Name: Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Aprende a cuantificar la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en hepatocitos primarios de ratón mediante análisis de centelleo líquido. Este método permite evaluar intervenciones farmacológicas y genéticas en el metabolismo hepático.

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Nos gustaría agradecer a Susan Gray y Umadevi Chalasani por su ayuda con los aspectos técnicos del protocolo de aislamiento de hepatocitos. Este trabajo fue apoyado por la subvención 5R01DK089185 del NIDDK (a M.P. Cooper) y el Programa Piloto y de Factibilidad de DERC en UMMS (a M.P. Cooper).

Toda la experimentación con animales debe llevarse a cabo de acuerdo con las regulaciones locales y federales y con la aprobación de una administración institucional IACUC y seguridad radiológica. 1. Preparación <ol><li> Varios días antes del ensayo, descongelar la botella 500 ml de hígado Recopilación Medio (LDM) y vuelva a congelar ~ 35 ml alícuotas en tubos de 50 ml cónicos. Almacenar a -20 ° C hasta que se necesite. </li><li> Un día antes del ensayo, pre-esterilizar herramientas de disección limpia por autoclave. </li><li> En el día del ensayo, el tratamiento de la cantidad necesaria de placas de cultivo de 24 pocillos con colágeno. <ol><li> Mezclar 1 parte de 3 mg / ml de colágeno de cola de rata con 50 partes de PBS. Añadir aproximadamente 500 l a cada pocillo de una placa de 24 pocillos y se incuba durante 3-5 min a temperatura ambiente (RT). Retire el colágeno y permitir que la platina se seque al aire en el capó. Repetir al menos una vez adicional. Nota: recubrimiento de colágeno se puede realizar hasta una semana en anuncioVance y placas almacenadas a 4 ° C sellado en una envoltura de plástico. </li></ol></li><li> Preparar LDM para el ensayo: LDM Descongelar y calentar a 37 ° C y ajustar el pH a 7,4 utilizando 1 N de KOH. Filtrar utilizando filtro de jeringa de 0,2 micras y el lugar en una recirculación de 42 ° C baño de agua. </li><li> Caliente 25 ml de hígado de perfusión del medio a 42 ° C en baño de agua de recirculación. </li><li> Preparar 90% de sílice coloidal recubierto con una solución de polivinilpirrolidona: Añadir 1 ml de 10x DPBS a 9 ml de sílice coloidal recubierto con polivinilpirrolidona. Ajustar el pH a 7,4 usando HCl 0,1 N. Filtro con un filtro de jeringa de 0,2 micras estéril. Guarde a temperatura ambiente. </li><li> Cálido Medio Chapado a 37 ° C. </li></ol> 2. El aislamiento de hepatocitos primarios de ratón <ol><li> Configurar bomba peristáltica, tubos, y mesa de disección: Esterilizar tubo por el lavado con etanol 5 ml 70% en agua destilada, seguido de 10 ml de agua estéril. Coloque la tubería en el hígado de perfusión del medio y de la bomba funcionar para llenartoda la longitud del tubo. </li><li> Sacrificio del ratón por el método institucionalmente aprobado. </li><li> Diseccionar abierta la cavidad abdominal: Rocíe el abdomen del ratón liberalmente con etanol al 70%. Con unas tijeras sin filo, hacer una incisión en la línea media a través de la dermis de la longitud del abdomen y reflejar lateralmente. Haga una incisión similar en el peritoneo para exponer las vísceras. <ol><li> El uso de un instrumento romo, desplazar suavemente los intestinos para exponer la vasculatura abdominal Localizar la vena cava inferior abdominal (IVC) y colocar una sutura por debajo de la de los vasos sanguíneos, distal a la vena renal </li></ol></li><li> Distal a la sutura, colocar una aguja y catéter en la vena cava inferior, avanzando más allá del nivel de la sutura. Con la aguja todavía en su lugar, ate la sutura alrededor del catéter para mantenerlo en su lugar. Retire con cuidado la aguja. Si se hace correctamente, la sangre con el flujo a través del catéter. </li><li> Usando una pipeta, llenar el área restante en el catéter con medio de perfusión, asegurandoque el aire no está presente. Con mucho cuidado, coloque el tubo al catéter. </li><li> Diseccionar abierta la cavidad pulmonar: reflejar suavemente los lóbulos hepáticos superiores para exponer el diafragma. Perfore cuidadosamente