Name: Células T Captura bacterias por transinfection de células dendríticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprende a cuantificar la transinfección bacteriana en células T CD4+ mediante células dendríticas infectadas en modelo murino. Este protocolo permite estudiar la captura y eliminación de patógenos por linfocitos T.

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Este trabajo ha sido financiado por las subvenciones BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC del Ministerio de Ciencia e Innovación de España y PIES201020I046 del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).

Nota: Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación de la Universidad Autónoma de Madrid y llevaron a cabo bajo la supervisión de la Universidad Autónoma de Madrid, Jefe de Protección de los Animales y la Salud, de acuerdo con las directrices españolas y europeas. Los ratones fueron criados en el libre (SPF) vivienda patógeno específico y fueron sacrificados por personal entrenado y calificado utilizando dióxido de carbono (CO 2) método de inhalación. 1. Ratón médula ósea derivada de los DC La diferenciación y la infección Nota: La Figura 1 resume este primer paso. Todos los procedimientos deben llevarse a cabo en la capilla de ahora en adelante, utilizando sólo estériles medios, instrumentos, puntas de pipetas y placas de cultivo. <ol><li> Derivadas de la médula ósea de ratón DC Diferenciación <ol><li> Diseccionar tibias y fémures de un C57 / BL6 ratón 22 y transferir en un plato de plástico con 10 ml de medio RPMI. </li&gt; <li> Cortar cada epífisis fuera, con tijeras estériles y exponer la médula ósea, que tiene un color rojo brillante característico. </li><li> Infundir el interior del hueso con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) conteniendo 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (tampón / BSA / EDTA PBS) usando una jeringa estéril en un Petri estéril plato. </li><li> Recoger la suspensión de células y se centrifuga en un tubo a 600 xg en una centrífuga refrigerada (4 ° C). </li><li> Resuspender las células en 1 ml de cloruro de amonio--potasio (ACK) de tampón de lisis (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHCO3 y EDTA 0,1 mM) y se incuba durante 30 segundos a RT con el fin de eliminar las células rojas de la sangre. </li><li> Añadir 10 ml de medio RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10% (FBS) y filtrar a través de un filtro de células (70 micras) para eliminar los fragmentos de hueso y grupos de células antes de centrifugar a la misma velocidad (600 xg) porque grumos se eliminaron por filtración. </li><li> Contar las células de und ajustar a 5 x 10 5 células / ml con RPMI 10% FBS (que contiene 50 mM B-mercaptoetanol, piruvato de sodio 1 mM) y se añade 20 ng / ml de factor recombinante murino de granulocitos y macrófagos estimulante de colonias (rm-GM-CSF) como una concentración final. </li><li> Añadir esta suspensión a una, la calidad microbiológica estéril, 15 cm placa de Petri, y la cultura en un incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Cada tres días, giran hacia abajo tanto las células no adherentes y células independientes con EDTA 5 mM en PBS y resuspender en 5 x 10 5 células / ml de densidad celular, con un nuevo medio que contiene 20 ng / ml rm-GM-CSF. </li></ol></li><li> La maduración de las DC y Antigen Cargando <ol><li> Al día 9, resuspender las células en 5 x 10 5 células / ml de densidad en medio que contiene 20 ng / ml rm-GM-CSF. A continuación, añadir 20 ng / ml de lipopolisacárido (LPS) para permitir una alta expresión de MHC-II en las células y se incuba en un no-tejido de cultivo estéril tratada con plato de 15 cm Petri durante 24 horas. </li><li> Después de unadía de LPS-estimulación, manchar algunas células DC con anticuerpos contra CD11c ratón, MHCII y Gr-1 para comprobar los DC diferenciación mediante citometría de flujo. Un ejemplo de análisis de citometría de flujo de DCs se muestra en la Figura 3A y 3B. <ol><li> Incubar las DC (5 x 10 5 células / muestra) con un anticuerpo monoclonal anti-ratón-CD16 / CD32 a 2,5 g / ml de concentración final en 50 l de PBS / BSA / tampón EDTA por muestra. Después, se añaden 50 l de los anticuerpos contra MHCII (IA / IE), CD11c y Gr-1 conjugado con diferentes fluorocromos a 1: 100, 1: 200 y 1: 500 en tampón de EDTA BSA PBS / /, respectivamente. </li><li> Finalmente, lavar con DCs BSA tampón de EDTA PBS / / y analizar por citometría de flujo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Nota: Si las células están bien diferenciadas, las células están listas para el antígeno de carga. </li></ol></li><li> Wash DC con RPMI 10% FBS (sin antibióticos) y se incuba con 10 mg / ml otii OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) en un tubo de plástico en 1 ml de RPMI 10% FBS medio por cada 5 x 10 6 países en desarrollo para un mínimo