Name: Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprende a evaluar la irritación ocular con el modelo de tejido epitelial corneal humano reconstruido (RhCE). Este método in vitro clasifica sustancias según su potencial irritante sin usar animales.

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Los autores desean agradecer al Dr. John Harbell por su apoyo y tiempo científica dedicada al proyecto IET. Los autores también desean agradecer a Beiersdorf AG (Alemania), los VII (EE.UU.), Mary Kay Inc. (EE.UU.), Avon Products Inc. (EE.UU.), Procter &amp; Gamble / Cosmital (Suiza), Laboratoire Pierre Fabre (Francia), Harlan Laboratories (Reino Unido), y LVMH Parfume (Francia) para la participación en estudios de la Prueba de Irritación ocular 15 Multi-Centro Internacional de prevalidación y validación.

<ol><li>National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Request+for+Ocular+Irritancy+Test+Data+From+Human%2C+Rabbit%2C+and+In+Vitro+Studies+Using+Standardized+Testing+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Federal+Register%22%5BJournal%5D)">Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods.</a> Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).</li>
<li>Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396 (49), European Commission. 1-849 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Globally+Harmonized+System+of+Classification+and+Labelling+of+Chemicals+%28GHS%29%22">Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS)</a>. , Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).</li>
<li>Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+Study+of+Irritation+and+Toxicity+of+Substances+Applied+Topically+to+the+Skin+and+Mucous+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther+November%22%5BJournal%5D)">Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes.</a> J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).</li>
<li>Adriaens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+analysis+of+the+Draize+test+for+serious+eye+damage%2Feye+irritation%3A+importance+of+understanding+the+in+vivo+endpoints+under+UN+GHS%2FEU+CLP+for+the+development+and+evaluation+of+in+vitro+test+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+tox%22%5BJournal%5D)">Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods.</a> Arch tox. 88, 701-723 (2014).</li>
<li>Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EC%2FHO+international+validation+study+on+alternatives+to+the+Draize+eye+irritation+test%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.</a> Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).</li>
<li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+safety%3A+a+silent+%28in+vitro%29+success+story%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Ocular safety: a silent (in vitro) success story.</a> Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).</li>
<li>Wilhelmus, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Draize+Eye+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The Draize Eye Test.</a> Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).</li>
<li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+alternatives+for+ocular+irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+health+persp%22%5BJournal%5D)">In vitro alternatives for ocular irritation.</a> Environ health persp. 106, 485-492 (1998).</li>
<li>McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ocular+irritation+ranges+of+market-leading+cosmetic+and+personal-care+products+using+an+in+vitro+tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent.</a> Toxicologist. 66, 243(2002).</li>
<li>Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+EpiOcular+assay+for+preclinical+qualification+of+formulas+for+human+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies.</a> Toxicologist. 96, 249(2007).</li>
<li>Yin, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+ocular+irritation+potential+of+surfactants-based+formulations+at+different+concentrations+using+the+EpiOcular+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model.</a> Toxicologist. 108, 378(2009).</li>
<li>Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarbell%2C+J+%22Handbook+of+Toxicology%22">Handbook of Toxicology</a>. , 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).</li>
<li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+EpiOcular%28TM%29+eye+irritation+test+for+hazard+identification+and+labelling+of+eye+irritating+chemicals+in+response+to+the+requirements+of+the+EU+cosmetics+directive+and+REACH+legislation%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation.</a> Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).</li>
<li>Pfannenbecker, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cosmetics+Europe+Multi-Laboratory+Pre-Validation+of+the+EpiOcular+Reconstituted+Human+Tissue+Test+Method+for+the+Prediction+of+Eye+Irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation.</a> Toxicol in vitro. , (2013).</li>
<li>MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , MatTek Corporation. (2014).</li>
<li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiOcular+Eye+Irritation+Test+%28EIT%29+for+Hazard+Identification+and+Labeling+of+Eye+Irritating+Chemicals%3A+Protocol+Optimization+for+Solid+Materials+and+Extended+Shipment+Times%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times.</a> Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).</li>
<li>Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-house+validation+of+the+EpiOcular%28TM%29+eye+irritation+test+and+its+combination+with+the+bovine+corneal+opacity+and+permeability+test+for+the+assessment+of+ocular+irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation.</a> Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).</li>
<li>Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guideline+for+the+Testing+of+Chemicals%22">OECD Guideline for the Testing of Chemicals</a>. , (2014).</li>
<li>Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, , (2003).</li>
<li>Kandarova, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+Upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests+%E2%80%94+An+Assessment+of+the+Performance+of+the+Optimised+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test.</a> Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).</li>
</ol>

Tasas de publicación para este artículo fueron pagados por MatTek Corporation.

