Name: TRAP-rc, Traducción ribosoma Affinity Purificación de poblaciones de células raras de Drosophila Los embriones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprenda el protocolo TRAP para aislar ARNm de poblaciones celulares raras en embriones de Drosophila. Este método permite capturar traducción específica de tipo celular sin disociación, facilitando el estudio de mecanismos de desarrollo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen a Nicolas Allegre, Maud Peyny y Jean-Philippe Da Ponte por su excelente asistencia técnica. Este trabajo ha contado con el apoyo de la Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), la beca inicial del INSERM, la beca ANR ID-CELL-SPE, Equipe FRM y la beca AFM 15845.

1. Fly Line Generación <ol><li> Generar dos construcciones diferentes. En la primera construcción, ADNc RpL10A (proteína ribosomal subunidad L10A) se clona aguas abajo de las buenas prácticas agrarias en el plásmido UPAEP-PL-GFP-Nter (versión modificada de 32). El uso de un promotor de la línea germinal permite un uso más polivalente de la línea transgénica. NOTA: Obtener el segundo constructo clonando la secuencia reguladora que dirige la expresión específica de tejido del gen se queda atrás aguas arriba de GAL4 (TF) utilizando el plásmido pPTGAL4. </li><li> Inyectar plásmidos por separado en w 1118 moscas e insertar los constructos en el genoma de la mosca de la inserción del elemento P (de acuerdo con el procedimiento estándar) 33. </li><li> Seleccione transformantes para recuperar líneas de vuelo con construcciones en dos cromosomas diferentes. La línea de TRAP final se crea mediante la combinación de estas dos líneas (cruces genéticos) con el fin de obtener una línea estable de doble transgénico. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / SCU; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massively amplificar esta línea y recoger los embriones protagonizadas deseado. </li></ol> 2. Embryo Collection <ol><li> Preparar 8 grandes jaulas de población cilíndricos que contienen alrededor de 40 g de moscas jóvenes por jaula (alrededor de 180,000 moscas / jaula). </li><li> Proceda con los llamados pre-Lays que permiten a las moscas para borrar los embriones en desarrollo de sus oviductos. Para ello, sentar las moscas para 1 hr en dos platos Petri de 11 cm de diámetro que contienen una mezcla de agar y zumo de uva solidificada y cubrir ⅓ de la superficie con pasta de levadura recién hecho. Después de 3 intercambios de uva placas jugo recogen los embriones reales en platos recién hechos similares. NOTA: El tiempo de incubación variará de acuerdo con el desarrollo de ventana de tiempo estudiado. </li><li> Retire las placas de las jaulas y dejarlos a la misma temperatura durante el tiempo necesario para obtener el grado de desarrollo correcto (por ejemplo, 3 horas de la puesta de huevos + 10 h de Additincubación ional da embriones de etapa de 10 a 13 horas después de la puesta de huevos (AEL)). Resuspender el contenido de la placa (embriones, pasta de levadura, moscas muertas) con 50 ml de agua utilizando un cepillo. </li><li> Ir a través de una serie de tamices (700 m, 355 m, 112 m) para separar los embriones de moscas muertas y demás partes del cuerpo y recoger embriones retenidos en el tamiz de menor diámetro, y luego lavar brevemente en agua destilada. No utilice más de 18 planchas por la colección, ya que puede obstruir los tamices. </li><li> Embriones Dechorionate en 4,5% de lejía en agua desionizada durante 2 minutos y enjuagar bien con agua desionizada durante 30 a 60 segundos. Incubar los embriones en PBS 0,01% Tween 20, 100 mg / ml de cicloheximida, durante 5-10 min a RT bajo agitación. </li><li> Embriones secos en hojas absorbentes de celulosa y transferirlas a tubos de microcentrífuga. Pesar los tubos y el flash-congelar los embriones por inmersión en nitrógeno líquido. En esta etapa, los embriones secos se pueden almacenar durante varios meses a -80 ° C. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Preparación de perlas magnéticas acopladas a GFP de anticuerpos <ol><li> Completamente resuspender la proteína G cuentas magnéticas en la botella original de agitación suave. </li><li> Transferencia de 90 l de perlas a un tubo de RNasa libre y recogerlos en un imán (30-60 seg). 