de 1 hora a 37 ºC. Como control negativo, deje las DC sin incubación con OVAp. </li></ol></li><li> La infección de las DC <ol><li> Infectar a los países en desarrollo a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 bacterias (10 bacterias por DC) durante 1 hora en un incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Lavar las células DC 3 veces en PBS 1x y en RMPI 10% de FBS y se centrifuga a 450 xg para lavar la mayoría de las bacterias extracelulares. Finalmente, Resuspender las células en RPMI 10% FBS medio (sin antibióticos) en 20 x 10 6 células / ml. </li></ol></li></ol> 2. Aislamiento de las células CD4 + linfocitos T de ratones transgénicos otii Nota: La figura 1 resume este segundo paso. Los ganglios linfáticos se deben utilizar en lugar de bazo para aislar células T CD4 +, porque la proporción de CD4 + linfocitos en los ganglios linfáticoss (~ 50%) es mayor que en el bazo (~ 25%) y por lo tanto la purificación sería más eficaz. <ol><li> Hacer suspensión de células única de los ganglios linfáticos <ol><li> Eliminar inguinal, axilar, braquial, cervical y nódulos linfáticos mesentéricos de ratones transgénicos 23 otii y transferir en un plato de plástico con 10 ml de RPMI 10% FBS medio. </li><li> Ganglios linfáticos Grind bajo una campana estéril utilizando dos portaobjetos esmerilado. Coloca los ganglios linfáticos en un lado esmerilado de una diapositiva de microscopio, y frote con el lado mate de la segunda diapositiva hasta órganos han sido terreno. </li><li> Lavar suspensión de células individuales en tampón PBS / BSA / EDTA. </li><li> Filtre las células a través de un filtro de células (70 micras) para eliminar el tejido conectivo y lavar con BSA EDTA buffer PBS / /. </li><li> Resuspender las células en 1 ml de tampón de lisis ACK y se incuba durante 1 min a TA con el fin de eliminar las células rojas de la sangre. </li></ol></li><li> Aislamiento de células T CD4 + <ol><li> Lave de nuevo como en el paso 2.1.3 y el recuentocélulas para resuspender en 100 x 10 6 células / ml en tampón de EDTA BSA PBS / /. Añadir anticuerpos biotinilados contra CD8, IgM, B220, CD19, MHC de clase II (I-Ab), CD11b, CD11c y DX5 a 1: 250 durante 30 min en hielo durante posterior selección negativa de las células T CD4 +. </li><li> Lavar las células en tampón de EDTA BSA PBS / / e incubar las células (100 x 10 6 células / ml) con microperlas de estreptavidina a la concentración recomendada en el protocolo del fabricante durante 15 min en hielo. </li><li> Lavar las células en tampón de EDTA BSA PBS / / y filtrarlas a través de un filtro de células (30 micras) antes del aislamiento de células T CD4 +. </li><li> Aislar células T CD4 + por selección negativa usando una máquina de separación celular magnética de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Contar las células y ajustar a 4 x 10 6 células / ml con RPMI 10% FBS medio (sin antibióticos). </li><li> Fijar y mantener en hielo aislado células T CD4 + (3 x 10 5 células) para comprobar la pureza de flujocitómetro de 24 como se describe. Un ejemplo de T CD4 + de purificación de las células se muestra en la Figura 3C. </li></ol></li></ol> 3. Células T transinfection Medición por ensayo de protección Gentamicina Nota: La Figura 2 resume esta tercera etapa del protocolo. <ol><li> Transinfection células T <ol><li> Se incuban las células T CD4 + aisladas con células infectadas DC (1: 1) (bacterias libres los países en desarrollo fueron infectadas durante 1 hora y se lavan para eliminar) durante 30 minutos para permitir la formación de sinapsis inmunológica en un incubador de CO2 (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Añadir 0,5 ml de las células T CD4 + aisladas (2 x 10 6 células) y 0,1 ml de DCs infectadas (2 x 10 6 células) en una placa de cultivo de 24 pocillos. Como control negativo, infectar directamente 0,5 ml de las células T CD4 + a una MOI de 10 bacterias por 30 min. </li><li> Incluir controles adicionales que separan las DC infectadas de las células T utilizandouna barrera transwell policarbonato (con 3 micras de tamaño de poro), impidiendo DC-T contacto físico. Añadir 0,1 ml de DCs dentro de la transwell y 0,5 ml de las células T CD4 + en el compartimiento inferior del pozo (placa de 24 pocillos). </li><li> Por último, completa con medio RMPI hasta que es de 0,6 ml en cada pocillo para hacer volúmenes iguales en todas las muestras. </li><li> Después de 30 minutos de la formación de sinapsis inmunológica, añadir 100 mg / ml de gentamicina y se incuba durante 1 hora antes de recoger las células en un incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO 2). </li></ol></li><li> Re-aislamiento de células T CD4 + <ol><li> Recoger las células no adherentes y volver a suspender en tampón PBS / BSA / EDTA. La mayor parte de los países en desarrollo de permanecer unidos a la placa de cultivo de plástico. Tubos Vortex suavemente para asegurar