Hemos presentado la Prueba de irritación ocular (Figura 1) que fue desarrollado para el modelo de tejido EpiOcular. El IET es capaz de separar los irritantes oculares y corrosivos (GHS Categorías 1 y 2 combinados) a partir de materiales que no requieren etiquetado (GHS No Categoría) con alto grado de sensibilidad y especificidad 17. El IET como se presenta en este documento no discrimina entre SGA Categoría 1 de Categoría 2 productos químicos. El IET fue validado para la clasificación y el etiquetado de potencial de irritación ocular de una amplia gama de productos químicos, incluidos los ingredientes cosméticos y farmacéuticos. En conjunción con otros ensayos in vitro, el EIT servir como un reemplazo para el ensayo de irritación de ojo de conejo in vivo. El IET utiliza dos protocolos similares pero distintos para materiales líquidos y sólidos, que varían en el tiempo de exposición y períodos de incubación después de la exposición (Figura 1). El criterio de valoración utilizado en el IETes la viabilidad del tejido, determinado por el ensayo MTT, que se ha utilizado previamente en modelos validados de tejidos epiteliales humanas 20,21. Para realizar este ensayo, no se necesita ningún equipo especial además de equipo de cultivo celular estándar. Debido al alto nivel de reproducibilidad de tejido-al tejido, n = 2 en lugar de los tejidos generalmente recomienda n = 3 se utilizan. La capacidad de utilizar n = 2 los tejidos es un aspecto crítico del protocolo, ya que permite a un operador con experiencia para procesar simultáneamente dos tejidos, reduciendo así al mínimo la variabilidad del ensayo que puede surgir debido a la diferente manejo de tejidos individuales 14. Además, mediante el uso de n = 2 tejidos por artículo de prueba, la irritación de las 10 sustancias de prueba del mismo estado físico (líquido o sólido), junto con los controles positivos y negativos, se puede evaluar utilizando un kit (24 tejidos). Otros puntos clave que garantizan la clasificación fiable de materiales son las especificaciones para el control positivo Dobstance (viabilidad del tejido ≤50.0%), la reproducibilidad entre los tejidos duplicados (diferencia &lt;20,0%), y las lecturas de DO de control negativo (&gt; 0,8 y &lt;2,5). Al realizar la prueba de IET, es importante seguir el protocolo validado y para la dosificación sugerida y horarios de enjuague (Tablas 3 y 4), ya que la desviación del protocolo o los cambios en los períodos de incubación puede dar lugar a resultados alterados. Del mismo modo, las desviaciones del tiempo de 3 horas para la incubación MTT darán lugar a diferentes lecturas MTT y pueden afectar resultado del ensayo. Ocasionalmente, una sustancia de ensayo puede tener propiedades ópticas o de otro tipo que puedan interferir con la viabilidad del tejido ensayo MTT o reducción causa de MTT. Por ejemplo, un compuesto químico de prueba puede reducir directamente MTT en un producto de reacción azul-púrpura, o puede ser una sustancia coloreada que absorbe la luz en el mismo rango que MTT formazán (~ 570 nm). Sin embargo, estos productos químicos de prueba se present un problema solamente, si en el momento del ensayo MTT, una cantidad suficiente del material todavía está presente en (o absorbida por) el tejido. Para evitar esta interferencia, los procedimientos extensos de enjuague se incorporan en el protocolo de EIT. Si el enjuague no quita el TA y TA interfiere con la reducción del MTT, controles adicionales deben ser utilizados para detectar y corregir para ello. En pocas palabras, si se sospecha de reducción de MTT directa de la sustancia de ensayo, 50 l (o 50 mg de sólidos) del producto químico en cuestión se incuba durante 3 horas con una solución de MTT de trabajo en SCC (NC, 50 l de agua desionizada estéril, debe ser ejecutar simultáneamente). Si la solución de MTT se vuelve azul-púrpura, el artículo de prueba se presume que han reducido el MTT. En este caso, una comprobación funcional utilizando los controles de tejido por congelación muerto se debe realizar para evaluar si el material de prueba es vinculante para el tejido y que conduce a una falsa señal de reducción de MTT. Si hay reducción de MTT apreciable en el control de tejido muerto expuesta-TA(en relación con la cantidad en el tejido viable sin tratar), la viabilidad del tejido media del artículo de prueba debe ser corregido restando la viabilidad media del control matado. El IET yerra en el lado de la seguridad, como lo demuestra la baja incidencia de las clasificaciones negativas falsas 14,15,18. Es importante destacar que ninguno de los productos químicos SGA Categoría 1, que son corrosivos para el ojo y que representan el peligro ocular más grave, fueron clasificados como no irritante en este ensayo 14,15,18,19. Por último, una de las principales ventajas de la RHCE en el método de ensayo in vitro es la posibilidad de probar líquido puro y materiales sólidos (que no es posible con cultivos celulares bidimensionales, sumergidos). El IET contribuirá de manera significativa en la determinación del potencial de irritación ocular de una amplia gama de materiales de acuerdo con la clasificación y el etiquetado del sistema SGA de la ONU. La sustitución de los animales para determinar oToxicidad cular ha sido un objetivo de la investigación toxicológica durante muchos años. El método de prueba IET ha completado un estudio formal de validación con el apoyo de EURL CEVMA en 2014 y de la EpiOcular IET fue implementado en las Directrices de ensayo de la OCDE TG 492 de la OCDE como en 2015.