90 l de perlas es necesario llevar a cabo la inmunoprecipitación (IP) con 1 ml de lisado que contienen el 60-80 mg / ml proteínas. Respetar las proporciones para evitar la saturación del grano. Utilice varios tubos de acuerdo con la cantidad de proteínas. </li><li> Bolas de lavado con 1 × PBS 0,01% Tween 20 (500 l) y recolectar los granos en el imán para desechar el sobrenadante. Añadir 30 g de anticuerpo GFP en 350 l de PBS 0,01% Tween 20 a las perlas y se incuba con el extremo lento sobre el extremo de mezclar durante 30 min a TA. </li><li> Recoger los granos en el imán (30-60 seg), desechar el sobrenadante y enjuague en 500 l de tampón de extracción polisomas (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton 1%, cicloheximida 100 g / ml , Protease inhibidor 1 ×, inhibidor de RNasa 100 U). </li><li> Recoger los granos en el imán y añadir 500 l de tampón de bloqueo (BSA 0,1 mg / l, ARNt de levadura 0,1 g / l, glucógeno 0,1 g / l en tampón de extracción polisomas). </li><li> Incubar durante 30 min a TA y repetir este paso una vez con tampón de bloqueo fresco. </li><li> Recoger los granos en el imán y enjuague en 500 l de tampón de extracción polisomas, a continuación, recordar cuentas y proceder de inmediato a la etapa inmunopurificación (artículo 6). </li></ol> 4. Preparación de lisado <ol><li> Antes de iniciar, configurar el programa en el multi-direccional cuentas de velocidad rápida grinder: 2 × 10 segundos a 5000 rpm, 15 segundos de pausa. Transferencia de embriones secos (1,5 g) a tubos de 15 ml previamente enfriado en hielo que contiene tampón de extracción polisomas, y homogeneizar inmediatamente. Homogeneizar 1,5 g de embriones en 4 ml de tampón de extracción polisomas. </li><li> Spread homogeneizada embriones de cada dos preenfriados 2 tubos mL y muelen el embryos ejecutando el programa homogeneizador. Transferir el lisado a tubos de microcentrífuga frescos previamente enfriado en hielo y preparar un sobrenadante postnuclear por centrifugación a 4 ° C durante 10 min a 2000 g. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de preenfriado fresco en hielo, añadir un centésimo volumen de muestra de 10% Nonidet P-40 al sobrenadante (concentración final = 0,1%), y se mezcla suavemente invirtiendo el tubo. </li><li> Pulse-centrífuga la muestra en un Minifuge para recoger el líquido en la parte inferior del tubo, añadir un noveno volumen de muestra de 300 mM de 1,2-sn-Diheptanoyl-glicero-3-fosfocolina (DHPC) (concentración final = 30 mM ), mezclar suavemente invirtiendo el tubo, y se incuba la mezcla en hielo durante 5 min (mezcla invirtiendo varias veces durante la incubación). </li><li> Preparar el sobrenadante post-mitocondrial por centrifugación a 4 ° C durante 10 min a 20.000 g. Medir la concentración de proteína por el método de Bradford: concentración en lisado debe estar entre el 60-80 mg / ml. Take el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado fresco y proceder de inmediato a la etapa de pre-absorción (sección 5). </li></ol> 5. Pre-absorción <ol><li> Completamente resuspender las perlas magnéticas por agitación suave y la transferencia de 30 l de perlas en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente (30 l de perlas / 1 ml de lisado embrionaria). </li><li> Recoger los granos en el imán, pipeta el sobrenadante, y resuspender las perlas en tampón de extracción polisomas (500 l). Recoger los granos en el imán, añadir lisado embrionario, y se incuba durante 1 hora a 4 ° C en un rotador. <ol><li> Eliminar cuentas y mantener sobrenadante en hielo durante la etapa inmunopurificación. Antes inmunopurificación, mantenga 100 l de sobrenadante (de entrada) para comparar la muestra mundial de ARN con la muestra de ARN recogido después inmunopurificación, por RT-qPCR por ejemplo. </li></ol></li></ol> 6. La inmunopurificación <ol><li> Añadir 1 ml (correspondiente a un 60-80 mg / ml de proteína) delisado pre-absorbido a un tubo de RNasa libre que contiene 90 l de cuentas bloqueadas acoplados a anticuerpos GFP. Incubar las muestras a 4 ° C durante 2 horas con suave mezclado de extremo a extremo en un rotador tubo. Alternativamente, realice la incubación O / N a 4 ° C. </li><li> Después de la incubación, recoger los granos en el imán. Utilice un Minifuge a girar hacia abajo las perlas, a continuación, volver a suspender en 500 l de tampón de lavado (Hepes 10 mM, KCl 350 mm, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cicloheximida 100 mg / ml, RNasa inhibidor de 100 U ) y recogerlos en el imán. Repita este paso dos veces más. </li><li> Cambiar las perlas a un nuevo tubo RNasa libre de preenfriado y lavar dos veces. Recoge las cuentas de un imán y proceder a la extracción de ARN mediante la adición de 1 ml de Trizol directamente a las cuentas y seguir las instrucciones del fabricante. </li></ol> 7. ARN Limpieza y Evaluación de la Calidad <ol><li> Utilice un Kit RNeasy Micro según las instrucciones del fabricante. Al finalizar, elute ARN con (x) l de agua libre de RNasa. Caliente durante 2 minutos a 60 ° C, y la tienda de complemento congeladas muestras a -80 ° C. Compruebe la calidad del ARN utilizando bioanalizador (siga las instrucciones del fabricante). </li><li> Para probar la especificidad de la Traped ARN, lleve a cabo la transcripción inversa en 3 ng de ARN purificado (de entrada y de IP) según las instrucciones del fabricante (superíndice III). Utilice el ADNc obtenido para qPCR utilizando conjuntos de cebadores específicos del gen. </li></ol>

<ol><li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li>
<li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li>