la desagregación celular. Mantenga 500 l de sobrenadante celular como control para demostrar que la gentamicina ha funcionado bien. </li><li> Re-aislar células T CD4 + a partir de muestras que contienen DCs y las células T juntos como en el paso 2.2, Aunque la mayoría de los PED deberían haber fijado en el plato. Mantenga las muestras de control en el hielo. Tome en cuenta sólo los experimentos con la contaminación de menos de 2%. Un ejemplo de T CD4 + de purificación de células después de transinfection se muestra en la figura 3D. </li></ol></li><li> Lyse células T y de Semillas ellos en bacterias placas de medio de agar. <ol><li> Lavar las células T CD4 + dos veces con PBS. </li><li> Contar las células y resuspender ellos en 2 x 10 6 células / ml en PBS. </li><li> Añadir 500 l de 0,1% de Triton X-100 en 500 l de las células T para lisar ellos en 1 x 10 6 células / ml, la liberación de las bacterias intracelulares fuera de las células T. </li><li> Haga 3 diluciones decimales seriadas de células lisadas y sembrar 50 l de cada dilución en bacterias placas de agar medianas. Divida placas en 4 porciones y sembrar las diferentes diluciones de células lisadas en cada parte. Los resultados representativos se muestran en la Figura 4. <ol><li> Como control, también la placasobrenadante de células almacenada de los conjugados en agar, para asegurar que la gentamicina ha funcionado bien. También la placa DCs infectadas como un control adicional. En caso de baja contaminación DC se produce (&lt;2%), restar las unidades formadoras de colonias (UFC) correspondientes a la contaminación de bajo DC. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Cuantificación de T transinfection celular por citometría de flujo Nota: La figura 2 resume este paso. <ol><li> T transinfection celular <ol><li> Infectar BMDCs como en el paso 1.3, pero el uso de bacterias que expresan GFP en este caso. </li><li> Células T CD4 + (las manchas aisladas de los ganglios linfáticos en el paso 2.2) con un aminocumarina clorometil rastreador celular (CMAC) durante 30 min a 37 ºC de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Lavar las células T CD4 + marcadas dos veces con RMPI 10% de FBS (sin antibióticos). </li><li> Incubar DCs infectadas (después de 1 h de incubación con bacterias) con la etiqueta CD4 +Células T durante 30 min para permitir la formación de sinapsis inmunitaria a 37 ºC incluyendo todos los controles que explican en el paso 3.1.1. </li></ol></li><li> La tinción de las células infectadas T CD4 + <ol><li> Después de 30 minutos de DC-T la formación de sinapsis inmunológica, recoger las células y lávelas en PBS / BSA / EDTA. </li><li> Después de dos lavados con tampón PBS / BSA / EDTA, las células agregados separados mediante agitación con vórtex suavemente los tubos. </li><li> Fijar las muestras en 0,2 ml / tubo de PBS que contenía 3% PFA durante 15 min a RT. A continuación, lavar en PBS. </li><li> Incubar con el anticuerpo monoclonal anti-ratón-CD16 / CD32 (2,5 g / ml) en 50 l / muestra de PBS / BSA / EDTA durante 15 min en hielo para bloquear los receptores Fc de las células dendríticas. </li><li> Añadir un conejo anti-bacterias anticuerpo (10 mg / ml como concentración final) en 50 l / muestra de PBS / BSA / EDTA durante 30 min en hielo para teñir las bacterias extracelulares. </li><li> Lavar las células con PBS / BSA / EDTA y se incuba con un anticuerpo contra CD11c ratón conjugado con ficoeritrina (PE) y un secundaria anticuerpo contra conejo conjugado con otro fluorocromo como Alexa Fluor-647 a 1: 200 en 100 l / muestra de PBS / BSA / EDTA durante 30 min en hielo. </li><li> Lavar las células y analizar muestras por citometría de flujo. No te olvides de incluir una muestra de las células T transinfected utilizando bacterias no fluorescentes como control negativo y muestras etiquetadas con sólo uno de cada fluorocromo utilizado en el experimento para compensar las muestras y ajustar la configuración de citometría de flujo 25. Análisis representativo se muestra en la Figura 5. Nota: Si las bacterias no expresan GFP, para distinguir intracelular y bacterias extracelulares, las bacterias extracelulares de la etiqueta, fijar y permeabilizar las muestras con Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 5 min. Después manchar bacterias totales (intracelulares + extracelular) con un fluorocromo diferente. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Células T o linfocitos T son un tipo de leucocitos que juegan un papel central en la inmunidad mediada por células y que pertenecen a la respuesta inmune adaptativa 26. Las células T son refractarios a ser infectados in vitro pero algunos informes indican que pueden ser infectados in vivo 14,15. Los contactos íntimos de células APC y T durante la sinapsis inmune sirven como plataformas para el intercambio de material biológico 13, incluyendo algunos virus como el VIH <s...