Los productos de consumo tales como cosméticos, detergentes y productos de limpieza para el hogar incluyen una variedad de sustancias químicas que pueden provocar lesiones graves si entran en contacto con los ojos. Por lo tanto, las pruebas de estos agentes para la irritación de los ojos es requerido por las agencias reguladoras de Estados Unidos y de la UE para garantizar la seguridad de los consumidores 1. Una evaluación del potencial de irritación de los ojos de las mezclas y formulaciones es también un requisito para cumplir con REACH (Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de Sustancias Químicas) legislación para el etiquetado de los ingredientes cosméticos bajo la Directiva sobre cosméticos de la UE para el transporte de productos químicos, y por el etiquetado de los pesticidas y productos para el hogar 2. Actualmente, las agencias reguladoras requieren la evaluación del peligro ocular mediante el Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos (GHS) 3. SGA se basa principalmente en la prueba de irritación ocular de Draize, el ensayo de irritación ocular más utilizado en las que las sustancias extrañas y mixtures se introducen directamente en el saco conjuntival del ojo del conejo 4. De acuerdo con la clasificación del SGA, SGA Categoría 1 (corrosivos oculares) se refiere a las sustancias que causan lesión inicial severo a los tejidos oculares o daño grave al ojo y la visión que no es totalmente reversible en los 21 días después de la exposición 3.5. GHS categoría 2 se refiere a las sustancias que producen cambios significativos en el ojo que son totalmente reversibles en los 21 días de exposición. Las sustancias de ensayo que no son corrosivos o irritantes se conocen como GHS Sin categoría. Durante más de 40 años, la prueba del ojo del conejo de Draize ha sido criticado por su falta de reproducibilidad, la sobreestimación de las respuestas humanas, y el uso de animales vivos 5-8. Estas preocupaciones han alentado a muchas propuestas de refinamiento, reducción y sustitución de la prueba in vivo 9. La necesidad de alternativas sin animales validados se fortaleció aún máspor la adopción de la Séptima Enmienda de la Directiva sobre cosméticos, que prohibió el uso de animales en la evaluación de la seguridad de los productos cosméticos (en 2005) y los ingredientes (en 2009) 2. Desde 1996, el modelo de tejido-córnea como reconstruido ha sido ampliamente utilizado por la industria cosmética para evaluar el potencial de irritación de las materias primas, formulaciones a base de tensioactivos y mezclas que están diseñados para su uso en compuesto, o en las proximidades de, el ojo 10-13. El uso del modelo de tejido RHCE permite la aplicación tópica directa del material de prueba sobre la superficie del tejido en su forma nativa, sin diluir. De esta manera, las formulaciones no solubles en agua pueden ser probados sin diluir con disolventes. En respuesta a la EURL de CEVMA (Centro Europeo Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para la Validación de Métodos Alternativos) solicitud de un método ampliamente aplicable, directa y económica del Test de irritación ocular (IET) que utiliza un single tiempo de exposición y es capaz de separar los irritantes oculares y corrosivos con materiales que no requieren etiquetado fue desarrollado (Figura 1) 14. Basándose en los resultados para 83 productos químicos (44 líquidos y 39 de sólidos), el EIT logra 95,5 / 68,2 / y 81,8% de sensibilidad / especificidad y exactitud (SS &amp; A) para líquidos, 100,0 / 68,4 / y 84,6% SS &amp; A para sólidos, y 97,6 / 68,3 / y 83,1% para el general de las SS &amp; A. En 2007, un multi-laboratorio de estudio de pre-validación patrocinado por Cosméticos Europa (anteriormente Colipa) bajo los auspicios de la CEVMA EURL evaluó la relevancia y fiabilidad del IET con el objetivo de llevar a validación formal 15. En este estudio, se realizaron 298 ensayos independientes en siete laboratorios independientes. Los resultados del estudio demostraron acuerdo de 99,7% en la predicción con bajos coeficientes de variación en todos los laboratorios participantes 15. Como resultado, en 2010 el protocolo EIT entró en una EURL formales CEVMAprograma de validación. El estudio de validación utilizado 104 sustancias químicas de prueba codificadas, incluidas las sustancias individuales y mezclas químicas, para lo cual en vivo los datos de referencia (Draize datos irritación de los ojos) estaban disponibles. Basado en el éxito de este trabajo, una guía de proyecto de ensayo de la OCDE se presentó en 2014. Se prevé que el IET contribuirá de manera significativa a la clasificación del potencial de irritación ocular de una amplia gama de materiales de acuerdo con la clasificación y el etiquetado del sistema SGA de la ONU.

irritación de los ojos de prueba (iet) para la identificación del peligro de los ojos: irrita los productos químicos que utilizan reconstruido humana córnea-como epitelial (rhce) modelo de tejidos

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Para cumplir con la Enmienda Séptima a la legislación Directiva sobre cosméticos y de REACH de la UE de la UE, se necesitan métodos alternativos sin animales validados para la evaluación fiable y exacto de toxicidad ocular en el hombre. Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado un ensayo de irritación ocular (IET), que utiliza un modelo tridimensional reconstruida humano-como córnea epitelial (RHCE) tejido que se basa en las células humanas normales. El IET es capaz de separar los irritantes y corrosivos oculares (SGA Categorías 1 y 2 combinados) y aquellos que no requieren etiquetado (GHS No Categoría). La prueba utiliza dos protocolos separados, uno diseñado para productos químicos líquidos y un segundo protocolo, similar para artículos de prueba sólidos. El modelo de predicción EIT utiliza un único período de exposición (30 min para líquidos, 6 hr para los sólidos) y una sola viabilidad del tejido de corte (60,0% según se determina mediante el ensayo de MTT). Basado en los resultados para 83 productos químicos (44 líquidos y sólidos 39) IET logra 95,5 / 68,2 / 81,8% y sensitivity / especificidad y la precisión (SS &amp; A) para líquidos, 100,0 / 68,4 / 84,6% y SS &amp; A para sólidos y 97,6 / 68,3 / 83,1% y para el general de las SS &amp; A. El EIT contribuirá significativamente a clasificar el potencial de irritación ocular de una amplia gama de productos químicos líquidos y sólidos sin el uso de animales para satisfacer los requisitos de ensayos reglamentarios. El método EpiOcular IET se implementó en 2015 en las Directrices de la OCDE como TG 492.