<li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+view+of+cell+fate+specification%3A+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li>
<li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li>
<li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses%3A+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014(2010).</li>
<li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, & development. 21, 436-449 (2007).</li>
<li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li>
<li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REDfly+v3.0%3A+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li>
<li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li>
<li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li>
<li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li>
<li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605(2011).</li>
<li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965(2012).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li>
<li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+molecular+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82(2014).</li>
<li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li>
<li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419(2010).</li>
<li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276(2012).</li>
<li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li>
<li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li>
<li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li>
<li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li>
<li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos%3A+application+to+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li>
<li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li>
<li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gal4+in+the+Drosophila+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li>
<li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li>
<li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo se describe un protocolo de purificación Traducción ribosoma Affinity modificado (apodado &#39;TRAP-rc&#39;) dedicado al estudio de las poblaciones de células raras en embriones de Drosophila. Se proporciona información sobre los pasos clave para el aislamiento exitoso de ARN específico con un rendimiento adecuados para microarray o análisis de ARN-ss, es decir, 1) la cantidad de material biológico requerido y procedimiento optimizado para la lisis de embriones y la extracción de polisomas; 2) cuentas / anticuerpo-to-lisado ratios para inmunoprecipitación óptima; 3) los pasos que permite la reducción del fondo incluyendo la composición de tampón de lavado con el fin de ejecutar experimentos-TRAP rc con alta especificidad y sensibilidad. Este protocolo produce datos reproducibles por lo que es aplicarse fácilmente a otros tipos de células. Esta técnica hace que sea posible analizar la expresión génica diferencial en el nivel de mRNA activamente-traducción y por lo tanto preparar el camino para la comprensión de la expresión de proteínas en una especificación<html> tipo de célula ific a una ventana de tiempo específica. Tenga en cuenta sin embargo, que la abundancia de proteínas dependerá de la velocidad de los procesos de traducción y la degradación. Una limitación importante del método TRAP es su incapacidad para medir el contenido de proteína de una manera cuantitativa precisa o para detectar modificación post-traduccional. La mejora de la cuantificación mediante la medición de la densidad de los ribosomas a lo largo del cuerpo de ARNm y, al hacerlo, de una manera específica del tipo celular puede hacer trampa en combinación con ribosoma footprinting una herramienta muy poderosa. En un trabajo reciente 34, esta combinación se realizó en las células embrionarias humanas de riñón 293. Los autores corrieron footprinting nucleasa seguido de purificación por afinidad de una forma biotinilada inducible de RpL10A usando perlas de estreptavidina. Esta es una prueba de principio de que es posible llevar a cabo la huella de ribosomas en un organismo completo mientras que apunta un tipo celular específico, la limitación es la cantidad de material biológico necesario para el propósito. &quot;&gt; Realizando experimentos TRAP en paralelo con los análisis transcriptomic globales permitirá realizar un seguimiento de proporciones entre los recién transcrita y actively- traducir ARN. Este será profundamente informativa de los posibles mecanismos post-transcripcional que tienen lugar en contextos específicos del desarrollo o poblaciones de células específicas microRNAs -por por ejemplo. En conclusión, TRAP es un método altamente eficiente, específico y sensible para identificar RNAs activamente unidos a los ribosomas-traducción de una manera específica de la célula. Este método se puede utilizar en una amplia variedad de organismos y tipos de tejidos. El nuevo protocolo de TRAP-rc descrito aquí se ha optimizado para las poblaciones