Name: Microfluidic genipina Deposición Técnica de Cultura extendido de micropatterned vasculares musculares Thin Films (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprende a fabricar películas musculares vasculares mediante deposición microfluídica de genipina y fibronectina sobre sustratos de PDMS. Este método mantiene la contractilidad del tejido hasta dos semanas para estudiar disfunciones vasculares.

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Agradecemos el apoyo financiero de la Beca de Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón, 13SDG14670062 (PWA) y la Beca de Disertación Doctoral de la Universidad de Minnesota (ESH). También reconocemos los recursos de microfabricación del Minnesota Nano Center (MNC) y los recursos de procesamiento de imágenes de los Centros Universitarios de Imágenes (UIC), ambos de la Universidad de Minnesota. Partes de este trabajo se llevaron a cabo en el Centro de Caracterización de la Universidad de Minnesota, que recibe apoyo parcial de NSF a través del programa MRS.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A continuación, presentamos un protocolo que se basa en la tecnología vMTF desarrollado previamente, lo que permite tiempos de experimentación extendidos más típica de las vías de enfermedades vasculares crónicas 1,23,24. Para lograr esto, micropatrón genipina, que ha sido previamente demostrado para proporcionar funcionalización a largo plazo de sustratos PDMS 11, utilizando una técnica de deposición de microfluidos para producir laminillas arterial Engineered con la mejora de la viabilidad del te...

Las enfermedades vasculares, tales como vasoespasmo cerebral 1,2, hipertensión 3, 4 y la aterosclerosis, se desarrollan lentamente, son típicamente de naturaleza crónica, e implican disfuncional fuerza generación por las células del músculo liso vascular (CMLV). Nuestro objetivo es estudiar estos lento que progresan disfunciones vasculares utilizando métodos in vitro con un mayor control de las condiciones experimentales que en modelos in vivo. Hemos desarrollado previamente películas finas musculares vasculares (vMTFs) para la medición de la contractilidad funcional de in vitro diseñados tejidos cardiovasculares 5, pero este método se ha limitado a relativamente estudios a corto plazo. A continuación, presentamos una técnica de modificación del sustrato que se expande nuestra técnica anterior vMTF para mediciones a largo plazo. Mientras que el endotelio es también crítico en la función vascular en general, laminillas arterial ingeniería proporcionan un sistema modelo útil para evaluar los cambios en vascularcontractilidad durante la progresión de la enfermedad. Para diseñar un modelo de tejido de la enfermedad vascular funcional, tanto la estructura y la función de la lámina arterial, la unidad contráctil básico de la embarcación, se debe recapitula con alta fidelidad. Laminillas arterial son láminas concéntricas, circunferencialmente alineados de CMLV contráctiles separadas por láminas de elastina 6. La impresión por microcontacto de (ECM), las proteínas de la matriz extracelular sobre sustratos de polidimetilsiloxano (PDMS) se ha utilizado anteriormente para proporcionar señales de orientación para la organización del tejido para imitar alineado tejido cardiovascular 5,7-10. Sin embargo, los tejidos modelados utilizando impresión por microcontacto puede perder la integridad después de 3-4 días de cultivo, lo que limita su aplicabilidad en estudios crónicos. Este protocolo proporciona una solución a este problema mediante la sustitución de las técnicas de impresión por microcontacto anteriores con una nueva técnica de deposición de microfluidos. Genchi et al. PDMS sustratos modificados con genipina y found prolongada viabilidad de miocitos hasta un mes en la cultura 11. Aquí, se utiliza un enfoque similar para extender la cultura de las células del músculo liso vascular estampadas en PDMS. Genipina, un derivado hidrolítica natural de la fruta gardenia, es un candidato deseable para la modificación de sustrato debido a su toxicidad relativamente baja en comparación con agentes de reticulación similares y su creciente uso como un biomaterial en los campos de la reparación de tejidos y la modificación 12,13 ECM 14, 15. En este protocolo, la fibronectina se utiliza como una señal de orientación celular, como en métodos de impresión por microcontacto anteriores; sin embargo, genipina se deposita sobre PDMS sustratos antes de patrón fibronectina. Por lo tanto, como las células degradan la matriz de estampado, ECM recién sintetizado a partir de CMLV adjuntos se puede unir al sustrato PDMS genipina-revestido. Este protocolo utiliza un dispositivo de suministro de microfluidos para el de dos pasos genipina y ECM deposición. El diseño de la microfluidos imita dispositivo microcopatrones de impresión ntact utilizados para laminillas arterial ingeniería en estudios previos 16. Por lo tanto, esperamos que este protocolo para dar imita laminillas arterial que recapitular con éxito el alineado altamente en la estructura y la función contráctil vivo de laminillas arterial. También evaluamos la contractilidad del tejido que confirmar que genipina es un compuesto de modificación sustrato adecuado para largo plazo en modelos de enfermedades vasculares in vitro.