Cuando un patógeno infecta a su huésped, por lo general hay una activación de la respuesta inmune innata y adaptativa, necesarios para la eliminación de bacterias. La inmunidad innata es la primera línea de defensa que impide que la mayoría de las infecciones. La inmunidad innata distinguir en unos elementos precisos manera que se conservan entre grandes grupos de microorganismos (patrones moleculares asociados a patógenos, PAMP) 1. Los mecanismos de la inmunidad innata incluyen barreras físicas tales como la piel, las barreras químicos (péptidos antimicrobianos, la lisozima) y los leucocitos innatos, que incluyen los fagocitos (macrófagos, neutrófilos y células dendríticas), mastocitos, eosinófilos, basófilos y células asesinas naturales 2. Estas células identificar y eliminar los agentes patógenos, ya sea atacando a través de contacto o mediante fagocitosis, que incluye patógenos que envuelve y matando. Este sistema no permite la defensa de toda la vida, en contraste con la inmunidad adaptativa, que confieren memoria inmunológica contra pathogens. El sistema inmune adaptativo es la segunda línea de defensa y es capaz de reconocer y reaccionar a los antígenos específicos de microbios múltiple y sustancias no microbianas 3. Los principales componentes del sistema inmune adaptativo son los linfocitos, que incluyen células B y T. Las células B están involucrados en la respuesta humoral, secretoras de anticuerpos contra agentes patógenos o proteínas exógenas. Sin embargo, las células T representan la inmunidad mediada por células, la modulación de la respuesta inmune con la secreción de citoquinas o matar las células infectadas por patógenos 4. Células presentadoras de antígenos (APC), incluyendo células dendríticas o macrófagos, componentes del sistema inmune innato, pueden reconocer patógenos fagocitan y componentes bacterianos proceso en antígenos, que se presentan en la superficie celular por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) 5.7. Después de APC han fagocitado patógenos, por lo general migran a los ganglios linfáticos de drenaje, donde interactúan con Tlas células. Linfocitos T pueden reconocer los complejos de péptido-MHC específicos por sus receptores de células T. La sinapsis inmune (IS) se produce en la interfaz entre una APC cargadas con antígeno y un linfocito durante la presentación de antígenos 8,9. Algunas bacterias pueden sobrevivir fagocitosis y difundir sistemáticamente dentro APC. En este punto de vista, las CPA infectadas sirven como reservorios de bacterias o &quot;caballos de Troya&quot; que facilitan la propagación de bacterias 10. El contacto íntimo entre APC y los linfocitos que tienen lugar durante el curso de la formación es también funcionan como una plataforma para el intercambio de parte de las membranas, material genético y los exosomas y puede ser secuestrado por algunos virus para infectar las células T; este proceso se llama transinfection 11-13. Algunas bacterias patógenas (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica y Shigella flexneri) son capaces de invadir los linfocitos T in vivo y modificar su comportamiento 14-16 de. Tenemosdescriben recientemente que los linfocitos T también son capaces de capturar las bacterias por transinfection a partir de células dendríticas infectadas previamente (DCs) durante el curso de la presentación del antígeno 16. Células T de captura bacteriana por transinfection excesivamente más eficaz (1,000-4,000x) que las infecciones directos. T patógeno captura de las células y las bacterias no patógenas que indica que transinfection es un proceso impulsado por las células T. Sorprendentemente, transinfected T (TIT) células murieron rápidamente las bacterias capturadas y lo hicieron más eficiente que los fagocitos profesionales 16. Estos resultados, que se rompen un dogma de la inmunología, muestran que las células de la inmunidad adaptativa pueden realizar funciones que eran supuestamente exclusiva de la inmunidad innata. Además, se demostró que las células Tit secretan grandes cantidades de citoquinas pro-inflamatorias y protegen de las infecciones bacterianas en vivo. Aquí se presentan los diferentes protocolos utilizados para estudiar el proceso transinfection bacteriana enun modelo de ratón. Este modelo se basa en el uso de células T CD4 + procedentes de ratones transgénicos otii, que llevan un TCR específico para el péptido 323 a 339 de OVA (OVAp) en el contexto de la I-Ab 17 que interactúan específicamente con el hueso bacteriana infectada marrow- DCs derivadas (18,19) BMDCs cargados con OVAp, formando sinapsis inmunes estables. Transinfection células T puede ser visualizado y rastreado mediante microscopía de fluorescencia. Además, la citometría de flujo se puede utilizar para la detección de células infectadas mediante el aprovechamiento de la fluorescencia emitida por las bacterias que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) 16,20. Por otra parte, transinfection de células T se puede cuantificar mediante un enfoque más sensible, el ensayo de supervivencia de gentamicina que permite la medición de un gran número de eventos. La gentamicina es un antibiótico que no puede penetrar las células eucariotas. Por lo tanto, el uso de este antibiótico permite la diferenciación de bacterias intracelulares que sobrevivió a la fr Además antibióticolos extracelulares om que fueron asesinados 21.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>r-GMCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>SIGMA</td><td>L2630-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3023901</td><td></td></tr><tr><td>2-ME</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>OVAp OTII (323&ndash; 339)</td> Filtro de células <td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70uM</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Jeringa de 30 uM Filcons Estéril</td><td>BD</td><td>340598</td><td></td></tr><tr><td>AutoMacs Classic</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-088-887</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Normon</td><td>624601.6</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Costar</td><td>3415</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Pronadisa</td><td>1231</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Pronadisa</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído 16%</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>IgM Biot</td><td>ImmunoStep</td><td>Clon RMM-1</td><td></td></tr><tr><td>B220 Biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD19 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II Biot (I-A/I-E)</td><td>BD Biosciences</td><td>553622</td><td></td></tr><tr><td>CD11b biot</td><td>Immunostep</td><td>11BB-01mg</td><td></td></tr><tr><td>CD11c biot</td><td>Immunostep</td><td>11CB3-01mg</td><td></td></tr><tr><td>DX5 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553856</td> Gr-1 biot BD Biosciences 553125 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32</td><td>ImmunoStep</td><td>M16PU-05MG</td><td></td></tr><tr><td>anti Salmonella</td><td>ABD Serotec</td><td>8209-4006</td><td></td></tr><tr><td>CD11cPE</td><td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0041-U100</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553129</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II (I-A/I-E) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553623</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647 Anticuerpo IgG (H+L) Anti-Conejo de Cabra</td>, <td>Invitrogen</td> <td>altamente adsorbidoA-21245</td><td></td></tr><tr><td>CMAC (7-amino-4-clorometilcumarina)</td><td>Life technologies</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