de células raras (menos de 1% del número total de células) y de una cantidad de material final suficiente para los análisis posteriores a nivel de todo el genoma. Una posible limitación de este método es la exigencia de un fuerte impulsor de producir ribosomas etiquetados en cantidad suficiente para compensarmeete con los no etiquetados endógenos en el tipo de célula diana. En un estudio reciente 25, los autores estiman en 10-30% la proporción de etiquetado frente a ribosomas sin etiquetar. Para superar este problema cada vez mayor número de copias-EGFP UAS-RpL10A debería mejorar considerablemente este equilibrio. Alternativamente, añadiendo a los antecedentes genéticos se describe un transgén UAS-GAL4 amplificará la producción de la proteína GAL4 e indirectamente aumentar la expresión de RpL10A-EGFP. Esto debería favorecer una mejor ocupación de los ribosomas etiquetados en ARNm. Tenga en cuenta que este enfoque ya eficiente se puede hacer aún más potente mediante la adaptación de los métodos complementarios para traer un aspecto más cuantitativa o para descubrir y desentrañar los mecanismos moleculares que son esenciales para el control de la expresión génica.

La comprensión de cómo las células adquieren propiedades específicas durante el desarrollo es crucial para poder apreciar la complejidad de los órganos y su posible evolución hacia condiciones patológicas. Hay un gran impulso de investigación para descifrar las redes reguladoras de genes que subyacen en la especificación y diferenciación celular por perfiles de expresión génica global unrevealing, el estado de unión Pol II, factor de transcripción de ocupación en secuencias reguladoras o modificaciones post-traduccionales de las histonas. Para evaluar la expresión de genes en una microarrays nivel mundial y se utilizan enfoques de ARN-ss. Microarrays permiten detectar la abundancia de ARNm, mientras que el ARN-ss es mejor orientado a informar sobre los diferentes tipos de ARN, incluyendo codificación y noncoding RNAs como microRNAs, lncRNAs o snARNs. Sin embargo, estas técnicas no pueden diferenciar activamente transcritas-, en estado estacionario de ARNm, la traducción de ARNm-activamente, y el ARNm de entrar en el proceso de degradación. La medición constante-stcomieron los niveles de mRNA se sabe que es un pobre estimación de la composición proteoma a 1-3. Por el contrario, la identificación de forma activa-traducción de ARNm da una imagen más precisa de la producción de proteínas. Sin embargo, los estudios de transcriptómica principalmente se han dirigido a nivel de todo el organismo mediante la comparación de la ganancia o pérdida de la función de un factor específico a la condición de tipo salvaje 4-7 o en el tejido diseccionado, por lo que los perfiles de expresión génica de difícil interpretación. Los recientes avances en instrumentos de focalización de células, purificación por afinidad y mejoras de sensibilidad permiten ahora para llevar a cabo los análisis de todo el genoma en las poblaciones de células pequeñas o células individuales incluso en un organismo vivo. En Drosophila, grandes colecciones de líneas transgénicas permiten la orientación temporal y espacial específica de diferentes tejidos y las subpoblaciones de células a través del sistema GAL4 / UAS 8-10 obteniéndose la cuantificación más precisa de los mecanismos moleculares requeridos para la función celular. RNA-11. Este método basado en sacarosa centrifugación en gradiente permite la selección de la fracción polisomas y la determinación de ARNm traducido en todo el genoma cuando se analizaron con microarrays o secuenciación de profundidad. Polisoma aislamiento se puede acoplar con la digestión nucleasa para identificar huellas ribosomal correspondientes a fragmentos de ARN protegidos por los ribosomas durante el proceso de traducción 12. Footprinting Ribosomal aumenta la precisión de la cuantificación de la traducción del ARN y ARN resolución a nivel de secuencia y posicionamiento ribosoma, hace que sea posible medir la frecuencia de la traducción. Sin embargo, hasta la fecha no se ha aplicado al aislamiento de células específicas de translatomes, principalmente debido a la fuerte disminución en el rendimiento de ARN obtenido al final del proceso de footprinting ribosoma. Dado que la selección de tamaño de ARN puede generar potencial de falsos positives de diferentes RNPs que también podrían estar protegiendo ARN de una manera similar, se necesitan nuevos avances para mejorar la huella ribosomal y adaptarlo a los enfoques específicos de células. Uno de tales métodos, llamado el Translating ribosoma Purificación por Afinidad (TRAP) ha sido descrita en 2008 por Heiman et al. y aplicado para aislar el translatome de un subconjunto de neuronas en ratones. Por epítopo etiquetado una proteína ribosomal de una manera específica del tipo celular, polisomas se pueden purificar selectivamente sin la etapa laboriosa de disociación celular y la clasificación. En