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com/</a></td><td>72239-04</td></tr><tr><td>Cubreobjetos para microscopio - 25 mm</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com</a></td><td>12-545-102</td></tr><tr><td>Poli(N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>#21458</td></tr><tr><td>1-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>360465</td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>Specialty Coating Systems, Inc.</td><td><a href="http://www.scscoatings.com/">www.scscoatings.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Adhesivos Ellsworth (Dow Corning)</td><td><a href="http://www.ellsworth.com/">www.ellsworth.com</a></td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td></tr><tr><td>Microperlas fluorescentes</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>17151</td></tr><tr><td>Obleas de silicio</td><td>Wafer World, Inc.</td><td><a href="http://www.waferworld.com/">www.waferworld.com</a></td><td>2398</td></tr><tr><td>Fotorresistencia&nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td>Alineador de <td></td></tr><tr><td>mascarillas de contacto</td><td>Suss MicroTec</td><td><a href="http://www.suss.com/">www.suss.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Desarrollador</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Tridecafluro-triclorosilano</td><td>UCT Specialties, Inc.</td><td><a href="http://www.unitedchem.com/">www.unitedchem.com</a></td><td>T2492</td></tr><tr><td>Punzón de biopsia quirúrgica</td><td>Integra LifeSciences Corp.</td><td><a href="http://www.miltex.com/">www.miltex.com</a></td><td>33-31AA-P/25</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Cayman Chemical</td><td><a href="http://www.caymanchem.com/">www.caymanchem.com</a></td><td>10010622</td></tr><tr><td>1X solución salina tamponada con fosfato</td><td>Mediatech, Inc.</td><td><a href="http://www.cellgro.com/">www.cellgro.com</a></td><td>21-031-CV</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Corning, Inc.</td><td><a href="http://www.corning.com/">www.corning.com</a></td><td>356008</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies, Inc.</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">www.lifetechnologies.com</a></td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Células del músculo liso de la arteria umbilical</td><td>Lonza</td><td><a href="http://www.lonza.com/">www.lonza.com</a></td><td>CC-2579</td></tr><tr><td>Componentes de la solución de Tyrode</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>varios</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td><td>4350020000000000</td></tr><tr><td>Plataforma de temperatura controlada</td><td>Warner Instruments</td><td><a href="http://www.warneronline.com/">www.warneronline.com</a>641659</td><td>; 640352; 641922</td></tr><tr><td>Endotelina-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>E7764-50UG</td></tr><tr><td>HA-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>H139-10MG</td></tr></tbody></table>

microfluidic genipina deposición técnica de cultura extendido de micropatterned vasculares musculares thin films

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

La naturaleza crónica de la progresión de la enfermedad vascular requiere el desarrollo de técnicas experimentales que simulen comportamientos vasculares fisiológicos y patológicos en escalas de tiempo relevantes para la enfermedad. Anteriormente, la impresión por microcontacto se ha utilizado para fabricar imitaciones arteriales funcionales bidimensionales a través del patrón de proteínas de la matriz extracelular como señales de guía para la organización de los tejidos. Las películas delgadas de músculo vascular utilizaron estos imitadores para evaluar la contractilidad funcional. Sin embargo, la técnica de fabricación de impresión por microcontacto utilizada suele incorporar sustratos hidrófobos de PDMS. A medida que el tejido gira sobre la matriz extracelular subyacente, las nuevas proteínas deben sufrir un cambio conformacional o desnaturalización para exponer los residuos de aminoácidos hidrofóbicos a las superficies hidrofóbicas de PDMS para su adhesión, lo que resulta en una bioactividad alterada de la proteína de la matriz, delaminación y muerte de los tejidos.
Aquí, presentamos una técnica de deposición microfluídica para el modelado del compuesto reticulante genipina. La genipina sirve como intermediario entre los tejidos modelados y los sustratos de PDMS, lo que permite que las células depositen la proteína de la matriz extracelular recién sintetizada en una superficie más hidrófila y permanezcan unidas a los sustratos de PDMS. También demostramos que las proteínas de la matriz extracelular se pueden modelar directamente sobre la genipina depositada, lo que permite dictar la estructura del tejido modificado. Los tejidos fabricados con esta técnica muestran una alta fidelidad tanto en la alineación estructural como en la función contráctil del tejido muscular liso vascular en un modelo de película delgada muscular vascular. Esta técnica puede extenderse utilizando otros tipos de células y proporciona el marco para el estudio futuro de la funcionalidad crónica a nivel de tejidos y órganos.