Resultados EIT representativos realizados con 10 artículos de prueba (TA) y controles negativos y positivos se presentan en la Tabla 6 y la Figura 3. La media OD = 1,31 para la NC corresponde a 100% la viabilidad del tejido, por lo tanto el PC (DO media = 0,41) tenían la viabilidad del tejido relativa de 31,2%. Cuando el protocolo IET se realizó en 15 experimentos independientes válidos en 7 laboratorios utilizando el protocolo de exposición líquida y en 8 experimentos válidos independientes en 4 laboratorios, utilizando el protocolo de exposición sólida, la viabilidad media de tejido para el PC utilizando el protocolo de líquido fue 36,4 ± 4,0 % y 32,3 ± 6,4% para el protocolo de sólidos. En todos los casos, los resultados de los controles positivos fueron por debajo del valor de corte de 60,0% 15. Como se muestra en la Figura 3, TA1, TA2, TA4, TA7, y TA8 tenido viabilidades de tejidos&gt; 60,0% y por lo tanto fueron clasificados como &quot;NI&quot;. TA3, TA5, TA6, TA9 y TA10 tenía Viabilidades tejido X04; 60,0% y por lo tanto fueron clasificados como &quot;I&quot;. La diferencia de la viabilidad del tejido entre los tejidos duplicados era &lt;20,0% para todos los TA con una excepción de TA2. Por lo tanto, los resultados de todos los artículos de prueba, con la excepción de TA2, se consideraron &quot;calificado&quot;, ya que cumplen todos los criterios de aceptación del IET (Sección 10.2). Debido a la alta variabilidad entre tejidos duplicados para TA2 en el experimento inicial, un segundo experimento era necesario para obtener resultados EIT calificados. El método de prueba IET como se describe aquí utilizando el modelo de tejido RHCE se utilizó para la evaluación de la irritación ocular en varios estudios de validación multilaboratorio, incluyendo validación formal por el CEVMA EURL / Cosméticos Europa 15,17-19. En todos los estudios, el IET ha demostrado ser reproducible y fue capaz de identificar correctamente los productos químicos (ambas sustancias y mezclas) que no requieren de clasificación y etiquetado de la irritación ocular o lesiones oculares graves acacuerdo con la ONU GHS 15,17-19. El método de prueba IET cumple los criterios de aceptación del Grupo de Gestión de Validación (VMG) para la irritación de los ojos para la sensibilidad, especificidad y precisión global y en la actualidad está pendiente de aplicación formal a la renovación parcial de conejo en vivo Test Draize 19. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig1.jpg" /> Figura 1: Esquema del protocolo IET para artículos de prueba líquidos y sólidos Abreviaturas utilizadas: AM, medio de ensayo;. SCC, condiciones de cultivo estándar; PBS, fosfato de Dulbecco solución salina tamponada; RT, la temperatura ambiente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig2.jpg" /> Figura 2:. La configuración de la placa de 96 pocillos estandarizado para la prueba de viabilidad del tejido MTT Dos 200 alícuotas son transferred a los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos pre-marcado. Abreviaturas utilizadas: NC, control negativo; PC, control positivo; TA1-TA20, artículos de prueba 1-20; Solución en blanco, de extracción. 96- configuración de placas MTT se utiliza con hoja de cálculo Excel diseñado para calcular la viabilidad del tejido RHCE y los resultados del IET. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig3.jpg" /> Figura 3: Resultados del IET obtuvieron de los artículos 10 de la prueba, Carolina del Norte y los controles de PC utilizando el modelo de tejido RHCE La gráfica se genera a partir de una hoja de cálculo de Excel diseñada para presentar los resultados del IET.. Las sustancias de ensayo que redujo la viabilidad del tejido ≤ 60,0% con respecto a Carolina del Norte se clasifican como irritantes (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 y TA10) y los productos químicos de prueba que tenía la viabilidad del tejido&gt; 60,0% son clasificados como no-irritantes (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7, y TA8). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="7"> Hora de inicio de los pasos de trabajo de protocolo IET (un día de trabajo por un operador) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Cada línea corresponde a un par de tejidos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orden de pasos: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Líquidos: </td><td> PBS </td><td> TA Exposición </td><td> Post- Remoje </td><td> Post- <td> MTT Reacción </td><td> MTT Extracción </td><td> Medida </td></tr><tr><td></td><td> 30 minutos </td><td> 30 minutos </td><td> 12 min </td><td> 120 min </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> Sobredosis </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 10:00 </td><td> 10:12 </td><td> 12:12 </td><td> 15:12 </td><td> después </td></tr><tr><td> Ordenador personal </td><td> 09:01 </td><td> 9:31 </td><td> 10:01 </td><td> 10:13 </td><td> 12:13 </td><td> 15:13 </td><td> 17:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 10:02 </td><td> 10:14 </td><td> 12:14 </td><td> 15:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 &lt;/ strong&gt; </td><td> 09:03 </td><td> 09:33 </td><td> 10:03 </td><td> 10:15 </td><td> 12:15 </td><td> 15:15 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 10:04 </td><td> 10:16 </td><td> 12:16 </td><td> 15:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09:05 </td><td> 09:35 </td><td> 10:05 </td><td> 10:17 </td><td> 12:17 </td><td> 15:17 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 10:06 </td><td> 10:18 </td><td> 12:18 </td><td> 15:18 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:07 </td><td> 09:37 </td><td> 10:07 </td><td> 10:19 </td><td> 12:19 </td><td> 15:19 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 10:08 </td><td> 10:20 </td><td> 12:20 </td><td> 15:20 </td><td></td></tr><tr><td><stro<html> ng&gt; TA-8 </td><td> 09:09 </td><td> 09:39 </td><td> 10:09 </td><td> Veintiuno después de las diez </td><td> Veintiún después de las doce de la noche </td><td> 15:21 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 10:10 </td><td> 10:22 </td><td> 12:22 </td><td> 15:22 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:11 </td><td> 09:41 </td><td> 10:11 </td><td> 10:23 </td><td> 12:23 </td><td> 15:23 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3:. Horario Tiempo de la muestra para la prueba de los artículos de prueba líquidos pasos del protocolo, incluyendo pre-mojar los tejidos con DPBS, Aplicación de los artículos de prueba (TA), enjuague y Post-remojo, periodo post-incubación, ensayo MTT, Extracción de MTT, y medición de OD MTT se presentan en columnas. Los tiempos para los tejidos duplicados se organizan en filas. La totalidad de las pruebas de ensayo de 10 TA y controles se pueden acabar en un día. e_content &quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="439" width="582"><tbody><tr><td colspan="6"> Hora de inicio de los pasos del protocolo del IET (2 días de trabajo para un operador) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Cada línea corresponde a un par de tejidos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Día 1 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Día 2 (día siguiente) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orden de pasos: </td><td> 1 </strong&gt; </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Sólidos: </td><td> PBS </td><td> TA Exposición </td><td> Post- Remoje </td><td> Post- Incubaction </td><td> MTT Reacción </td><td> MTT Extracción </td><td> Medida </td></tr><tr><td></td><td> 30 minutos </td><td> 6 hr </td><td> 26 min </td><td> 18 horas </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> Sobredosis </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 15:30 </td><td> 15:56 </td><td> 09:56 </td><td> 12:56 </td&gt; <td> después </td></tr><tr><td> Ordenador personal </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 15:32 </td><td> 15:58 </td><td> 09:58 </td><td> 12:58 </td><td> 15:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 15:34 </td><td> 16:00 </td><td> 10:00 </td><td> 13:00 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 15:36 </td><td> 16:02 </td><td> 10:02 </td><td> 13:02 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 15:38 </td><td> 16:04 </td><td> 10:04 </td><td> 13:04 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 15:40 </td><td> 16:06 </td><td> 10:06 </td><td> 13:06 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:12 </td><td> 09:42 </td><td> 15:42 </td><td> 16:08 </td><td> 10:08 &lt;/ Td&gt; <td> 13:08 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:14 </td><td> 09:44 </td><td> 15:44 </td><td> 16:10 </td><td> 10:10 </td><td> 13:10 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:16 </td><td> 09:46 </td><td> 15:46 </td><td> 16:12 </td><td> 10:12 </td><td> 13:12 </td><td></td></tr><tr><td> TA-8 </td><td> 09:18 </td><td> 09:48 </td><td> 15:48 </td><td> 16:14 </td><td> 10:14 </td><td> 13:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:20 </td><td> 09:50 </td><td> 15:50 </td><td> 16:16 </td><td> 10:16 </td><td> 13:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:22 </td><td> 09:52 </td><td> 15:52 </td><td> 16:18 </td><td> 10:18 </td><td> 13:18 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 4: horario Tiempo de la muestra para la prueba de los artículos de prueba sólidos. Pasos del protocolo incluyendo pre-humectación de los tejidos con DPBS, Aplicación de los artículos de prueba, aclarado y Post-remojo, período post-incubación, el ensayo de MTT, Extracción de MTT, y medición de OD MTT se presentan en columnas. Los tiempos para los tejidos duplicados se organizan en filas. Todo el ensayo de prueba de 10 TA y controles se lleva a cabo durante un período de dos días. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Cantidad </td><td> Reactivo </td><td> Condiciones de almacenamiento </td><td> Fuente </td><td> Descripción </td><td> Fecha de caducidad </td></tr><tr><td> 1 vial, 2 ml </td><td> MTT Concentrado (MTT-100-CON) </td><td> Protegido de la luz (-20ºC) </td><td> MatTek </td><td> Frozen MTT concentrado </td><td> 2 meses </td></tr><tr><td> 1 vial, 8 ml </td><td> MTT diluyente </td><td> 2-8 y# 186; C </td><td> MatTek </td><td> Para diluir el concentrado MTT antes de su uso en el ensayo de MTT </td><td> 2 meses </td></tr><tr><td> 1 botella, 60 ml </td><td> Isopropanol (CAS # 67-63-0) </td><td> RT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Solución de extracción </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabla 5: MTT-100 Componentes del kit de ensayo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Código N ° </td><td> Tejidos </td><td colspan="2"> Los datos en bruto </td><td colspan="2"> Datos corregidos en blanco </td><td rowspan="2"> media de OD </td><td rowspan="2"> % De la viabilidad </td></tr><tr><td></td><td> n </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td></tr><tr><td> NC </td><td>1 </td><td> 1,316 </td><td> 1,352 </td><td> 1,316 </td><td> 1,352 </td><td> 1,334 </td><td> 101.