el diafragma con tijeras afiladas de punta, a continuación, hacer una incisión lateral para exponer la cavidad pleural, teniendo cuidado de evitar la vesícula biliar y la vasculatura pleural. Coloque una pinza bulldog alrededor de la vena cava inferior torácica proximal a la vena hepática. </li><li> Cortar la vena porta y encienda la bomba a los 3 - 4 ml / min. Perfundir el hígado con hígado de perfusión del medio durante 5 minutos utilizando aproximadamente 20 ml de medio de perfusión. Nota: El hígado debe cambiar inmediatamente de rojo a gris / marrón. Si las porciones del hígado siguen siendo rojo, esto probablemente indica mala perfusión, y la probabilidad de éxito en el aislamiento está muy disminuido. Durante la perfusión, tenga cuidado para asegurar el medio no se ejecuta y que no queden burbujas entran en el tubo. </li><li> Después de la incubación de 5 min, se detienela bomba y la transferencia de la tubería al hígado Digesto Medio. Reinicie la bomba y la perfusión del hígado durante otros 10 - 15 min (hasta que el medio se ha agotado). </li><li> Al final de la perfusión, parar la bomba. El hígado debe tener un tono rosado y parecen algo ampliada. Extirpar el hígado por disección cuidadosa. Eliminar la vesícula biliar y el hígado para transferir 10 cm placa de cultivo tisular. </li><li> En un gabinete de bioseguridad, añadir 10 ml de Revestimiento del Medio (Tabla 1) para el hígado. Raspar suavemente el hígado utilizando fórceps o un bisturí para eliminar los hepatocitos. Filtrar la suspensión utilizando un filtro de células de 100 micras y la transferencia a un tubo cónico de 50 ml. Lavar la placa con un adicional de 10 ml de Revestimiento del Medio y piscina en el tubo cónico de 50 ml. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación durante 5 min a 350 xg, 4 ° C. </li><li> Medio Aspirar y pellet se resuspende en 10 ml de Revestimiento del medio y agregar 10 ml de 90% de sílice coloidal recubiertas con polyvinylpyrrolidone. Mezclar suavemente y centrifugar como en el paso 2.11. Después de la centrifugación, una capa de células muertas estará flotando en la parte superior de la mezcla, mientras que las células vivas se sedimenten en el fondo. </li><li> Aspirar las células muertas y medio. Lavar 2 veces con 20 ml de Revestimiento del Medio, centrífuga como en 2.11. </li><li> Resuspender las células en 10 ml de Revestimiento del Medio. Contar las células con un hemocitómetro y coloque 9 x 10 4 células / pocillo en 24 y placas de cultivo de colágeno tratados. Incubar en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos durante 2 h. Cada placa se puede utilizar ya sea para el ensayo de oxidación de ácidos grasos o en el ensayo lipogénesis. </li><li> Opcionalmente, cambie pozos para Mantenimiento Medio (Tabla 1) y la cultura a 37 ° C. Las células pueden ser cultivadas durante 2 - 3 días sin afectar a los resultados del ensayo. </li></ol> 3. Ensayo de oxidación de ácidos grasos Advertencia: El uso de la radiactividad puede ser peligroso. Todas las compras, el almacenamiento, la manipulación, y dishecho de material radiactivo debe llevarse a cabo de acuerdo con, estatales y las regulaciones y directrices federales institucionales. <ol><li> 16 a 20 hr antes del ensayo, lavar las células 2 veces con PBS caliente. Cambiar las células a suero libre de suero inanición Medio (Tabla 1) con 20 nM de glucagón e incubar durante la noche a 37 ° C. Nota: Debido a que el suero fetal bovino contiene una concentración desconocida de hormonas metabólicas (por ejemplo, insulina, glucagón), suero de hambre las células para eliminar cualquier efecto de confusión que esto puede tener en el ensayo. Las células son viables en suero inanición Medio durante&gt; 24 h. Tratamiento con glucagón se utiliza para estimular la oxidación de ácidos grasos dentro de los hepatocitos. </li><li> En la mañana del ensayo, preparar la pre-incubación Medio: Resuspender una cantidad apropiada de palmitato de sodio en agua ultrapura para preparar una solución 100 mM y se calienta a 70 ° C durante 10 min. Mientras tanto, preparar la cantidad requerida (0,5 ml por pocillo de