El objetivo principal de este trabajo fue extender la viabilidad de CMLV micropatterned sobre sustratos PDMS hidrofóbicas. Esto se logró mediante la incorporación de un sistema de entrega de microfluidos para depositar genipina modelado y fibronectina en PDMS (Figura 1). La deposición de proteínas ECM utilizando la entrega de microfluidos dio de alta transferencia de la fidelidad de la pauta canal con PDMS desnudas entre líneas de genipina y fibronectina (Figura 1D). Las células unidas ...

Presentamos un método para la deposición microfluídica de genipina y fibronectina modeladas en sustratos de PDMS, lo que permite una mayor viabilidad de los tejidos densos de células de músculo liso vascular. Este método de fabricación de tejido se combina con la tecnología previa de película delgada muscular vascular para medir la contractilidad vascular a lo largo de cursos de tiempo relevantes para la enfermedad.

Microfluidic genipina Deposición Técnica de Cultura extendido de micropatterned vasculares musculares Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un modelo in vitro de la función contráctil del músculo liso que pueda utilizarse para estudiar los mecanismos de disfunciones vasculares, como los vasoespasmos cerebrales, en escalas de tiempo relevantes para la enfermedad. Esto se logra mediante películas delgadas musculares vasculares a largo plazo, preparando primero sustratos de elastómero mediante el recubrimiento secuencial por centrifugación de cubreobjetos con una tira de piam seguido de PDMS. El segundo paso consiste en utilizar un dispositivo de deposición microfluídico para depositar secuencialmente genina y fibronectina sobre la superficie.Con el fin de proporcionar indicaciones para la autoorganización del tejido en láminas delgadas vasculares y musculares, el paso final consiste en realizar un ensayo de contractilidad mediante la inducción de contracción y relajación en láminas delgadas vasculares y musculares mientras se obtienen imágenes de la muestra. En última instancia, este enfoque produce tejidos que mantienen fidelidad estructural y contractilidad funcional durante hasta dos semanas en cultivo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como las láminas delgadas musculares impresas por microcontacto, es que la integridad del tejido y la contractilidad funcional se conservan durante semanas, mientras que los tejidos construidos mediante métodos anteriores comienzan a degradarse tras tres o cuatro días.En cultivo, este método proporciona una plataforma para estudiar preguntas clave en enfermedades vasculares, como la forma en que se alteran los mecanismos funcionales de las arterias durante la progresión de enfermedades crónicas. Aquí estamos estudiando la mecánica vascular, pero este método puede aplicarse a otros sistemas de órganos modelo, como las tecnologías de órganos en un chip, para recapitular la función cardíaca o del músculo esquelético. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando buscábamos estudiar disfunciones vasculares de desarrollo lento y descubrimos que los métodos actuales o bien no podían utilizarse para cuantificar la función de las células musculares lisas vasculares, o bien no mantenían la integridad durante un período de tiempo suficiente.La deposición microfluídica Jin proporciona una plantilla para la autoorganización celular de manera similar a la impresión por microcontacto, pero también permite que los tejidos patrones mantengan su estructura e integridad durante escalas de tiempo adecuadas para estudiar la remodelación vascular. Para comenzar, limpie un lote de portaobjetos de vidrio de 25 milímetros de diámetro según se describe en el protocolo de texto adjunto; cubra los bordes de los portaobjetos limpios colocando cinta adhesiva en sus lados, dejando una franja expuesta de vidrio en el centro. A continuación, corte los portaobjetos separándolos del recipiente y colóquelos uno a uno sobre un portamuestras con recubrimiento por centrifugado.Utilizando pinzas, agregue 150 microlitros de una solución al 10 % de poli N isop perfil. La acrilamida, también llamada poli pam o Piam, disuelta en un butanol. Asegúrese de cubrir completamente el área expuesta de la laminilla.Luego encienda el centrífugo de espín y aumente la velocidad durante 10 segundos hasta 3000 RPM. Espere cinco segundos y luego aumente durante 10 segundos hasta 6.000 RPM. Mantenga durante un minuto a 6.000 RPM y luego reduzca nuevamente hasta 3000 RPM durante 10 segundos.Sosteniéndolo durante cinco segundos antes de finalizar el ciclo de recubrimiento por centrifugado. Una vez seco, retire cuidadosamente la cinta adhesiva de todos los cubreobjetos, dejando