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El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un modelo in vitro de la función contráctil del músculo liso que pueda utilizarse para estudiar los mecanismos de las disfunciones vasculares, como los vasoespasmos cerebrales, en escalas de tiempo relevantes para la enfermedad. Esto se logra con películas delgadas musculares vasculares a largo plazo mediante la preparación primero de sustratos de elastómero mediante deslizamientos de recubrimiento de rotación en serie con una tira de piam seguido de PDMS. El segundo paso es utilizar un dispositivo de deposición microfluídica para depositar en serie genina y fibronectina en la superficie.

Con el fin de proporcionar pistas de orientación para la autoorganización del tejido en películas delgadas vasculares y musculares, el paso final es realizar un ensayo de contractilidad mediante la maldición de películas delgadas vasculares y musculares que inducen la contracción y la relajación de la contracción mientras se obtienen imágenes de la muestra. En última instancia, este enfoque produce tejidos que mantienen la fidelidad estructural y la contractilidad funcional durante un máximo de dos semanas en cultivo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las películas delgadas musculares impresas por microcontacto, es que la integridad del tejido y la contractilidad funcional se mantienen durante semanas, mientras que los tejidos construidos con métodos anteriores comienzan a degradarse después de tres o cuatro días.

En cultura, este método proporciona una plataforma para estudiar cuestiones clave en la enfermedad vascular, como la forma en que se altera la mecánica funcional de las arterias durante la progresión de la enfermedad crónica. Aquí estamos estudiando la mecánica vascular, pero este método se puede aplicar a otros sistemas de órganos modelo, como las tecnologías de chips de órganos para la función recapitulativa, cardíaca o del músculo esquelético. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando nos propusimos estudiar las disfunciones vasculares de desarrollo lento y descubrimos que los métodos actuales no se podían usar para cuantificar la función de las células del músculo liso vascular o no mantenían la integridad durante un período de tiempo suficiente.

La deposición microfluídica de Jin proporciona una plantilla para la autoorganización celular de una manera similar a la de la impresión por microcontacto, pero también permite que los tejidos patrón mantengan su estructura e integridad durante escalas de tiempo apropiadas para estudiar la remodelación vascular. Para comenzar a limpiar, un lote de cubreobjetos de vidrio de 25 milímetros de diámetro, como se describe en el protocolo de texto adjunto, cubra los bordes de los cubreobjetos limpios colocando cinta adhesiva en sus lados, dejando una tira de vidrio expuesta en el centro. A continuación, corte los deslizamientos de la tapa del plato y colóquelos uno a la vez en un mandril recubierto de centrifugado.

Con pinzas, agregue 150 microlitros de una solución al 10% de perfil de isopo de poli N. Acrilamida, también llamada poly pam o Piam, disuelta en un butanol. Asegúrese de cubrir completamente el área expuesta del cubreobjetos.

A continuación, encienda el centrifugador y aumente la velocidad durante 10 segundos hasta 3000 RPM. Espere cinco segundos y luego aumente durante 10 segundos hasta 6.000 RPM. Espere a 6.000 RPM durante un minuto y luego vuelva a bajar a 3000 RPM durante 10 segundos.

Sosteniéndolo allí durante cinco segundos antes de terminar el ciclo de recubrimiento giratorio. Una vez seca, retire con cuidado la cinta adhesiva de todos los cubreobjetos, dejando expuesto todo el cubreobjetos con una fina capa de recubrimiento de piam en el centro del cubreobjetos de vidrio. A continuación, aplica una capa de Degas PDMS en cada cubierta.

Deslízalos y séralos en un horno a 90 grados centígrados durante al menos 1,5 horas. Diseñe una fotomascarilla microfluídica de tejidos y, a continuación, prepare una oblea de silicio de patrón como se describe en el protocolo de texto adjunto. Una vez modelado, coma la oblea utilizando técnicas estándar y colóquela con el lado de la característica hacia arriba en una placa de Petri.

Siguiente mezcla y DGA 100 gramos de PDMS Con una proporción de reticulante basada en 10 a uno, introduzca el PDMS en el plato por completo y de manera uniforme cubriendo la oblea estampada. Coloque el plato en una desecación al vacío durante aproximadamente 30 minutos hasta que se eliminen todas las burbujas de aire. A continuación, cure el PDMS en el plato a 90 grados centígrados durante al menos 1,5 horas.

Una vez curado, corte el exceso de PDMS y retire lentamente el PDMS estampado restante del lado del patrón de la oblea. Corta el exceso de PDMS alrededor de los patrones con una cuchilla de afeitar y dale forma a los dispositivos en rectángulos para ayudar a quitar el dispositivo en pasos posteriores. A continuación, utilice un punzón de biopsia quirúrgica de un milímetro para formar los orificios de entrada y salida.

Sonicar dispositivos microfluídicos en etanol al 70% durante al menos 30 minutos antes de cada uso. Coloque hasta 10 cubreobjetos de sustrato de película delgada muscular vascular en un limpiador de ozono ultravioleta durante ocho minutos. A continuación, prepare una solución de genina de cinco miligramos por mililitro añadiendo un mililitro de agua bidestilada estéril a un recipiente de cinco miligramos de genina liofilizada.

Mezcle la solución con un mezclador de vórtice y deje el vial a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Coloque los dispositivos microfluídicos limpios con la función hacia abajo en cada cubierta. Deslízate de uno en uno.

Presione firmemente los dispositivos para asegurar un sellado hermético a los cubreobjetos recubiertos de PDMS. Coloque rápidamente una gota de etanol al 70% en la entrada de cada dispositivo para el cebado del dispositivo. Después de cinco a 10 minutos, aspire cuidadosamente el exceso de etanol en la entrada y reemplácelo inmediatamente con aproximadamente 100 microlitros de PBS.

