Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

El objetivo general de la prueba de irritación ocular es clasificar y etiquetar sustancias y mezclas según su potencial de irritación ocular. Este procedimiento utiliza un modelo tridimensional de tejido similar a una córnea reconstruida. A su llegada, el kit de prueba se preincuba durante la noche en el medio de ensayo al día siguiente, los tejidos se hidratan, seguido de la aplicación tópica de los controles positivos y negativos y los productos de prueba de interés en las superficies de los tejidos por duplicado.

Después de un período fijo de exposición, los productos químicos de prueba se eliminan mediante lavado. Los tejidos se incuban posteriormente en un medio de ensayo fresco y la toxicidad de los productos químicos se evalúa mediante el ensayo MTT. En última instancia, el potencial irritante de los artículos de prueba puede evaluarse comparando la viabilidad relativa de los tejidos tratados con el artículo de prueba con los tejidos tratados con control negativo.

La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como las pruebas rápidas de irritación de trazas, es que no involucra animales de laboratorio. Utiliza un modelo de tejido ocular similar a cornal deconstruido in vitro, que se compone de células humanas normales. Es aplicable a todo tipo de sustancias y mezclas y puede discriminar entre productos químicos que inducen irritación ocular o daños oculares graves causados por los materiales.

No irritantes que no requieren clasificación y etiquetado. La córnea humana reconstruida como tejido epitelial o epi. El ocular se prepara en insertos con una membrana porosa a través de la cual los nutrientes pasan a las células.

El tejido reconstruido forma un epitelio no queratinizado que modela el epitelio de la córnea con células progresivamente estratificadas pero no cornificadas. Al recibir el kit epitelial similar a la córnea humana, equilibre los tejidos en el contenedor de envío de 24 pocillos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, abra la bolsa que contiene la placa de tejido de 24 pocillos en condiciones estériles e inspeccione todos los tejidos en busca de burbujas de aire entre el gel agros y los insertos. Cortar. Abra la cinta.

Retire la cubierta con una gasa estéril e inspeccione la superficie del tejido. A continuación, alícuota de un mililitro de medio de ensayo de 37 grados Celsius en los pocillos de placas de seis pocillos premarcadas. A continuación, utilice pinzas estériles para secar suavemente el tejido que contiene los insertos en una gasa estéril para eliminar los restos de abono y colocarlos en pocillos individuales de las placas de seis pocillos.

Después de una hora, reemplace el medio con un mililitro de medio de ensayo fresco a 37 grados Celsius e incube los tejidos en condiciones de cultivo estándar durante la noche. Al día siguiente apliqué 20 microlitros de DPBS libres de calcio y magnesio en la superficie apical de cada tejido. Si el DPBS no se extiende por los tejidos, sujete suavemente el inserto con pinzas y golpee la placa para asegurarse de que la solución salina humedezca toda la superficie del tejido.

Incubar las placas durante 30 minutos. A continuación, para tratar los tejidos con artículos de prueba líquidos, aplique 50 microlitros del control negativo, el control positivo y los artículos de prueba apropiados por duplicado según el horario. Asegúrese de que los tratamientos cubran toda la superficie del tejido y, a continuación, incube los insertos durante 30 minutos para tratar los tejidos con artículos de prueba sólidos.

Primero, transfiera los insertos a una superficie estéril. Mantenga la placa cubierta para evitar la contaminación con partículas sólidas en el aire. A continuación, con una cuchara rasa, aplique tópicamente 50 miligramos del artículo de prueba sobre los tejidos duplicados según el horario, cuidando de que el tratamiento cubra toda la superficie del tejido.

Alternativamente, use una jeringa precargada de un mililitro con la cabeza cortada. Colocar los polvos directamente sobre el cultivo. Presione el émbolo para aplicar el polvo inmediatamente después de aplicar los artículos de prueba sólidos, regrese los insertos a sus placas de seis pocillos e incube los tejidos durante seis horas para enjuagar los tejidos.

Después del tratamiento, llene 3 vasos de precipitados de 150 mililitros por artículo de prueba con 100 mililitros de DPBS al final de la incubación de la exposición. Sujete el borde superior de los insertos con pinzas curvas para extraerlos de los pocillos. Luego, con pinzas, tome dos insertos del mismo tratamiento por sus bordes superiores y decante los tratamientos en un material absorbente limpio.