una placa de 24 pocillos)de DMEM con 25 mM HEPES, 1% BSA Fracción V, y 20 nM de glucagón. Calentar a 37 ° C. <ol><li> Una vez solubilizado, palmitato de añadir a una concentración final de 250 mM al medio. Cambie los hepatocitos de pre-incubación medio y se incuba a 37 ° C durante 2 horas. Reserve algún Pre-Incubación Medio a 37 ° C para su uso posterior. </li></ol></li><li> Durante la incubación, se seca una cantidad apropiada de 14 C-palmitato (0,5 Ci / pocillo) por evaporación bajo gas nitrógeno. <ol><li> Por ejemplo, para medir 24 muestras en una placa de 24 pocillos, transferir 120 l de 0,1 Ci / ml 14 C-palmitato a un tubo de 1,5 ml. Poco a poco se evapora el disolvente etanol soplando gas nitrógeno sobre la solución desde una distancia de 3-5 cm en una campana de humos. El disolvente debe evaporarse en aproximadamente 30 - 40 min, dejando seco 14 C-palmitato en la parte inferior del tubo. </li></ol></li><li> Aproximadamente 15 minutos antes del final de la incubación, resuspender el 14C-Palmitato en NaOH 0,1 N (12,5 l / Ci). Incubar a 70 ° C durante 10 min. Añadir tres volúmenes de tibia Pre-Incubación Medio y mezclar pipeteando arriba y abajo. </li><li> Pico cada pocillo con 25 l de diluirse 14 C-palmitato. Mezclar agitando suavemente la placa e incubar a 37 ° C durante 90 minutos. Esta es la placa de ensayo. </li><li> Durante la incubación, preparar la placa de papel de filtro (Figura 1). <ol><li> Retire la tapa de una placa de 24 pocillos estéril. Coloque un 2 cm x 2 cm trozo de papel de filtro en la parte inferior de cada uno de los pozos. Superposición de la placa con una pieza de 4 &quot;x 7&quot; parafina. </li><li> El uso de un objeto rectangular grande, tal como una caja punta de micropipeta, frotar la parafina en los pozos para perforar la parafina en las aberturas y así crear un sello sobre el resto de la placa. Retire los círculos perforados de parafina ahora cubren los pozos. La placa debe ahora estar bien cubierto con parafilm en todas las áreas, excepto el o bienpenings. </li></ol></li><li> 10 min antes del final de la incubación, añadir 200 l de NaOH 3 N a cada pocillo de la placa de papel de filtro, asegurándose de que el papel de filtro absorbe todo el líquido. <ol><li> Opcionalmente antes de la congelación, transferir el medio de una placa de 24 pocillos fresco. Después de lavar una vez con PBS, lisar las células restantes en HCl 0,1 N y calcular el contenido de proteína mediante ensayo BCA. </li></ol></li><li> Al final de la incubación, complemento congelar la placa de ensayo en nitrógeno líquido. Tenga cuidado para asegurar así cada uno está completamente congelado antes de proceder. </li><li> Añadir 100 l de 70% ácido perclórico a cada pocillo de la placa de ensayo. Inmediatamente cubrir con el plato de papel de filtro. Coloque las placas en un agitador orbital y el rock a la velocidad orbital de 80 rpm a temperatura ambiente durante 2 horas. </li><li> Después de la incubación, procesar las muestras: <ol><li> Para medir la fracción de CO 2, la transferencia de los cuadrados de papel de filtro a 4 ml de fluido de centelleo líquido en un centelleovial y la medida 14 de la señal C. </li><li> Para medir el material soluble ácido, transferir 400 l de medio a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a máxima velocidad durante 10 min. Añadir 100 l del sobrenadante resultante a 500 l de 2: 1 cloroformo-metanol (v / v), y agitar brevemente. <ol><li> Añadir 250 l de agua a la mezcla, y agitar de nuevo. Centrifugar las muestras durante 10 min a 3000 x g. Transferencia de 200 l de la fase superior a 4 ml de fluido de centelleo líquido en un vial de centelleo y medir 14 la señal C. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. lipogénesis Ensayo <ol><li> La noche antes de comenzar el ensayo, se lavan las células 2 veces con PBS caliente. Cambie los hepatocitos a suero inanición Medio con 100 nM de insulina. Incubar durante la noche a 37 ° C. Nota: Debido a que el suero fetal bovino contiene una concentración desconocida de hormonas metabólicas (por ejemplo, insulina, glucagón), Suero de comer a las células para eliminar cualquier efecto de confusión que esto puede tener en el ensayo. Las células son viables en suero inanición Medio durante&gt; 24 h. La insulina se usa en este ensayo para estimular la lipogénesis. </li><li> Hacer lipogénesis Medio: Suero inanición medio con 100 nM de insulina, 10 mM de acetato de frío y 0,5 Ci 3 H-Acetato por pocillo. Cambie células a lipogénesis Medium y se incuba a 37 ° C durante 2 hr. Incluir todos los compuestos de interés para ser probados. </li><li> Después de que el período de incubación, lavar las células 2 veces con PBS. Células Lyse por raspado en 120 l de HCl 0,1 N. Reserva 10 l para el ensayo de proteínas (evaluar por ensayo BCA), y la transferencia de 100 l a tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Lípidos extracto por adición de 500 l de 2: 1 cloroformo-metanol (v / v). Vortex brevemente e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 250 l de agua, vortex e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar las muestras 10 min a 3.000 xg, RT. Cuidadosamentetransferencia de fase inferior a 4 ml de fluido de centelleo líquido en un vial de centelleo y medir la actividad 3 H. </li></ol>

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<li>Lazo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+nonalcoholic+Fatty+liver+disease+in+the+United+States%3A+the+third+national+health+and+nutrition+examination+survey%2C+1988-1994%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+epidemiology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994.</a> American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).</li>
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<li>Feldstein, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+apoptosis+and+fas+expression+are+prominent+features+of+human+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).</li>
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<li>Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+de+novo+lipogenesis+is+a+distinct+characteristic+of+individuals+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease.</a> Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).</li>
<li>Parks, E. J., Hellerstein, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+patient-oriented+research.+Recent+advances+in+liver+triacylglycerol+and+fatty+acid+metabolism+using+stable+isotope+labeling+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques.</a> Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).</li>
<li>Befroy, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+assessment+of+hepatic+mitochondrial+oxidative+and+anaplerotic+fluxes+in+humans+using+dynamic+13C+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy.</a> Nature medicine. 20, 98-102 (2014).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+journal%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malaria journal. 6, 169(2007).</li>
</ol>

Los autores indican que no tienen conflictos de intereses.

El tiempo desde el sacrificio a la perfusión debe ser inferior a 3 min para la perfusión ideal y digestión con colagenasa del hígado. Una vez que se inicia la perfusión con perfusión del medio, el hígado debe cambiar inmediatamente la apariencia de de rojo a pálido. Después de aproximadamente 10 minutos de incubación con LDM, el hígado aparecerá hinchada y de color rosa. En el caso de que la perfusión es insuficiente, el hígado no puede exhibir estos cambios, y esto normalmente dará como resultado un rendimiento de hepa...

La enfermedad del hígado graso no alcohólico es una de las principales causas de enfermedad hepática en las culturas occidentalizadas1,2. La acumulación de lípidos en el hígado se asocia con muerte celular, fibrosis e insuficiencia hepática a través de mecanismos aún desconocidos3-6. En la enfermedad del hígado graso, la oxidación de ácidos grasos β mediada por hepatocitos y la lipogénesis de novo son determinantes importantes de la acumulación neta de lípidos7,8. Por lo tanto, este artículo se centrará en el aislamiento de hepatocitos, seguido de la cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β y la lipogénesis de novo.
