Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el metabolismo de ácidos grasos en hepatocitos primarios de ratón. Esto se logra primero perfundiendo el hígado de un ratón con un medio de digestión, extrayéndolo y luego aislándolos hepatocitos. El segundo paso consiste en cultivar los hepatocitos en placas recubiertas con colágeno.

A continuación, los hepatocitos se tratan con las intervenciones experimentales que se desean probar. El paso final consiste en incubar las células en presencia de un sustrato marcado con radioisótopos. Finalmente, mediante análisis de centelleo líquido se muestran los efectos de diversas intervenciones farmacológicas o genéticas sobre la oxidación de ácidos grasos o la lipogénesis en hepatocitos primarios.

Este método puede ayudar a responder varias preguntas clave en el campo del metabolismo y la diabetes, incluyendo cómo intervenciones farmacológicas y genéticas específicas afectan la biología de los hepatocitos. La demostración visual de este método es fundamental por dos razones. Primero, es difícil obtener condiciones específicas de perfusión que afecten la salud de los hepatocitos, y segundo, la cuantificación del dióxido de carbono liberado.

El gas no es intuitivo. Esta prueba será demostrada por Tom Akey, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Configure la bomba peristáltica colocando un extremo de un tubo estéril en el medio de perfusión hepática precalentado y el otro extremo en un recipiente de desecho.

Encienda la bomba hasta que toda la longitud del tubo esté llena de medio. Tras sacrificar un ratón de interés, rocíe abundantemente el abdomen del ratón con etanol al 70 %. Luego, use tijeras de punta roma para hacer una incisión media a través de la dermis, a lo largo del abdomen, y refleje lateralmente.

Realice una incisión similar en el peritoneo para exponer las vísceras. Utilizando un instrumento romo, desplace suavemente los intestinos. Para exponer la vasculatura abdominal, localice la vena cava inferior abdominal y coloque una sutura debajo del vaso sanguíneo distal a la vena renal, distal a la sutura.

Coloque una aguja y un catéter en la vena cava inferior e introdúzcalos más allá del punto de sutura. Con la aguja aún en su lugar, ate el hilo alrededor del catéter para mantenerlo fijo y luego retire cuidadosamente la aguja. Si se realiza correctamente, la sangre fluirá a través del catéter utilizando una pipeta.

Llene el área restante del catéter con medio de perfusión y asegúrese de que no haya aire presente. Luego, con mucho cuidado, conecte el tubo al catéter. A continuación, punce cuidadosamente el diafragma con tijeras de punta afilada y realice una incisión lateral para exponer la cavidad pleural.

Teniendo cuidado de evitar la vesícula biliar y la vasculatura pleural, coloque una pinza bulldog alrededor de la vena cava inferior torácica justo proximal a la vena hepática. Luego corte la vena porta y encienda la bomba a tres o cuatro mililitros por minuto. Perfunda el hígado con medio de perfusión para hígado durante cinco minutos, utilizando aproximadamente 20 mililitros de medio de perfusión.

Durante este tiempo, observe el cambio inmediato de color del hígado de rojo a un color grisáceo o marrón claro. Si algunas porciones del hígado permanecen rojas, es probable que esto indique una perfusión deficiente y que la probabilidad de un aislamiento exitoso se reduzca considerablemente. Tras la perfusión de cinco minutos, detenga la bomba y transfiera el tubo al medio de digestión hepática.

Reinicie la bomba y perfunda el hígado durante otros 10 a 15 minutos a una velocidad de tres a cuatro mililitros por minuto hasta que se agote el medio. Al final de la perfusión, detenga la bomba.

El hígado debe tener un tono rosado y aparecer algo agrandado. En este punto, extirpe el hígado mediante una disección cuidadosa. Transfiera a una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros y retire la vesícula biliar.

A continuación, agregue 10 mililitros de medio de siembra al hígado y comience a raspar suavemente el hígado utilizando un escalpelo. Para eliminar los hepatocitos, filtre la suspensión mediante un tamiz celular de 100 micrones y transfiérala a un tubo cónico de 50 mililitros. Lave la placa con 10 mililitros adicionales de medio de siembra y aspire el líquido hacia el tubo cónico de 50 mililitros.

Luego, pelletice las células a cuatro grados Celsius, centrifugando durante cinco minutos a 350 G, aspire el medio y resuspenda el pellet celular en 10 mililitros de medio de siembra. A continuación, agregue 10 mililitros de sílice coloidal al 90 % recubierta con polivinil perona mezclando suavemente, y luego pelletice las células como antes. Tras la centrifugación, aspire la capa de células muertas que flota en la parte superior de la mezcla.

Luego, lave las células vivas en el sedimento dos veces con 20 mililitros de medio de siembra. Suspender el sedimento final de células en 10 mililitros de medio de siembra y contar las células utilizando un hemocitómetro. Coloque 90.000 células por pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos recubiertas con colágeno. Incube las placas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos horas, entre 16 y 20 horas antes de comenzar el ensayo.

Lave las células dos veces con PBS tibio y cambie las células a un medio libre de suero para la privación de suero, con 20 nanomoles de glucagón. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, por la mañana del ensayo.

Prepare el medio de preincubación y luego sustituya el medio con privación de suero. Medio para la preincubación. Incube las células en esta mezcla a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos horas durante la incubación.