este caso, los 60S proteína ribosómica L10A en la superficie de los ribosomas fue etiquetado con eGFP 13. Desde 2008, varios estudios han utilizado este método en diferentes especies, a partir de ratones 14-19 a X. laevis 20,21, 22,23 pez cebra y Arabidopsis thaliana 24. El método TRAP también ha sido adaptada al modelo de Drosophila y utilizado a Purify ARNm a partir de células neuronales y astrocitos 26 25 específicos de tipo celular. Se utilizó el sistema GAL4 / UAS binaria versátil para expresar RpL10A-GFP etiquetados de una manera específica de tejido. Jefes de las moscas adultas fueron disecados para realizar la selección polisoma de células neuronales (dirigidos por pan-neuronal conductor Elav-Gal4) y ARN aislados fueron secuenciados. El gran número de genes regulados correspondió a los conocidos por ser expresado en el sistema nervioso, lo que indica que el enfoque tiene buena especificidad y nos impulsa para adaptarlo a las poblaciones de células raras (menos de 1% de las células) presentes en el desarrollo de embriones de Drosophila . Dentro del modelo de Drosophila, la etapa embrionaria es un modelo de elección para el estudio de los procesos de desarrollo, como los actores moleculares y movimientos morfogenéticos se conservan evolutivamente. Los enfoques transcriptomic solamente tejidos específicos llevados a cabo hasta la fecha en este modelo se han realizado usando celular o nuclear por lorting y sólo han podido estudiar transcriptoma en estado estacionario 27 a 31, creando la necesidad de métodos dedicados al tejido / translatome perfil específico de las células en el embrión de la mosca. Aquí mostramos el primer protocolo TRAP dedicada a los embriones de Drosophila. Con este método, enganchado-in-traducción del ARNm en una población celular muy restringido de alrededor de 100 células musculares por embrión se aisló con éxito con alta calidad y especificidad. El sistema binario GAL4 / UAS se utiliza para conducir la expresión de RpL10A GFP-etiquetados en subpoblación de músculos sin ninguna toxicidad, no hay fenotipos aparentes o retraso en el desarrollo como se indica anteriormente 25. Embriones de Drosophila poseen 30 músculos por hemisegment que darán lugar a la musculatura de la larva. Mediante el uso de una región reguladora descubierto en las proximidades del gen de identidad se queda atrás, 6 de los 30 músculos multi-nucleadas están dirigidos. En este ensayo, los ribosomas se inmovilizan en el ARNm usando el alargamiento traduccióninhibidor cicloheximida. Extractos citosólicos se utilizan entonces para purificación por afinidad con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo GFP. Calidad de ARN purificado fue validado utilizando bioanalizador. Quantitative PCR de transcripción inversa (RT-qPCR) se utilizó para determinar la especificidad y la sensibilidad de aislamiento de mRNA y demostró que nuestro protocolo optimizado es altamente eficiente.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>termo científico&nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>BSA 100X purificado&nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Levadura ARNt &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNasa In&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GFP clon N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Anticuerpos incorporados</td><td>75-132&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Homogeneización de lisis&nbsp;</td><td>Tecnología</td><td></td><td></td>Bertin</tr><tr><td>Agua libre de nucleasasa&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Biosistema aplicado&nbsp;</td><td></td><td></td>AM96406</tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)&nbsp;</td><td>Biosistema Aplicado&nbsp;</td><td></td><td></td>AM95306</tr><tr><td>Celulosa waddin sin blanquear&nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tamices 112, 355, 710 mmm&nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&nbsp;</td><td></td><td></td>28948964</tr><tr><td>Puntas de filtro de baja fijación&nbsp;</td><td>Tubo libre de</td> rnasa ClearLine <td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml&nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Fischer Biorreactivo &nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos inhibidores de la proteasa, Mini-Complete, sin EDTA&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, traducción ribosoma affinity purificación de poblaciones de células raras de<em&gt; drosophila</em&gt; los embriones

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