Se han desarrollado numerosas metodologías para interrogar el metabolismo de los lípidos de los hepatocitos. Aunque es posible medir el metabolismo de la grasa in vivo utilizando isótopos estables9,10, estos métodos son costosos y requieren un gran número de animales. Además, la capacidad de investigar el efecto de los productos químicos exógenos es limitada debido a la naturaleza de la experimentación in vivo. Por el contrario, el aislamiento de hepatocitos primarios a partir del hígado de ratón proporciona una vía asequible para perseguir11. Además, el estudio de los hepatocitos en cultivo permite a los investigadores estudiar los efectos de diversos productos químicos en el procesamiento de lípidos, al tiempo que sortean las dificultades de la experimentación in vivo. Por último, los hepatocitos aislados evitan cualquier confusión debido a la variación genética, ya que se derivan del hígado de un solo animal.
Aquí aislamos y cultivamos hepatocitos, y medimos la oxidación de ácidos grasos β y la lipogénesis de novo, utilizando palmitato radiomarcado. El protocolo que se detalla a continuación es sencillo, eficaz y reproducible.

<table><tbody><tr><td>Tecnologías de vida media de perfusión hepática</td><td>17701038</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías de vida</td><td>media de digestión hepática</td><td>17703034</td><td>alícuota y almacenamiento a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10X DPBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140079&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías de Vida de Colágeno</td><td></td><td>A1048301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sílice coloidal recubierta con polivinilpirrolidona</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina (BSA), Fracción V</td><td>MP Biomedicals</td><td>103703</td><td></td></tr><tr><td>plato de cultivo de 24 pocillos</td><td>Corning Falcon</td><td>353047&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Tygon S3&nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06460-34</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueo de Leur Macho a 200 Conectores</td><td>Cole Parmer</td><td>45518-00</td><td></td></tr><tr><td>Catéter de 24 G x 3/4"</td><td>SurFlo</td><td>SROX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda de mano permanente</td><td>Ethicon</td><td>683G</td><td></td></tr> Colador de <tr><td>células</td><td>Corning Falcon</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 3013HD Baño de agua recirculante</td><td>Fisher</td><td>13-874-3</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex C/L Bomba Peristáltica MasterFlex</td><td></td><td>HV-77122-24</td><td></td></tr><tr><td>Microclamp</td><td>Roboz</td><td>RS-7438</td><td>Preesterilizar en autoclave</td></tr><tr><td>5" Tijeras de operación rectas, romas-romas</td><td>Roboz</td><td>RS-6810</td><td>Preesterilizar en autoclave</td></tr><tr><td>24 mm Hoja recta de 24 mm Tijeras de microdisección de punta afilada</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Preesterilizar en autoclave</td></tr> 4<tr><td>" 0.8 mm Punta Pinza de microdisección</td><td>Roboz</td><td>RS-5130</td><td>Preesterilizar en autoclave</td></tr> 4<tr><td>" 0.8 mm Punta de curva completa Pinzas de microdisección</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td>Preesterilizar en autoclave</td></tr><tr><td>Jeringa de 60 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 50 ml</td><td>Corning Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>BCA Ensayo de proteínas</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Cabina</td><td></td><td></td><td></td>de bioseguridad</tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serológico pipetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000, 200, 20 &mu; l pipeta y puntas</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

El metabolismo de los lípidos en el hígado es complejo. Además de importar y exportar lípidos a través de lipoproteínas, los hepatocitos pueden oxidar lípidos a través de la oxidación de ácidos grasos o, alternativamente, sintetizar nuevos lípidos a través de lipogénesis de novo. La suma neta de estas vías está dictada por una serie de factores, que en ciertos estados de enfermedad conducen a la enfermedad del hígado graso. La acumulación excesiva de lípidos hepáticos se asocia con la resistencia a la insulina en todo el cuerpo y la enfermedad coronaria. Las herramientas para estudiar el metabolismo lipídico en hepatocitos son útiles para comprender el papel del metabolismo lipídico hepático en ciertos trastornos metabólicos.