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,277 </td><td> 1,309 </td><td> 1,277 </td><td> 1,309 </td><td> 1,293 </td><td> 98.4 </td></tr><tr><td> Ordenador personal </td><td> 1 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,388 </td><td> 29.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,431 </td><td> 32.8 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1 </td><td> 1,213 </td><td> 1,244 </td><td> 1,213 </td><td> 1,244 </td><td> 1,229 </td><td> 93.5 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 103.2 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 1 </td><td> 1,210 </td><td> 1,122 </td><td> 1,210 </td><td> 1,122 </td><td> 1,166 </td><td> 88.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,833 </td><td> 63.4 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 1 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 12.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,137 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1 </td><td> 1,137 </td><td> 1,160 </td><td> 1,137 </td><td> 1,160 </td><td> 1,149 </td><td> 87.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,262 </td><td> 1,191 </td><td> 1,262 </td><td> 1,191 </td><td> 1,227 </td><td> 93.4 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 1 </td><td> 0,610 </td><td> 0,621 </td><td> 0,610 </td><td> 0,621 </td><td> 0,616 </td><td> 46.9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,482 </td><td> 36.7 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 1 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,508 </td><td> 38.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,402 </td><td> 30.6 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1 </td><td> 1,048 </td><td> 1,050 </td><td> 1,048 </td><td> 1,050 </td><td> 1,049 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,149 </td><td> 1,150 </td><td> 1,149 </td><td> 1,150 </td><td> 1,150 </td><td> 87.5 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 1 </td><td> 1,032 </td><td> 1,034 </td><td> 1,032 </td><td> 1,034 </td><td> 1,033 </td><td> 78.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,938 </td><td> 71.4 </td></tr><tr><td> TA9 </td&gt; <td> 1 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,147 </td><td> 11.2 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 1 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 11.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,255 </td><td> 19.4 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> significar </td><td> Dif. </td><td> significado de </td><td> Dif. </td><td> Dif. / 2 </td><td colspan="2"> Clasificación </td></tr><tr><td></td><td> de OD </td><td> de OD </td><td> viabilidades [%] </td><td> de viabilidades </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NC </td><td> 1,314 </td><td> 0,041 </td><td> 100.0 </td><td> 3.12 </td><td> 1.56 </td><td> NI </td><td> calificado </td></tr><tr><td> Ordenador personal </td><td> 0,410 </td><td> 0,043 </td><td> 31.2 </td><td> 3.23 </td><td> 1.62 </td><td> YO </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1,292 </td><td> 0,127 </td><td> 98.3 </td><td> 9.63 </td><td> 4.81 </td><td> NI </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 0,999 </td><td> 0,333 </td><td> 76.1 </td><td> 25.36 </td><td> 12.68 </td><td> NI </td><td> D&gt; 20 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 0,152 </td><td> 0,030 </td><td> 11.6 </td><td> 2.32 </td><td> 1.16 </td><td> YO </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1,188 </td><td> 0,078 </td><td> 90.4 </td><td> 5.94 </td><td> 2.97 </td><td> NI </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 0,549 </td><td> 0,134 </td><td> 41.8 </td><td> 10.16 </td><td> 5.08 </td><td> YO </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 0,455 </td><td> 0,106 </td><td> 34.6 </td><td> 8.07 </td><td> 4.03 </td><td> YO </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1,100 </td><td> 0,101 </td><td> 83.7 </td><td> 7.65 </td><td> 3.82 </td><td> NI </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 0,986 </td><td> 0,095 </td><td> 75.0 </td><td> 7.23 </td><td> 3.62 </td><td> NI </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA9 </td><td> 0,085 </td><td> 0,125 </td><td> 6.4 </td><td> 9.48 </td><td> 4.74 </td><td> YO </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 0,203 </td><td> 0,105 </td><td> 15.4 </td><td> 7.95 </td><td> 3.98 </td><td> YO </td><td> calificado </td></tr></tbody></table> Tabla 6:. Los resultados obtenidos del IET por 10 artículos de prueba, controles NC y PC Las mesas son produced por una hoja de cálculo de Excel diseñado para calcular la viabilidad del tejido y los resultados del IET. Las sustancias de ensayo que redujo la viabilidad del tejido ≤ 60,0% con respecto a Carolina del Norte se clasifican como irritantes (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 y TA10) y los productos químicos de prueba que tenía la viabilidad del tejido&gt; 60,0% son clasificados como no-irritantes (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7, y TA8).