La medición de los niveles de ARNm en el proceso de traducción en células individuales proporciona información sobre las proteínas implicadas en las funciones celulares en un momento dado. El protocolo denominado Purificación de Afinidad de Ribosomas Traductores (TRAP) es capaz de capturar este proceso de traducción de ARNm de una manera específica para el tipo de célula. Basado en la purificación de la afinidad de polisomas portadores de una subunidad ribosómica marcada, TRAP se puede aplicar a análisis de translatomas en células individuales, lo que permite comparar tipos de células durante el curso de los procesos de desarrollo o rastrear el progreso del desarrollo de la enfermedad y el impacto de posibles terapias a nivel molecular. Aquí reportamos una versión optimizada del protocolo TRAP, llamado TRAP-rc (rare cells), dedicada a identificar ARNs comprometidos en la traducción de poblaciones de células raras. TRAP-rc se validó utilizando el sistema de orientación Gal4/UAS en una población restringida de células musculares en embriones de Drosophila. Este novedoso protocolo permite la recuperación de ARN específico del tipo de célula en cantidades suficientes para el análisis de la expresión génica global, como microarrays o RNA-seq. La robustez del protocolo y las grandes colecciones de controladores Gal4 hacen de TRAP-rc un enfoque muy versátil con aplicaciones potenciales en estudios de genoma específico de células.

El sistema muscular somática embrionario de Drosophila está compuesto por 30 músculos por hemisegment, y cada músculo tiene un conjunto específico de propiedades: el código de los genes de identidad, posición, número de eventos de fusión, sitios de fijación y la inervación. Identificar traducida del ARNm en un subconjunto específico del músculo dará información sobre las proteínas necesarias para formar estas características musculares específicos. Utilizando el método basado en la TRAP, ARN a partir de una subpoblación de los músculos que expresan el gen se queda atrás identidad se purificó (Figura 1A-B). Una preocupación importante de este enfoque es la calidad y la especificidad de la ARN aislado. El protocolo optimizado informó aquí habilitada la recuperación sistemática de ARN de alta calidad evaluados con el análisis bioanalizador. El perfil obtenido muestra ninguna degradación del ARN (Figura 1C). En otros estudios desarrollados en torno al método TRAP, se plantearon cuestiones sobre la especificidad de los datos. Aquí iejorar el método para suprimir el fondo ligado a la unión no específica del ARN a las perlas o los tubos y por la optimización de la solución tampón de lavado. Con el fin de evaluar el nivel y la eficacia de aislamiento de células que expresan slouch fondo, nos llevó ensayos RT-qPCR en 3 repeticiones de la misma etapa embrionaria. Doblar-enriquecimientos de 4 genes diferentes (MEF2, se queda atrás, prospero, soxNeuro) se calcularon en comparación con la entrada y normalizado contra el gen RPL32 (Figura 1D). Estos resultados mostraron enriquecimiento de 2,3 veces de pan-musculares MEF2 genes y enriquecimiento de 5,6 veces del gen se queda atrás. En contraste, los dos genes expresados ​​en el sistema neural se empobrecido en comparación con la entrada. Se observaron valores de cambio veces muy similares en 3 repeticiones biológica, lo que demuestra que el protocolo es robusto. Con conductor Slouch-Gal4 y partiendo de 1,5 g, alrededor de 1,5x10 ^ 6 embriones fueron obtenidos que contienen 100 células GFP / embrión (un total de 150 × 10 ^ 6 positivocélulas). Después de ejecutar el experimento TRAP, el rendimiento es de alrededor de 25 a 45 ng de ARN específico dependiendo de la etapa de intereses. Este material es suficiente para hacer funcionar el análisis de microarrays o RNA-Seq usando un protocolo de amplificación para construir una biblioteca de ARN-ss. Eficiencia dependerá en gran medida de la fuerza del conductor utilizado para expresar RpL10A-EGFP. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Figura 1. Calidad y evaluación especificidad de ARN TRAP-aislado de Slouch-GAL4&gt; embriones UASRpL10A-EGFP. (AB) Confocal de imágenes de un embrión de etapa-16 que muestra la expresión RpL10A-EGFP específicamente en las seis células musculares Slouch por hemisegment (A). Co-localización de RpL10A-EGFP con el Beta3tubulin generales marcador muscular se observa en la foto de combinación (B). (C) Control de calidad de Traped ARN ran en bioanalizador mostrando perfecta integridad de ARNr 18S y 28S. Análisis (D) RT-qPCR mostrando una alta especificidad de experimentos de mRNA TRAP aislado en 3 réplicas biológicas de etapa-16 embriones. Doblar el cambio se calcula en comparación con la entrada y normalizado contra el gen RPL32. MEF2 transcripciones presentes en todos los linajes musculares son enriquecidos en 2,3 veces en comparación con la entrada, mientras que las transcripciones slouch más restringidas son 5,6 veces enriquecido. Células neuronales que expresan prospero y genes soxN se agotan 2,2 veces y 5,5 veces, respectivamente. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La Purificación de Afinidad de Ribosoma Traductora (TRAP) es capaz de capturar la traducción específica del tipo de célula del ARNm. Aquí informamos sobre el primer protocolo TRAP dedicado al aislamiento de ARNm en poblaciones celulares raras de embriones de Drosophila.