En el hígado, los hepatocitos regulan la descomposición y síntesis de ácidos grasos a través de la oxidación β-grasa y la lipogénesis de novo, respectivamente. La cuantificación del metabolismo en estas vías proporciona información sobre el manejo de los lípidos hepáticos. A diferencia de la cuantificación in vitro, en la que se utilizan hepatocitos primarios, la realización de mediciones in vivo es un reto técnico y requiere muchos recursos. Por lo tanto, la cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β y la lipogénesis de novo en hepatocitos de ratón cultivados proporciona un método sencillo para evaluar el manejo de lípidos de los hepatocitos. 
Aquí describimos un método para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón, y demostramos la cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β y la lipogénesis de novo, utilizando sustratos radiomarcados.

Aislamientos de hepatocitos suelen dar en 1 - 3 x 10 7 células totales. Después de la incubación durante la noche, las células van a aparecer hexagonal, muchos de los cuales se binucleadas (Figura 2). Las células sanas deben estar desprovisto de granulaciones o vesículas, que son indicativos de la muerte celular. En general, el ensayo de oxidación de ácidos grasos se ejecuta en tres o cuatro repeticiones por compuesto de ensayo. Condes de las CO 2 muestras</s...

De la lipogénesis de novo y la oxidación de ácidos grasos β-constituyen vías metabólicas claves en los hepatocitos, las vías que son perturbados en varios trastornos metabólicos, incluyendo la enfermedad de hígado graso. Aquí se demuestra el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón y describimos cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β-y la lipogénesis.

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el metabolismo de ácidos grasos en hepatocitos primarios de ratón. Esto se logra primero perfundiendo el hígado de un ratón con un medio de digestión, extrayéndolo y luego aislándolos hepatocitos. El segundo paso consiste en cultivar los hepatocitos en placas recubiertas con colágeno.A continuación, los hepatocitos se tratan con las intervenciones experimentales que se desean probar. El paso final consiste en incubar las células en presencia de un sustrato marcado con radioisótopos. Finalmente, mediante análisis de centelleo líquido se muestran los efectos de diversas intervenciones farmacológicas o genéticas sobre la oxidación de ácidos grasos o la lipogénesis en hepatocitos primarios.Este método puede ayudar a responder varias preguntas clave en el campo del metabolismo y la diabetes, incluyendo cómo intervenciones farmacológicas y genéticas específicas afectan la biología de los hepatocitos. La demostración visual de este método es fundamental por dos razones. Primero, es difícil obtener condiciones específicas de perfusión que afecten la salud de los hepatocitos, y segundo, la cuantificación del dióxido de carbono liberado.El gas no es intuitivo. Esta prueba será demostrada por Tom Akey, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Configure la bomba peristáltica colocando un extremo de un tubo estéril en el medio de perfusión hepática precalentado y el otro extremo en un recipiente de desecho.Encienda la bomba hasta que toda la longitud del tubo esté llena de medio. Tras sacrificar un ratón de interés, rocíe abundantemente el abdomen del ratón con etanol al 70 %. Luego, use tijeras de punta roma para hacer una incisión media a través de la dermis, a lo largo del abdomen, y refleje lateralmente.Realice una incisión similar en el peritoneo para exponer las vísceras. Utilizando un instrumento romo, desplace suavemente los intestinos. Para exponer la vasculatura abdominal, localice la vena cava inferior abdominal y coloque una sutura debajo del vaso sanguíneo distal a la vena renal, distal a la sutura.Coloque una aguja y un catéter en la vena cava inferior e introdúzcalos más allá del punto de sutura. Con la aguja aún en su lugar, ate el hilo alrededor del catéter para mantenerlo fijo y luego retire cuidadosamente la aguja. Si se realiza correctamente, la sangre fluirá a través del catéter utilizando una pipeta.Llene el área restante del catéter con medio de perfusión y asegúrese de que no haya aire presente. Luego, con mucho cuidado, conecte el tubo al catéter. A