Seque 0,5 microcurios por pocillo de palmitato C14 evaporando el disolvente de etanol bajo nitrógeno aproximadamente 15 minutos antes del final de la incubación; reconstituya el palmitato C14 a 12,5 microlitros por microcurio en hidróxido de sodio 0,1 N. Incube la mezcla a 70 grados Celsius durante 10 minutos. Luego agregue tres volúmenes de medio de preincubación tibio y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Añada 25 microlitros de la mezcla de palmitato C 14 diluido a cada pocillo agitando suavemente la placa e incube a 37 grados Celsius durante 90 minutos. Esta es la placa de ensayo. Durante la incubación, retire la tapa de una placa estéril de 24 pocillos y coloque un trozo de papel filtro de dos centímetros por dos centímetros en el fondo de cada uno de los pocillos. Luego, coloque encima de la placa un trozo de param de cuatro pulgadas por siete pulgadas utilizando un objeto rectangular grande, como una caja de puntas para micropipeta.

Frote el paraformo sobre los pocillos para perforar el paraformo en las aberturas de los pocillos y crear un sello sobre el resto de la placa. Luego retire los círculos perforados de paraformo. Cubriendo ahora los pocillos 10 minutos antes del final de la incubación, agregue 200 microlitros de hidróxido de sodio normal tres veces a cada pocillo de la placa de papel filtro, asegurándose de que el papel filtro absorba todo el líquido.

Al finalizar la incubación, congele rápidamente la placa de ensayo en nitrógeno líquido. A continuación, agregue 100 microlitros de ácido perclórico al 70 % a cada pocillo de la placa de ensayo. Inmediatamente cúbrala con una placa de papel filtro y coloque las placas en un agitador orbital.

Agite las placas a una velocidad orbital de 80 RPM a temperatura ambiente durante dos horas. Luego, mida la fracción de dióxido de carbono transfiriendo los cuadrados de papel de filtro a cuatro mililitros de líquido de centelleo en viales de centelleo y mida la señal de C 14 en un contador de centelleo para cuantificar el material soluble en ácido. Transfiera 400 microlitros del medio a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, centrifugue a velocidad máxima durante 10 minutos y luego agregue 100 microlitros del sobrenadante resultante a 500 microlitros de una mezcla dos a uno de cloroformo y metanol.

Vortex la mezcla brevemente y luego agregue 250 microlitros de agua a la mezcla y vortex nuevamente. Centrifugue las muestras durante 10 minutos a mil G. A continuación, transfiera 200 microlitros de la fase superior a cuatro mililitros de líquido de centelleo en un vial de centelleo y mida la señal de C 14 tras el ayuno de suero en las células. Cambie las células a medio de lipogénesis.

Agregue cualquier compuesto de interés que se vaya a probar y luego incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos horas después del período de incubación. Lave las células dos veces con PBS antes de lisarlas agregando 120 microlitros de ácido clorhídrico 0,1 N. En cada pozo, raspe los pozos para liberar el lisado y luego pipete 100 microlitros del lisado en un tubo microfuga de 1,5 mililitros.

A continuación, agregue 500 microlitros de una mezcla dos a uno de cloroformo y metanol a cada tubo. Agite brevemente mediante vortex y luego incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Tras la incubación, agregue 250 microlitros de agua, agite mediante vortex y luego incube la muestra durante cinco minutos adicionales a temperatura ambiente.

Luego, centrifugue las muestras durante 10 minutos a 3000 G. Transfiera cuidadosamente la fase inferior del líquido separado a cuatro mililitros de líquido de centelleo en un vial de centelleo y mida la actividad de tritio utilizando un contador de centelleo. Este procedimiento generalmente permite el aislamiento de entre 10 y 30 millones de hepatocitos por ratón. Tras una incubación nocturna, las células sanas presentan forma hexagonal, y muchas de ellas estarán nucleadas.

Los cultivos no saludables suelen contener gránulos o blebs, que son indicativos de muerte celular. Aquí se muestran los resultados de un ensayo de oxidación de ácidos grasos, en el que se comparó la adición del promotor de la respiración celular F-C-C-P-A y del oligomicina, un inhibidor de la respiración, con un control de vehículo para medir la oxidación completa. Se calcula la relación entre dióxido de carbono y material soluble en ácido.

Las sustancias que promueven la respiración celular, como FCCP, desplazarán esta proporción hacia el dióxido de carbono, indicando una mayor oxidación a través del ciclo TC.A. Los inhibidores de la cadena respiratoria disminuirán en conjunto la oxidación cuando se midan. Para compuestos con actividad lipídica, que aumentan la oxidación de ácidos grasos como FCCP o reducen la síntesis de ATP, como la oligomicina, se reducirá la actividad lipídica en hepatocitos cultivados en comparación con los controles vehiculares. Al realizar este procedimiento, es importante asegurar que la perfusión ocurra por completo y de manera oportuna tras el sacrificio del animal.

Además, durante el ensayo de oxidación de ácidos grasos, la congelación completa del medio es fundamental para obtener mediciones reproducibles de dióxido de carbono gaseoso. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar hepatocitos primarios, así como de cómo utilizar estas células para analizar la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis in vitro.