células t captura bacterias por transinfection de células dendríticas

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recientemente, hemos demostrado, contrariamente a lo descrito, que las células T CD4+, el paradigma de las células inmunitarias adaptativas, capturan bacterias de las células dendríticas infectadas (CD) mediante un proceso llamado transinfección. Aquí, describimos el análisis del proceso de transinfección, que ocurre durante el curso de la presentación del antígeno. Este proceso se dio a conocer mediante el uso de células T CD4+ de ratones transgénicos OTII, que portan un receptor de células T (TCR) específico para un péptido de ovoalbúmina (OVAp), que por lo tanto puede formar inmunocomplejos estables con células dendríticas infectadas cargadas con esta OVAp específica. La dinámica de las bacterias que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) durante la transmisión de células DC-T se puede monitorear mediante imágenes de células vivas y la cuantificación de la transinfección bacteriana se puede realizar mediante citometría de flujo. Además, la transinfección se puede cuantificar mediante un método más sensible basado en el uso de gentamicina, un antibiótico aminoglucósido no permeable que mata las bacterias extracelulares, pero no las intracelulares. Este método clásico se ha utilizado anteriormente en microbiología para estudiar la eficacia de las infecciones bacterianas. A continuación explicamos el protocolo del proceso completo, desde el aislamiento de las células primarias hasta la cuantificación de la transinfección.