Hemos desarrollado un ensayo de irritación ocular que utiliza un modelo de tejido tridimensional epitelial-córnea como humana reconstruida (RHCE). La prueba es capaz de discriminar entre irritante ocular y materiales corrosivos (SGA Categorías 1 y 2 combinados) y aquellos que no requieren etiquetado (GHS No Categoría).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

El objetivo general de la prueba de irritación ocular es clasificar y etiquetar sustancias y mezclas de acuerdo con su potencial de irritación ocular. Este procedimiento utiliza un modelo tridimensional de tejido corneal reconstruido. Al llegar, el kit de prueba se preincuba durante la noche en el medio del ensayo; al día siguiente, los tejidos se hidratan, seguido de la aplicación tópica de los controles positivo y negativo y de las sustancias químicas de prueba de interés sobre las superficies de los tejidos por duplicado.Después de un período fijo de exposición, los productos químicos de prueba se eliminan mediante lavado. Los tejidos se incuban posteriormente en medio de ensayo fresco y la toxicidad de los productos químicos se evalúa entonces mediante un ensayo de MTT. En última instancia, el potencial irritante de los artículos de prueba puede evaluarse comparando la viabilidad relativa de los tejidos tratados con el artículo de prueba respecto a los tejidos tratados con el control negativo.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como las pruebas rápidas de irritación en trazas, es que no requiere el uso de animales de laboratorio. Utiliza un modelo de tejido ocular in vitro descompuesto similar a la córnea, que consta de células humanas normales. Es aplicable a todo tipo de sustancias y mezclas y puede discriminar entre productos químicos que provocan irritación ocular o daños oculares graves frente a otros materiales.No irritantes que no requieren clasificación ni etiquetado. El tejido epitelial corneal humano reconstruido, o similar al epitelio corneal, se prepara en insertos con una membrana porosa a través de la cual pasan los nutrientes a las células.El tejido reconstruido forma un epitelio no queratinizado que modela el epitelio corneal con células progresivamente estratificadas pero no corificadas. Al recibir el kit epitelial similar a la córnea humana, equilibre los tejidos en el recipiente de envío de 24 pocillos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, abra la bolsa que contiene la placa de tejido de 24 pocillos bajo condiciones estériles e inspeccione todos los tejidos en busca de burbujas de aire entre el gel agros y los insertos. Corte. Abra la cinta.Retire la cubierta con una gasa estéril e inspeccione la superficie del tejido. A continuación, distribuya un mililitro de medio de ensayo del kit a 37 grados Celsius en los pocillos de placas de seis pocillos previamente etiquetadas. Luego, utilice fórceps estériles para absorber suavemente los insertos que contienen tejido sobre gasa estéril y eliminar cualquier exceso de líquido de transporte, y colóquelos en los pocillos individuales de las placas de seis pocillos.Después de una hora, reemplace el medio con un mililitro de medio de ensayo fresco a 37 grados Celsius y incube los tejidos durante la noche en condiciones estándar de cultivo. Al día siguiente, agregue 20 microlitros de DPBS libre de calcio y magnesio sobre la superficie apical de cada tejido. Si el DPBS no se extiende sobre los tejidos, sostenga suavemente el inserto con pinzas y golpee ligeramente la placa para asegurar que la solución salina humedezca toda la superficie del tejido.Incube las placas durante 30 minutos. Luego, para tratar los tejidos con artículos de prueba líquidos, aplique 50 microlitros del control negativo, el control positivo y los artículos de prueba apropiados por duplicado según el cronograma. Tenga cuidado de asegurar que los tratamientos cubran completamente las superficies de los tejidos y luego incube los insertos durante 30 minutos para tratar los tejidos con artículos de prueba sólidos.Primero, transfiera los insertos a una superficie estéril. Mantenga la placa cubierta para evitar la contaminación con partículas sólidas en el aire. Luego, utilizando una cuchara nivelada, aplique tópicamente 50 miligramos del artículo de prueba sobre los tejidos duplicados según el cronograma, teniendo cuidado de que el tratamiento cubra toda la superficie del tejido.Alternativamente, utilice una jeringa prefabricada de un mililitro con la cabeza cortada. Para colocar los polvos directamente sobre el cultivo. Presione el émbolo para aplicar el polvo inmediatamente después de aplicar los artículos de prueba sólidos, regrese los insertos a sus placas de seis pocillos e incube los tejidos durante seis horas para enjuagarlos.Después del tratamiento, al final de la incubación de exposición, llenar 3 vasos de precipitado de 150 mililitros por artículo de prueba con 100 mililitros de DPBS. Sujetar el borde superior de los insertos con pinzas curvas para retirarlos de los pocillos. Luego, utilizando pinzas, tomar dos insertos del mismo tratamiento por sus bordes superiores y verter los tratamientos sobre un material absorbente limpio.A continuación, sumerja los insertos en el primer vaso de DPBS, lavando los tejidos con un movimiento circular giratorio durante dos segundos. Luego levante los insertos de manera que queden mayormente llenos de DPBS y vierta el líquido nuevamente en el vaso. Repita el lavado dos veces en el primer vaso.Luego enjuague los insertos en el segundo y tercer vasos de DPBS 3 veces cada uno de la misma manera después del último lavado. Gire cada inserto hasta un ángulo aproximado de 45 grados con el extremo abierto hacia abajo y toque el borde superior con el material absorbente para verter cualquier DPBS restante. A continuación, sumerja inmediatamente los tejidos en cinco mililitros de medio de ensayo a temperatura ambiente.En una placa preetiquetada de 12 pocillos al final del período de inmersión posterior al remojo, deseche el medio de ensayo y seque los insertos sobre un material absorbente. A continuación, transfiera los insertos a una nueva placa de seis pocillos que contenga un mililitro de medio de ensayo tibio por pocillo, y coloque las placas en el incubador para iniciar el ensayo de viabilidad con MTT. Transfiera los insertos a una placa de 24 pocillos que contenga 0,3 mililitros de solución de MTT recién preparada.Seque los insertos sobre el material absorbente antes de la transferencia. Libere cualquier burbuja de aire atrapada debajo de los insertos y devuelva los tejidos al incubador después de tres horas, colocando las bases de los insertos sobre el material absorbente. Luego, para la extracción sumergida de artículos de prueba líquidos no colorantes, sumerja los insertos en una placa de 24 pocillos previamente etiquetada que contenga dos mililitros de la solución de extracción adecuada por pocillo; para una extracción no sumergida de colorantes sólidos o líquidos.Transfiera los insertos a una placa de seis pocillos previamente etiquetada que contenga un mililitro de solución de extracción por pocillo. Luego, selle las placas con un sellador térmico o parafilm para inhibir la evaporación y realice la extracción en un agitador orbital durante dos a tres horas a temperatura ambiente con agitación suave al final de la extracción sumergida. Perfore los tejidos y luego vierta el líquido de cada inserto nuevamente al pocillo correspondiente; a continuación, deseche los insertos junto con los tejidos.Mezcle la solución de extracto en cada pocillo y transfiera dos alícuotas de 200 microlitros de cada muestra a los pocillos correspondientes de una placa de 96 pocillos previamente etiquetada, como se ilustra en el esquema al final de la extracción no sumergida. Deseche los insertos y los tejidos sin perforar y agregue un mililitro de solución de extracción a cada uno. Mezcle bien la solución de extracción en los pocillos y transfiera dos alícuotas de 200 microlitros de cada muestra a los pocillos correspondientes de una placa de 96 pocillos previamente etiquetada, tal como se acaba de demostrar.Finalmente, lea la densidad óptica de las muestras en un espectrofotómetro de 96 pocillos a una longitud de onda de 570 nanómetros sin utilizar un filtro de referencia e introduzca los resultados en una hoja de cálculo para calcular las viabilidades tisulares respectivas. Tenga en cuenta las correcciones debidas a la interferencia del producto químico en prueba, como se indica en el protocolo del texto; aquí se muestran resultados representativos de una prueba de irritación ocular realizada con 10 artículos de prueba, así como controles negativos y positivos. Se observó una densidad óptica media de 1,31 para el control negativo, correspondiente a una viabilidad tisular del 100 %, y una viabilidad tisular relativa del 31,2 % para el control positivo. Los artículos de prueba 1, 2, 4, 7 y 8 exhibieron viabilidades tisulares superiores al 60 %, clasificando a estos artículos como no irritantes; los artículos de prueba 3, 5, 6, 9 y 10.Por otro lado, exhibieron variabilidades en los tejidos menores o iguales al 60%, lo que resultó en su clasificación como irritantes. La diferencia en la viabilidad del tejido entre tejidos duplicados en este experimento fue menor al 20% para todos los artículos evaluados, con la excepción del artículo de prueba dos. Por lo tanto, los resultados de todos los artículos de prueba, excepto el artículo de prueba dos, se consideraron válidos, ya que cumplieron con todos los criterios de aceptación del ensayo de irritación ocular.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la prueba de DICATION, utilizando un modelo in vitro de tejido corneal humano reconstruido similar al tipo cuatro, para la identificación de peligros y etiquetado de productos químicos. Este procedimiento se ha implementado en las directrices de la prueba EOC D como parte de la estrategia de pruebas por niveles.