expuesto el cubreobjeto completo con una capa delgada de recubrimiento de piam en el centro del cubreobjeto de vidrio. A continuación, se aplica por centrifugado una capa de PDMS desgasificado sobre cada cubreobjeto.Deslice y cure en un horno a 90 grados Celsius durante al menos 1,5 horas. Diseñe una máscara fotolitográfica para microfluidos tisulares y luego prepare una oblea de silicio con patrón según se describe en el protocolo de texto adjunto. Una vez patroneada, ate la oblea utilizando técnicas estándar y colóquela con la cara estructurada hacia arriba en una placa de Petri.A continuación, mezcle 100 gramos de PDMS con un agente de reticulación en una proporción de 10 a 1, y vierta el PDMS en el recipiente, cubriendo completamente y de manera uniforme la oblea con el patrón. Coloque el recipiente en un desecador al vacío durante aproximadamente 30 minutos hasta que se eliminen todas las burbujas de aire. Luego, cure el PDMS en el recipiente a 90 grados Celsius durante al menos 1,5 horas.Una vez curado, corte el exceso de PDMS y retire lentamente el PDMS con el patrón restante del lado del patrón de la oblea. Elimine el exceso de PDMS alrededor de los patrones utilizando una cuchilla de afeitar y dé forma a los dispositivos en rectángulos para facilitar la extracción del dispositivo en pasos posteriores. A continuación, utilice un punzón quirúrgico de biopsia de un milímetro para formar los orificios de entrada y salida.Sonicar dispositivos microfluídicos en etanol al 70 % durante al menos 30 minutos antes de cada uso. Colocar hasta 10 laminillas de sustrato de película delgada muscular vascular en un limpiador de ozono ultravioleta durante ocho minutos. A continuación, preparar una solución de genina de cinco miligramos por mililitro añadiendo un mililitro de agua doblemente destilada estéril a un recipiente de cinco miligramos de genina liofilizada.Mezcle la solución utilizando un mezclador de vórtice y deje el vial a un lado a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Coloque los dispositivos microfluídicos limpios con el lado de las características hacia abajo sobre cada cubierta. Deslícelos de a uno por vez.Presione firmemente los dispositivos para asegurar un sello hermético con las laminillas recubiertas de PDMS. Coloque rápidamente una gota de etanol al 70 % en la entrada de cada dispositivo para cebado. Después de cinco a diez minutos, aspire cuidadosamente el exceso de etanol en la entrada y reemplácelo inmediatamente con aproximadamente 100 microlitros de PBS.Utilice un vacío para hacer pasar el PBS a través de los dispositivos hasta la salida, con el fin de eliminar el etanol. Deténgase cuando solo quede una pequeña cantidad de PBS en la entrada. Luego, coloque 60 microlitros de la solución de genina a cinco miligramos por mililitro en cada entrada y haga pasar la solución de genina a través de los dispositivos, reemplazando la punta del aspirador de vacío en la salida.Detenga la succión cuando solo quede una pequeña cantidad de solución en la entrada. A continuación, coloque gotas de PBS tanto en la entrada como en la salida para evitar que la solución se seque. Durante la incubación, traslade el recipiente que contiene los dispositivos a un horno o incubadora humidificado ajustado a 37 grados Celsius e incube durante cuatro horas.Durante la incubación, re suspenda la fibronectina hasta una concentración de 50 microgramos por mililitro en agua doblemente destilada estéril y colóquela en hielo durante al menos 30 minutos después de la incubación con Jin. Pase a través o, pero una cantidad mínima de PBS en la entrada. A continuación, agregue 100 microlitros de una solución de fibronectina de 50 microgramos por mililitro.En cada entrada, aspire la solución a través de los dispositivos utilizando la punta de un aspirador de vacío. En la salida, traslade el recipiente descubierto que contiene los dispositivos a un horno o incubadora ajustado a 37 grados Celsius e incube durante 24 horas. Tras la incubación, retire cuidadosamente los dispositivos de las laminillas separándolos lentamente por una esquina, mientras sostiene ligeramente la laminilla con la otra mano, y coloque las laminillas en placas estériles de seis pocillos.Agregue al menos cinco mililitros de solución de penicilina-estreptomicina a cada pocillo y luego coloque las placas en un incubador estéril a 37 grados Celsius durante al menos 30 minutos. Después de la esterilización, aspire la solución de penicilina-estreptomicina y siembre las laminillas con células cultivadas de músculo liso vascular de arteria umbilical humana a una concentración de 80.000 células por centímetro cuadrado. Incube las células