de los andamios en colágeno y su transferencia a las placas de cultivo. Finalmente, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia para mostrar el crecimiento neuronal y el desarrollo de redes neuronales.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de enfermedades que afectan el cerebro, ya que puede utilizarse como base para desarrollar nuevos modelos de investigación de Parkinson o Alzheimer. Antes de comenzar, prepare la solución de seda al 6 % como se describe en el protocolo del texto y almacénela a cuatro grados Celsius. Para preparar andamios porosos, primero tamice la sal de cloro sódico granular y recolecte los granulos con un diámetro entre 500 y 600 micrómetros.Vierta 30 mililitros de la solución de seda en el molde de politetrafluoroetileno o PTFE, y luego espolvoree uniformemente 60 gramos de cloruro de sodio tamizado sobre la solución. Incube durante 48 horas a temperatura ambiente para polimerizar la seda.Coloque el andamio que contiene el molde en un horno ajustado a 60 grados Celsius durante una hora para finalizar la reticulación de la seda y evaporar cualquier líquido residual. A continuación, sumerja la combinación de molde y andamio en un vaso de precipitados de dos litros con agua destilada durante 48 horas. Para eliminar la sal, cambie el agua de dos a tres veces por día.Retire el andamio del molde y córtelo en trozos pequeños. Primero utilice un punzón de biopsia de cinco milímetros de diámetro. Luego corte el andamio para que tenga dos milímetros de altura y retire el centro de cada pieza con un punzón de biopsia de dos milímetros.Somete los andamios a autoclave en un ciclo húmedo durante 20 minutos. Dentro de una cabina de cultivo celular, coloca un par de pinzas esterilizadas, medio de cultivo celular y los andamios autoclavados. Retira una placa de 96 pocillos de su envoltorio y colócala dentro para sembrar los andamios.Coloque primero un andamio estéril por pocillo. En la placa de 96 pocillos, agregue medio de cultivo celular para sumergir los andamios e incube a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo de tejidos para equilibrarlos durante al menos 30 minutos. Tras la incubación, aspire el medio en exceso de los andamios.Luego, agregue dos veces 10 a la sexta de células neuronales corticales de rata en 100 microlitros de medio neurobasal por andamio. Devuelva la placa al incubador y déjela durante la noche para permitir que las células se adhieran al andamio. A la mañana siguiente.Aspire cuidadosamente las células no adheridas y reemplace con 200 microlitros de medio fresco de cultivo celular. Incube a 37 grados Celsius durante un período breve. A continuación, aspire el medio de los pocillos utilizando pinzas estériles.Transfiera los andamios que contienen células a pocillos vacíos de la placa de 96 pocillos y luego agregue a cada andamio 100 microlitros de solución de colágeno de cola de rata, recién diluida y fría con hielo, a tres miligramos por mililitro. Regrese las células al incubador a 37 grados Celsius para permitir la polimerización del colágeno durante 30 minutos.Retire la placa del incubador y agregue 100 microlitros de medio de cultivo celular precalentado por pocillo. Devuelva la placa al incubador durante el período deseado de crecimiento celular, reemplazando la mitad del medio de cada pocillo con medio fresco cada día durante hasta una semana.En estos andamios altamente porosos, las células neuronales pueden cultivarse hasta una alta densidad, como se muestra. A continuación se presentan los resultados de viabilidad celular. Un día después de la siembra, las células vivas marcadas con diacetato fluorescente aparecen en verde y el yoduro de propidio y el andamio de seda.En rojo, observe el alto porcentaje de células vivas observadas bajo baja magnificación. Esta figura muestra la compartimentalización de los cuerpos celulares neuronales y los procesos axonales dentro del andamiaje con forma de rosquilla. Los cuerpos celulares neuronales permanecen adheridos al andamiaje de seda, como se ve aquí un día después de sembrar las células, las cuales fueron inmunomarcadas para la tubulina beta tres y aparecen en verde.Como era de esperar, las células han colonizado densamente el andamiaje al séptimo día de cultivo. En contraste, la matriz de colágeno en la cavidad central del andamiaje proporciona soporte para un crecimiento axonal extenso. Se muestra aquí la red axonal.Siete días después de la siembra. Este video muestra un corte Z confocal de la ventana central de colágeno del andamiaje que contiene las células de la red neural marcadas mediante tinción para la tubulina beta tres. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar los constructos de tejido tridimensional similares al cerebro.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este video muestra la creación de un modelo de tejido neuronal polarizado en 3D utilizando andamios de seda-colágeno. Detalla el proceso de siembra de células neuronales en andamios de seda porosa, la incubación para la unión celular, la incrustación del andamio con colágeno y subraya la importancia de la matriz de colágeno de soporte en la formación de un modelo de tejido neuronal polarizado en 3D.

Desarrollo de un modelo 3D de tejido neural polarizado basado en seda y colágeno

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