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Bioingeniería

En este video, se demuestra la piel EpiDerm ensayo de irritación (EpiDerm SIT) elaborado y validado...

Un In Vitro</emPiel> Prueba de irritación (SIT) con la epidermis humana reconstruida epidérmico (CHE) Modelo

Ofrecemos un método reproducible para el cultivo de las monocapas confluentes de células fetales humanas del epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) las células que presentan la morfología, la fisiología, la polaridad, y la proteína y los patrones de expresión génica del tejido nativo adulto. Este trabajo se ha extendido a un modelo animal de enfermedades de los ojos de varios.

Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología

Este informe describe un método para inducir ojo seco autoinmune crónico en ratas Lewis mediante inmunización con una emulsión de extracto de glándula lacrimal de rata, ovoalbúmina y adyuvante completo de Freund, seguido de la inyección de extracto de glándula lagrimal y ovoalbúmina en la subconjuntiva forniceal y glándulas lacrimales Seis semanas después.

Un modelo de rata ocular seca autoinmune crónica con aumento de células T de memoria efector en tejido de globo ocular

Pequeña proyección inhibitoria de RNA alto rendimiento es una herramienta importante que podría ayudar a aclarar más rápidamente los mecanismos moleculares de la lesión epitelial córnea química. Adjunto, presentamos el desarrollo y validación de modelos de exposición y métodos para el cribado de alto rendimiento de lesiones epiteliales de córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno y la cloropicrina.

Proyección de SiRNA de alto rendimiento para lesión de célula epitelial cloropicrina y córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno

Este artículo describe el desarrollo de un método para inducir la enfermedad aguda o crónica del ojo seco en conejos mediante la inyección de concanavalina A a todas las porciones del sistema de glándulas lagrimales orbitales. Este método, superior a los ya reportados, genera un modelo reproducible y estable de ojo seco adecuado para el estudio de agentes farmacológicos.

Un modelo de conejo de enfermedad ocular seca acuosa-deficiente inducida por la inyección de Concanavalin A en las glándulas lagrimales: Aplicación a estudios de eficacia de fármacos

El propósito de este protocolo es evaluar si diversas formulaciones artificiales del rasgón pueden proteger las células epiteliales córneas humanas contra la desecación usando un modelo in vitro. Después de la exposición a formulaciones artificiales del rasgón y a la desecación, las células epiteliales córneas humanas se evalúan para la actividad metabólica.

Efecto De Las Formulaciones Artificiales De Lágrima En La Actividad Metabólica De Las Células Epiteliales Corneales Humanas Después De La Exposición A La Desecación

Este protocolo describe un método sencillo para cultivar epidermis humana reconstituida tridimensional de una manera reproducible y robusta. Además, caracteriza la relación estructura-función del modelo de barrera epidérmica. Las respuestas biológicas de la epidermis humana reconstituida sobre estímulos proinflammatory también se presentan.

El cultivo de una epidermis humana reconstruida tridimensional a gran escala

Este artículo describe los procedimientos utilizados para evaluar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas químicas en una línea celular primaria e inmortalizada.

Determinación de la toxicidad de la radiación UV y los productos químicos en las células epiteliales corneales humanas primarias e inmortalizadas

Aquí, se desarrollan modelos animales basados en ratones y conejos para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal para detectar nuevas terapias y el mecanismo subyacente.

Modelos animales ex vivo e in vivo para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal

El cultivo de órganos ex vivo de córnea porcina y la cicatrización de heridas epiteliales proporcionan un medio económico, ético, reproducible y cuantitativo para probar la toxicidad ocular de los productos químicos. También ayudan a dilucidar los mecanismos subyacentes a la regulación de la epitelización y la reparación de tejidos, y a evaluar terapias para el tratamiento de la queratopatía diabética y el retraso en la cicatrización de heridas.

Evaluación de la toxicidad terapéutica y química mediante el cultivo de órganos de córneas porcinas y la cicatrización de heridas epiteliales

Se presenta un protocolo reproducible para la preparación, enriquecimiento y aplicación de un hidrogel in situ de luz azul cruzada–gelatina–riboflavina reticular para la reparación de heridas estromales corneales en conejos, incluyendo pasos procedimentales para el manejo quirúrgico, tarsorrafia parcial y cuidados postoperatorios.

Fabricación y aplicación quirúrgica de hidrogeles enriquecidos foto-reticulados gelatina–riboflavina para la reparación de heridas corneales en conejos

Aprende a evaluar la irritación ocular con el modelo de tejido epitelial corneal humano reconstruido (RhCE). Este método in vitro clasifica sustancias según su potencial irritante sin usar animales.

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos (Video) | JoVE Journal

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

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