Aquí describimos cómo realizar transinfection bacteriana de células T murino desde la médula ósea infectada derivado de DCs y cómo medir transinfection bacteriana a través de dos enfoques diferentes: citometría de flujo y gentamicina supervivencia ensayo de la Figura 1 resume el procedimiento para obtener las células.. DC se generan mediante la incubación de células de médula ósea con GM-CSF durante 9 días. Entonces, los países en desarrollo son madurados con LPS para au...

Aquí se presenta un protocolo para medir la captura bacteriana por las células T CD4 + que se produce durante la presentación de antígenos a través de transinfection de células dendríticas infectadas previamente (DC). Mostramos cómo realizar los pasos necesarios: el aislamiento de pilas, la infección de la formación de conjugado de células DC, DC / T, y la medición de bacterias transfección de células T.

Células T Captura bacterias por transinfection de células dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la transinfección de células T CD4+ bacterianas, utilizando un modelo de células de ratón. In vivo, algunas bacterias patógenas como Listeria monocytogenes y Salmonella enteritidis son capaces de infectar linfocitos T y modificar su comportamiento. Sin embargo, in vitro, las células T no son fáciles de infectar.Basándonos en esta observación, investigamos si las células T pueden capturar bacterias de células dendríticas infectadas durante la presentación de antígenos, como ocurre en las infecciones virales. Descubrimos que las células T capturan bacterias y luego las eliminan. De hecho, encontramos que las células T realizan esto de manera más eficiente que los fagocitos profesionales.Estos resultados contradicen un principio fundamental de la inmunología, al mostrar que células de la inmunidad adaptativa pueden realizar funciones que supuestamente son exclusivas de la inmunidad innata. Hoy presentamos el protocolo utilizado para estudiar el proceso de transinfección bacteriana en un modelo murino. Esteban Veiga y yo demostraremos este procedimiento junto con Guillermo Ramirez-Santiago, Raquelle Garcia-Ferreras, dos estudiantes de posgrado, y Mónica Torres-Torresano, una técnica.Tenga en cuenta que todos los procedimientos descritos en este video deben realizarse en la campana, utilizando únicamente medios, instrumentos, puntas de pipeta y placas de cultivo estériles. En una placa de Petri estéril de 15 centímetros no tratada para cultivo de tejidos, agregue un microlitro de lipopolisacárido a una concentración de un miligramo por mililitro a las células dendríticas derivadas de médula ósea de un solo ratón. Incube las células durante 24 horas para aumentar la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad II, o MHC II.Tras la incubación, realice citometría de flujo para confirmar la expresión de MHC II y la diferenciación. Una vez confirmada la expresión de MHC II, como se muestra aquí, transfiera las células a un tubo estéril de polipropileno de 50 mililitros. Añada 10 mililitros de PBS que contenga 5 milimolar de EDTA, luego centrifugue las células a 600 x g.Una vez finalizada la centrifugación, realice un lavado resuspendiendo las células en RPMI con 10 %FBS y luego centrifugue nuevamente. A continuación, tras el lavado, añada un mililitro de RPMI con 10 %FBS por cada cinco veces 10 a la sexta células dendríticas y pipetee arriba y abajo para resuspenderlas. Luego, separe las células dendríticas resuspendidas en dos tubos de volumen igual.A un tubo, agregue 10 microgramos por mililitro de OT-II OVAp. Deje el otro tubo sin tratar. Servirá como control negativo para la carga de antígeno.Incube los tubos durante al menos una hora para cargar las moléculas de MHC II de las células dendríticas con el péptido OVA. Mientras tanto, prepare el Salmonella enteritidis para la infección lavándolo tres veces con una solución de PBS. Centrifugue entre cada lavado a 1800 x g para eliminar el medio LB y cualquier toxina secretada.A continuación, reuspenda las bacterias en RPMI. Tras la incubación, infecte cada tubo de células dendríticas a una multiplicidad de infección, o MOI, de 10, e incube las células durante una hora. Una vez que las células hayan sido infectadas, lávelas tres veces con PBS y luego una vez con RPMI 10 %FBS.Centrifugar entre lavados a 450 x g para eliminar la mayor parte de las bacterias extracelulares en el OVAp soluble. Después de la última centrifugación, resuspender las células en RPMI con 10 % de FBS a una concentración de 20 millones de células por mililitro. A una placa de cultivo de 24 pocillos, añadir dos millones de células T CD4+ en un volumen de 0,5 mililitros a cada uno de cinco pocillos.A continuación, para controlar el contacto físico, coloque barreras de transbien de policarbonato con un tamaño de poro de tres micrómetros en los terceros y cuartos pocillos. Al primer pocillo, añada 0,1 mililitros de las células dendríticas sobrecargadas infectadas. Al segundo pocillo, añada 0,1 mililitros de las células dendríticas no cargadas infectadas.Añada 0.1 mililitros de las células dendríticas infectadas sobrecargadas a un pocillo y 0.1 mililitros de las células dendríticas infectadas no cargadas al otro pocillo. Finalmente, como control negativo, infecte directamente el quinto pocillo de células T CD4+ con una MOI de 10. Luego, ajuste el volumen total del pocillo a 0.6 mililitros con RPMI.Incube la placa durante 30 minutos para permitir la formación de sinapsis inmunitarias. Después de la incubación, agregue 100 microgramos de gentamicina por mililitro de medio a cada pocillo e incube durante una hora. La gentamicina es un antibiótico