A continuación, sumerja los insertos en el primer vaso de precipitados de DPBS lavando los pañuelos con un movimiento circular giratorio durante dos segundos. A continuación, levante los insertos de modo que estén en su mayor parte llenos de DPBS y decante el líquido de nuevo en el vaso de precipitados. Repita el lavado dos veces en el primer vaso de precipitados.

A continuación, enjuague los insertos del segundo y tercer vaso de precipitados de DPB S3 veces cada uno de la misma manera después del último lavado. Gire cada inserto en un ángulo de aproximadamente 45 grados con el extremo abierto hacia abajo y toque el labio superior con el material absorbente para decantar cualquier DPBS restante. A continuación, sumerja inmediatamente los tejidos en cinco mililitros de medio de ensayo a temperatura ambiente.

En una placa preetiquetada de 12 pocillos al final del período de inmersión posterior al remojo, decantar el medio de ensayo y secar los insertos sobre un material absorbente. A continuación, transfiera los insertos a una nueva placa de seis pocillos que contenga un mililitro de medio de ensayo tibio por pocillo y coloque las placas en la incubadora para iniciar el ensayo de viabilidad MTT. Transfiera los insertos a una placa de 24 pocillos que contenga 0,3 mililitros de solución MTT recién preparada.

Aplique los insertos sobre el material absorbente antes de la transferencia. Libere las burbujas de aire atrapadas debajo de los insertos y devuelva los tejidos a la incubadora después de tres horas, coloque la parte inferior de los insertos en el material absorbente. Luego, para la extracción sumergida de artículos de prueba líquidos no colorantes, sumerja los insertos en una placa preetiquetada de 24 pocillos que contenga dos mililitros de la solución de extracción adecuada por pocillo para una extracción no sumergida de colorantes sólidos o líquidos.

Transfiera los insertos a una placa preetiquetada de seis pocillos que contenga un mililitro de solución de extracción por pocillo. A continuación, selle las placas con un sellador térmico o un paraforme para inhibir la evaporación y extráigalas en un agitador orbital durante dos o tres horas a temperatura ambiente con una suave agitación al final de la extracción sumergida. Perfore los pañuelos y luego decante el líquido dentro de cada inserto nuevamente en el pozo, luego deseche los insertos con los pañuelos.

Mezcle la solución de extracción en cada pocillo y transfiera dos alícuotas de 200 microlitros de cada muestra a los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos preetiquetada, como se ilustra en el esquema al final de la extracción no sumergida. Deseche los insertos y tejidos sin perforar y agregue un mililitro de solución de extracción a cada uno. Mezcle la solución de extracción en los pocillos y transfiera dos alícuotas de 200 microlitros de cada muestra a los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos preetiquetada como se acaba de demostrar.

Finalmente, lea la densidad óptica de las muestras en un espectrofotómetro de 96 pocillos a una longitud de onda de 570 nanómetros sin usar un filtro de referencia e ingrese los resultados en una hoja de cálculo para calcular los pasivos tisulares respectivos. En este experimento se muestran los correctivos debidos a la interferencia del producto de prueba como se indica en el protocolo de texto aquí, los resultados representativos de las pruebas de irritación ocular realizadas con 10 artículos de prueba y los controles negativos y positivos. Se observó una densidad óptica media de 1,31 para el control negativo correspondiente a un 100% de viabilidad tisular con una viabilidad relativa tisular de 31,2%Para la prueba de control positivo los artículos 1, 2, 4, 7 y ocho presentaron variabilidades tisulares superiores al 60%, clasificándolos como no irritantes en los artículos 3, 5, 6, 9 y 10 de la prueba.

Por otro lado, presentaron variabilidades tisulares menores o iguales al 60%, lo que resultó en su clasificación como irritantes. La diferencia en la viabilidad de los tejidos entre los tejidos duplicados en este experimento fue inferior al 20% para todos los artículos analizados, con la excepción del artículo de prueba dos. Por lo tanto, los resultados de todos los artículos de prueba, excepto el artículo de prueba dos, se consideraron calificados, ya que cumplían con todos los criterios de aceptación de la prueba de irritación ocular.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo debe realizar la prueba DICATION, utilizando córnea humana reconstructiva in vitro como modelo de tejido cuatro, etiquetado de identificación de peligros de productos químicos. Este procedimiento se ha implementado en las directrices de prueba EOC D como parte de la estrategia de pruebas de niveles.