continuación, punce cuidadosamente el diafragma con tijeras de punta afilada y realice una incisión lateral para exponer la cavidad pleural.Teniendo cuidado de evitar la vesícula biliar y la vasculatura pleural, coloque una pinza bulldog alrededor de la vena cava inferior torácica justo proximal a la vena hepática. Luego corte la vena porta y encienda la bomba a tres o cuatro mililitros por minuto. Perfunda el hígado con medio de perfusión para hígado durante cinco minutos, utilizando aproximadamente 20 mililitros de medio de perfusión.Durante este tiempo, observe el cambio inmediato de color del hígado de rojo a un color grisáceo o marrón claro. Si algunas porciones del hígado permanecen rojas, es probable que esto indique una perfusión deficiente y que la probabilidad de un aislamiento exitoso se reduzca considerablemente. Tras la perfusión de cinco minutos, detenga la bomba y transfiera el tubo al medio de digestión hepática.Reinicie la bomba y perfunda el hígado durante otros 10 a 15 minutos a una velocidad de tres a cuatro mililitros por minuto hasta que se agote el medio. Al final de la perfusión, detenga la bomba.El hígado debe tener un tono rosado y aparecer algo agrandado. En este punto, extirpe el hígado mediante una disección cuidadosa. Transfiera a una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros y retire la vesícula biliar.A continuación, agregue 10 mililitros de medio de siembra al hígado y comience a raspar suavemente el hígado utilizando un escalpelo. Para eliminar los hepatocitos, filtre la suspensión mediante un tamiz celular de 100 micrones y transfiérala a un tubo cónico de 50 mililitros. Lave la placa con 10 mililitros adicionales de medio de siembra y aspire el líquido hacia el tubo cónico de 50 mililitros.Luego, pelletice las células a cuatro grados Celsius, centrifugando durante cinco minutos a 350 G, aspire el medio y resuspenda el pellet celular en 10 mililitros de medio de siembra. A continuación, agregue 10 mililitros de sílice coloidal al 90 % recubierta con polivinil perona mezclando suavemente, y luego pelletice las células como antes. Tras la centrifugación, aspire la capa de células muertas que flota en la parte superior de la mezcla.Luego, lave las células vivas en el sedimento dos veces con 20 mililitros de medio de siembra. Suspender el sedimento final de células en 10 mililitros de medio de siembra y contar las células utilizando un hemocitómetro. Coloque 90.000 células por pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos recubiertas con colágeno. Incube las placas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos horas, entre 16 y 20 horas antes de comenzar el ensayo.Lave las células dos veces con PBS tibio y cambie las células a un medio libre de suero para la privación de suero, con 20 nanomoles de glucagón. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, por la mañana del ensayo.Prepare el medio de preincubación y luego sustituya el medio con privación de suero. Medio para la preincubación. Incube las células en esta mezcla a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos horas durante la incubación.Seque 0,5 microcurios por pocillo de palmitato C14 evaporando el disolvente de etanol bajo nitrógeno aproximadamente 15 minutos antes del final de la incubación; reconstituya el palmitato C14 a 12,5 microlitros por microcurio en hidróxido de sodio 0,1 N. Incube la mezcla a 70 grados Celsius durante 10 minutos. Luego agregue tres volúmenes de medio de preincubación tibio y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.Añada 25 microlitros de la mezcla de palmitato C 14 diluido a cada pocillo agitando suavemente la placa e incube a 37 grados Celsius durante 90 minutos. Esta es la placa de ensayo. Durante la incubación, retire la tapa de una placa estéril de 24 pocillos y coloque un trozo de papel filtro de dos centímetros por dos centímetros en el fondo de cada uno de los pocillos. Luego, coloque encima de la placa un trozo de param de cuatro pulgadas por siete pulgadas utilizando un objeto rectangular grande, como una caja de puntas para micropipeta.Frote el paraformo sobre los pocillos para perforar el paraformo en las aberturas de los pocillos y crear un sello sobre el resto de la placa. Luego retire los círculos perforados de paraformo. Cubriendo ahora