aminoglucósido que no es capaz de penetrar en células eucariotas.Por lo tanto, en este paso, el aminoglucósido matará a las bacterias extracelulares, pero no a las bacterias intracelulares. Tras la incubación, recolecte las células no adherentes en tubos de 15 mililitros y resuspenda en 10 mililitros de tampón PBS BSA EDTA. Descarte la placa de cultivo de plástico a la que permanecen adheridas la mayoría de las células dendríticas.A continuación, agite suavemente los tubos en vórtex para asegurar la desagregación celular. Centrifugue los tubos a 600 x g. Luego, de cualquier tubo, aspire 500 microlitros del sobrenadante celular y transfiera mediante pipeta a un tubo nuevo.Esto se utilizará como control para demostrar que el tratamiento con gentamicina fue efectivo. Coloque todas las muestras en hielo. En esta etapa, hay seis tubos: cuatro tubos de muestras de prueba y dos controles.Aunque la mayoría de las células dendríticas se descartaron con la placa, las muestras que no se separaron mediante barreras transversas aún podrían contener algunas. Para reducir la contaminación, utilice aislamiento celular magnético o clasificación celular para reaislar las células T CD4+ de las muestras que no se separaron mediante barreras transversas. El aislado final debe contener menos del 2% de células dendríticas.Mantenga el resto de las muestras en hielo. Una vez que se hayan purificado las células T CD4+, es momento de cuantificar la infección por bacterias de clase. Esto puede realizarse mediante recuentos de colonias o mediante citometría de flujo.Aquí, le mostraremos cómo realizar recuentos de colonias. Lave las células T CD4+ transinfectadas dos veces con PBS. Centrifugue a 600 x g entre los lavados.Luego cuente las células y resuspenda en PBS a una concentración de dos veces 10 a la sexta células por mililitro. A 500 microlitros de linfocitos T, agregue 500 microlitros de Triton X-100 al 0,1 % para lisarlos. Esto libera las bacterias intracelulares de los linfocitos T.Para cada muestra de células lisadas, realice tres diluciones seriadas. Luego, divida una placa de agar LB en cuartos y extienda 50 microlitros de cada dilución, incluyendo la suspensión sin diluir, sobre cada sección de la placa. En una placa de agar LB separada, extienda el sobrenadante de células almacenado como control de la eficacia de la gentamicina.Luego, en otra placa, siembre las células T infectadas directamente como un control adicional. Incube durante la noche. Al día siguiente, cuente las colonias en cada sección de la placa y calcule el número de unidades formadoras de colonias para cada muestra.Si ocurre una contaminación de células dendríticas de bajo nivel, definida como menos del 2%, reste las unidades formadoras de colonias correspondientes a la contaminación de células dendríticas bajas. La transinfección de linfocitos T se realizó utilizando Salmonella enteritidis y se cuantificó mediante el ensayo de supervivencia a la gentamicina, tal como se describe en este video. Cuando se sembraron linfocitos T directamente infectados, como se muestra a la izquierda, no se observó crecimiento de colonias, lo que indica que los linfocitos T son refractarios a las infecciones bacterianas directas.Cuando se sembró el sobrenadante de los ensayos de transinfección, como se muestra a la derecha, no se observaron colonias, lo que indica que la gentamicina funcionó adecuadamente. Aquí se muestran los resultados de los ensayos de transinfección realizados en presencia de barreras tipo transwell. Solo se observan tres colonias en la suspensión sin diluir de las muestras con y sin carga de OVA.En contraste, se observan numerosas colonias cuando hay contacto directo de los linfocitos T con células dendríticas infectadas. Además, cuando las células dendríticas cargadas con OVAp se incubaron con linfocitos T, la captación de bacterias aumentó aproximadamente cinco veces. En conjunto, estos datos indican que el contacto directo entre células dendríticas infectadas y linfocitos T facilita la captación bacteriana y que la transinfección celular se ve potenciada durante el reconocimiento del antígeno.Después de este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la transinfección utilizando células T marinas. La ventaja de cuantificar la transinfección con la supervivencia a la gentamicina es su alta sensibilidad. Somos capaces de detectar una sola bacteria infectante.Es importante recordar que el paso de purificación de este procedimiento es crítico. La pureza debe ser muy alta si se van a utilizar los conteos de colonias para determinar la tasa de transinfección. La cuantificación mediante citometría de flujo no tiene esta limitación, porque se pueden distinguir fácilmente las células dendríticas y las células T, pero la restricción es que las bacterias que expresan GFP deben ser lo suficientemente brillantes como para detectar las células infectadas frente al fondo de fluorescencia externo.No olvide que trabajar con patógenos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben utilizar las precauciones de seguridad adecuadas al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Fuente: Cruz-Adalia, A., et al. Las células T capturan bacterias por transinfección de células dendríticas. J. Vis. Exp. (2016).Este video demuestra la transinfección bacteriana a través de interacciones entre células T específicas de antígeno y células dendríticas. Las células dendríticas infectadas por bacterias que presentan péptido de ovoalbúmina se incuban con células T, ya sea directamente o separadas por una membrana. El contacto directo permite la formación de sinapsis inmunológicas, lo...