Use una aspiradora para extraer PBS a través de la salida de los dispositivos para enjuagar el etanol. Deténgase cuando solo quede una pequeña cantidad de PBS en la entrada. A continuación, coloque 60 microlitros de la solución de genina de cinco miligramos por mililitro en cada entrada, extraiga la solución de genina a través de los dispositivos sustituyendo una punta de aspirador de vacío en la salida.

Detenga la succión cuando solo quede una pequeña cantidad de solución en la entrada. A continuación, coloque gotas de PBS tanto en la entrada como en la salida para evitar que la solución se seque. Durante la incubación, mueva el plato que contiene los dispositivos a un horno humidificado o incubadora a 37 grados centígrados e incube durante cuatro horas.

Durante la incubación, vuelva a suspender la fibronectina a una concentración de 50 microgramos por mililitro en agua estéril de doble destilación y colóquela en hielo durante al menos 30 minutos después de la incubación con Jin. Extraiga a través de o, pero una cantidad mínima de PBS en la entrada. Siguiente lugar, 100 microlitros de una solución de fibronectina de 50 microgramos por mililitro.

En cada entrada, extraiga la solución a través de los dispositivos con una punta de aspirador de vacío. En la salida, mueva el plato destapado que contiene los dispositivos a un horno o incubadora configurado a 37 grados centígrados e incube durante 24 horas. Después de la incubación, retire con cuidado los dispositivos de los cubreobjetos despegando lentamente el dispositivo en una esquina mientras sujeta ligeramente el cubreobjetos con la mano opuesta, coloque los cubreobjetos en platos estériles de seis pocillos.

Agregue al menos cinco mililitros de solución de estreptomicina de penicilina a cada pocillo y luego coloque los platos en una incubadora estéril a 37 grados centígrados durante al menos 30 minutos. Después de la esterilización, aspire la solución de estreptomicina de penicilina y siembre los cubreobjetos con células cultivadas de músculo liso vascular de la arteria umbilical humana a una concentración de 80.000 células por centímetro cuadrado. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante al menos 24 horas antes de la prueba.

Para comenzar la prueba, coloque una muestra de tejido en un plato de 100 milímetros. Añada una solución estéril precalentada a pH 7,4 para cubrir la muestra. El uso de una cuchilla de afeitar realiza varios cortes paralelos a través de la hoja de celda perpendiculares al borde del brazo de la tubería.

Haga cortes que produzcan secciones de tejido más anchas de unos dos milímetros de grosor. Serán las finas películas musculares vasculares alternadas con tiras finas que se retirarán posteriormente. Luego gire el plato 90 grados y haga dos cortes rectos paralelos en el medio del tejido paralelos a la tira de piam.

Retire las tiras delgadas entre las películas vasculares, musculares y delgadas para evitar que las películas adyacentes entren en contacto. A continuación, coloque la antena en una plataforma de temperatura controlada en la platina del microscopio estereoscópico y comience a capturar imágenes de luz fluorescente, transmitidas y de lapso de tiempo en los intervalos deseados durante todo el ensayo de tratamiento. Tratar en serie las películas delgadas musculares vasculares con 50 nanomolares de endotelio, uno durante 20 minutos para inducir contracciones, seguido de 100 micromolares de HA 10 77 durante 30 minutos para inducir la relajación al enfriarse por debajo de los 32 grados Celsius.

Piam se disuelve liberando las finas películas musculares vasculares. La medición de la longitud de proyección se puede convertir a un radio de curvatura, se utiliza para calcular la tensión promedio en la capa celular en la película que se muestra aquí en las imágenes secuenciales de luz transmitida de un ensayo de contractilidad representativo. Estas imágenes se pueden convertir en valores de tensión a partir de los cuales se calcula el tono basal y la contractilidad inducida.

En este vídeo, se muestra un lapso de tiempo representativo de un ensayo de contractilidad completo. Las películas delgadas musculares alcanzan el equilibrio contráctil, luego se contraen aún más con la adición de endotelio molar de 50 nyla. Una película se relaja después de la adición de 100 micromolares ha 10 77.

La ligera caída en el tono basal y la contractilidad tisular al final del ensayo es probablemente el resultado directo de la reducción del número de células que componen el tejido. Dado que las células del músculo liso vascular hambrientas de suero no proliferan, aquí se muestran imágenes de contraste de fase de células de músculo liso cultivadas en superficies modificadas con genina en varios puntos de tiempo de sacrificio que van desde un día hasta dos semanas. En este caso, se utilizó la inmunohistoquímica para resaltar la confluencia y el alineamiento celular de los tejidos mediante la tinción de los filamentos de actina F de color verde después de uno, cuatro y siete días de inanición sérica.

La evaluación cuantitativa de la confluencia tisular en este rango de tiempo mostró un deterioro mínimo en estas superficies. Se cuantificó la alineación de los filamentos de factina y se confirmó que la alineación se mantuvo durante las dos semanas. En cultivo, una vez dominada esta técnica de fabricación de tejido in vitro se puede realizar en dos días.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe comenzar la deposición microfluídica un día antes de la siembra celular anticipada y mantener una temperatura fisiológica constante durante los experimentos con película de aletas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos bioquímicos tradicionales como la transferencia Western blot y la PCR para estudiar los cambios en la expresión de proteínas y genes para correlacionar el fenotipo celular con el comportamiento funcional. Esta técnica allana el camino para que los investigadores exploren la progresión de las disfunciones vasculares de desarrollo lento, como el vasoespasmo cerebral, la hipertensión y la aterosclerosis, y modelos in vitro de la pared arterial humana.