los pocillos 10 minutos antes del final de la incubación, agregue 200 microlitros de hidróxido de sodio normal tres veces a cada pocillo de la placa de papel filtro, asegurándose de que el papel filtro absorba todo el líquido.Al finalizar la incubación, congele rápidamente la placa de ensayo en nitrógeno líquido. A continuación, agregue 100 microlitros de ácido perclórico al 70 % a cada pocillo de la placa de ensayo. Inmediatamente cúbrala con una placa de papel filtro y coloque las placas en un agitador orbital.Agite las placas a una velocidad orbital de 80 RPM a temperatura ambiente durante dos horas. Luego, mida la fracción de dióxido de carbono transfiriendo los cuadrados de papel de filtro a cuatro mililitros de líquido de centelleo en viales de centelleo y mida la señal de C 14 en un contador de centelleo para cuantificar el material soluble en ácido. Transfiera 400 microlitros del medio a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, centrifugue a velocidad máxima durante 10 minutos y luego agregue 100 microlitros del sobrenadante resultante a 500 microlitros de una mezcla dos a uno de cloroformo y metanol.Vortex la mezcla brevemente y luego agregue 250 microlitros de agua a la mezcla y vortex nuevamente. Centrifugue las muestras durante 10 minutos a mil G. A continuación, transfiera 200 microlitros de la fase superior a cuatro mililitros de líquido de centelleo en un vial de centelleo y mida la señal de C 14 tras el ayuno de suero en las células. Cambie las células a medio de lipogénesis.Agregue cualquier compuesto de interés que se vaya a probar y luego incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos horas después del período de incubación. Lave las células dos veces con PBS antes de lisarlas agregando 120 microlitros de ácido clorhídrico 0,1 N. En cada pozo, raspe los pozos para liberar el lisado y luego pipete 100 microlitros del lisado en un tubo microfuga de 1,5 mililitros.A continuación, agregue 500 microlitros de una mezcla dos a uno de cloroformo y metanol a cada tubo. Agite brevemente mediante vortex y luego incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Tras la incubación, agregue 250 microlitros de agua, agite mediante vortex y luego incube la muestra durante cinco minutos adicionales a temperatura ambiente.Luego, centrifugue las muestras durante 10 minutos a 3000 G. Transfiera cuidadosamente la fase inferior del líquido separado a cuatro mililitros de líquido de centelleo en un vial de centelleo y mida la actividad de tritio utilizando un contador de centelleo. Este procedimiento generalmente permite el aislamiento de entre 10 y 30 millones de hepatocitos por ratón. Tras una incubación nocturna, las células sanas presentan forma hexagonal, y muchas de ellas estarán nucleadas.Los cultivos no saludables suelen contener gránulos o blebs, que son indicativos de muerte celular. Aquí se muestran los resultados de un ensayo de oxidación de ácidos grasos, en el que se comparó la adición del promotor de la respiración celular F-C-C-P-A y del oligomicina, un inhibidor de la respiración, con un control de vehículo para medir la oxidación completa. Se calcula la relación entre dióxido de carbono y material soluble en ácido.Las sustancias que promueven la respiración celular, como FCCP, desplazarán esta proporción hacia el dióxido de carbono, indicando una mayor oxidación a través del ciclo TC.A. Los inhibidores de la cadena respiratoria disminuirán en conjunto la oxidación cuando se midan. Para compuestos con actividad lipídica, que aumentan la oxidación de ácidos grasos como FCCP o reducen la síntesis de ATP, como la oligomicina, se reducirá la actividad lipídica en hepatocitos cultivados en comparación con los controles vehiculares. Al realizar este procedimiento, es importante asegurar que la perfusión ocurra por completo y de manera oportuna tras el sacrificio del animal.Además, durante el ensayo de oxidación de ácidos grasos, la congelación completa del medio es fundamental para obtener mediciones reproducibles de dióxido de carbono gaseoso. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar hepatocitos primarios, así como de cómo utilizar estas células para analizar la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis in vitro.

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