Transinfección bacteriana in vitro de células T mediante la formación de sinapsis inmunológicas

Este video muestra un método de conversión de células dendríticas (CD) en CD tolerogénicas (TolDC) utilizando un agente farmacológico inmunomodulador. Esta conversión se confirma mediante la evaluación de la función de TolDC a través de su efecto inmunosupresor sobre las células T CD4+.

Efecto de un agente farmacológico inmunomodulador en la interacción entre células dendríticas y linfocitos T CD4+

Aquí, nosotros usamos la transducción retroviral y transfección concatemeric para crear una línea de células que pueden expresar las componentes de un vector lentiviral (VI) en ausencia de tetraciclina. Esta LV codifica GFP y se pseudotyped con una glicoproteína, SVGmu, que es específico para un receptor en las células dendríticas.

Una línea celular regulada por tetraciclina Produce lentiviral vectores de alta titulación que se dirigen específicamente a las células dendríticas

A diferencia del VIH-1 partículas libres de células, las células T CD4 + infectados son detectados con eficacia por las células dendríticas plasmocitoides (PDC). Este manuscrito describe un método donde las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o PDC aisladas son co-cultivadas con VIH-1 en las células T infectadas para evaluar detección innata por PDC según la evaluación de liberación de IFN de tipo I.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

Aquí describimos un ensayo de cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) para cuantificar el inmunosupresor tacrolimus en manchas de sangre seca utilizando un paso simple de precipitación manual de proteínas y extracción en columna en línea.

Cuantificación del inmunosupresor tacrolimus en gotas de sangre seca mediante LC-MS/MS

En este protocolo, se describe un modelo de colitis por transferencia adoptiva de células T específicas de antígeno de la microbiota intestinal. Las células T CD4+ se aíslan de ratones transgénicos CBir1 TCR. Estos son específicos para un antígeno inmunodominante de la microbiota intestinal CBir1 flagelina, que se transfiere a los ratones Rag1-/- receptores, lo que lleva a la inflamación intestinal.

Inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células T CD4+ transgénicas CBir1 TCR a ratones inmunodeficientes

Describimos un procedimiento para evaluar la capacidad de los agentes farmacológicos para generar células dendríticas tolerogénicas a partir de células dendríticas derivadas de monocitos naïve in vitro y validar su potencia mediante la generación de células T reguladoras autólogas.

Un método simple y eficiente para probar agentes inmunomoduladores para la generación de células dendríticas tolerogénicas a partir de monocitos CD14+ humanos

Este protocolo describe la reprogramación in vivo de células cancerosas de ratón en células dendríticas tipo 1 dentro del microambiente tumoral a través de la expresión forzada de los factores de transcripción PU.1, IRF8 y BATF3.

Reprogramación intratable in vivo de células tumorales a células dendríticas convencionales tipo 1

Este artículo describe el procedimiento para la preparación de una versión marcado fluorescentemente de bacteriófago lambda, la infección...

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

Aprende a cuantificar la transinfección bacteriana en células T CD4+ mediante células dendríticas infectadas en modelo murino. Este protocolo permite estudiar la captura y eliminación de patógenos por linfocitos T.

Células T Captura bacterias por transinfection de células dendríticas

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