a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante al menos 24 horas antes de la prueba.Para comenzar la prueba, coloque una muestra de tejido en una placa de 100 milímetros. Añada solución Tyro precalentada estéril a pH 7,4 para cubrir la muestra. Utilizando una cuchilla, realice varios cortes paralelos a través de la lámina celular, perpendiculares al borde del brazo del tubo.Realice cortes que produzcan secciones de tejido más anchas de aproximadamente dos milímetros de grosor. Estas serán las películas delgadas vasculares musculares que alternarán con tiras delgadas que se eliminarán posteriormente. Luego, gire el recipiente 90 grados y realice dos cortes paralelos rectos en el centro del tejido, paralelos a la tira de piam.Retire las tiras delgadas entre las películas vasculares, musculares y delgadas para evitar que las películas adyacentes entren en contacto. A continuación, coloque el recipiente en una plataforma controlada por temperatura sobre la platina del microscopio estereoscópico y comience a capturar imágenes de luz transmitida y fluorescente, con intervalos de tiempo deseado durante todo el ensayo de tratamiento. Trate secuencialmente las películas delgadas vasculares y musculares con 50 nanomolar de endotelio durante 20 minutos para inducir contracciones, seguido de 100 micromolar de HA 10 77 durante 30 minutos para inducir relajación al enfriar por debajo de 32 grados Celsius.La piam se disuelve, liberando las películas delgadas musculares vasculares. La medición de la longitud de proyección puede convertirse en un radio de curvatura, el cual se utiliza para calcular el estrés promedio en la capa celular sobre la película, como se muestra aquí en las imágenes secuenciales de luz transmitida de un ensayo representativo de contractilidad. Estas imágenes pueden convertirse en valores de estrés a partir de los cuales se calculan el tono basal y la contractilidad inducida.En este video, se muestra un ejemplo representativo del lapso de tiempo de un ensayo completo de contractilidad. Las láminas musculares alcanzan el equilibrio contráctil y luego se contraen más tras la adición de 50 nM de endotelina. Una lámina se relaja tras la adición de 100 µM de HA 1077.La ligera disminución en el tono basal y la contractilidad del tejido al final del ensayo probablemente sea el resultado directo de la reducción en el número de células que componen el tejido. Dado que las células musculares lisas vasculares privadas de suero no proliferan, aquí se muestran imágenes de contraste de fase de células musculares lisas cultivadas sobre superficies modificadas con genina en distintos puntos temporales de sacrificio que van desde un día hasta dos semanas. En este caso, se utilizó inmunohistoquímica para resaltar la confluencia y alineación celular de los tejidos mediante la tinción de los filamentos de F-actina, coloreados en verde, tras uno, cuatro y siete días de privación de suero.La evaluación cuantitativa de la confluencia del tejido durante este intervalo de tiempo mostró una deterioración mínima en estas superficies. Se cuantificó el alineamiento de los filamentos de actina F y se confirmó que el alineamiento se mantuvo durante las dos semanas. En cultivo, una vez dominada esta técnica de fabricación de tejidos in vitro, se puede realizar en dos días.Al intentar este procedimiento, es importante recordar comenzar la deposición microfluídica un día antes de la siembra celular prevista y mantener una temperatura fisiológica constante durante los experimentos con películas finas. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos tradicionales de bioquímica, como el inmunoblot (Western blot) y la PCR, para estudiar los cambios en la expresión de proteínas y genes y correlacionar el fenotipo celular con el comportamiento funcional. Esta técnica allana el camino para que los investigadores exploren la progresión de disfunciones vasculares de desarrollo lento, como el vasoespasmo cerebral, la hipertensión y la aterosclerosis, así como modelos in vitro de la pared arterial humana.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este protocolo, se demuestra la fabricación de una amplia microactuator de mensajes desplazadas verticalmente en que se basa la tecnología, y cómo esta tecnología de base pueden ser modificados para llevar a cabo de alto rendimiento de cultivo de células mecánica dinámica, tanto en la cultura de dos dimensiones y tres dimensiones paradigmas.

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Microfluidic genipina Deposición Técnica de Cultura extendido de micropatterned vasculares musculares Thin Films

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