TRAP-rc, Traducción ribosoma Affinity Purificación de poblaciones de células raras de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar el ARN que participa en la traducción de manera específica según el tipo celular en embriones de Drosophila. Esto se logra primero recolectando embriones de una línea de mosca transgénica, que permite la expresión específica de una subunidad ribosómica marcada con GFP en el tipo celular objetivo, en este caso, las células musculares slouch. El segundo paso consiste en generar un lisado para obtener una preparación de polisomas que contenga una mezcla de ribosomas marcados y no marcados.A continuación, se estima la concentración de proteína en el lisado y se realiza la purificación por afinidad con perlas acopladas a anticuerpos GFP para capturar complejos de ARN ribosómico del tipo celular de interés. El paso final está dedicado a la extracción y purificación de ARN, triol. Finalmente, se realizan evaluaciones de calidad y especificidad con un bioanalizador y R-T-Q-P-C-R, respectivamente.El ARN luego puede utilizarse para análisis cuantitativos globales mediante secuenciación de ARN o microarreglos. La principal ventaja de esta técnica frente a nuestros métodos existentes, como la clasificación VX, es que no requiere un paso de laboratorio de disociación celular. Puede realizarse directamente en el banco de trabajo.Es rápido y permite la identificación directa del ARN traducido en una población muy pequeña de células, lo cual es una ventaja significativa para comprender la adquisición de propiedades celulares. Aunque este método puede proporcionar información sobre la miogénesis en el embrión Josephine, también puede aplicarse a otros tejidos u organismos modernos, como plantas, peces cebra o ratones, y podría ayudar además a seguir el impacto de un tratamiento sobre la síntesis de proteínas en caso de patología. El procedimiento será demostrado por Benjamin Berta, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Después de generar ambas líneas transgénicas según las instrucciones de la parte escrita del protocolo y realizar el cruce para crear la línea transgénica doble con el sistema de captura, amplifique la línea preparando primero ocho jaulas poblacionales grandes de forma cilíndrica que contengan alrededor de 40 gramos de moscas jóvenes por jaula, lo que corresponde aproximadamente a 180 000 moscas por jaula.Prepare placas de Petri de 11 centímetros de diámetro que contengan una mezcla de agar solidificado y jugo de uva, con un tercio de la superficie cubierta con pasta de levadura recién preparada, y permita que las moscas pongan huevos en estas placas durante una hora. Repita este proceso en otros dos juegos de placas frescas con jugo de uva para permitir que las moscas vacíen completamente sus oviductos. Los embriones doble transgénicos deseados del cruce se pondrán en la cuarta placa.Retire las placas que contienen los embriones deseados de las jaulas y permita que incuben hasta la etapa de desarrollo deseada a temperatura ambiente. En este caso, se utiliza una incubación de 13 horas. Luego, re suspenda el contenido de la placa con aproximadamente 50 mililitros de agua utilizando un pincel.Separar los embriones de las moscas muertas haciendo pasar el líquido a través de tres tamices de 700, 355 y 112 micrones de diámetro. Enjuagar los embriones recolectados en el tamiz de menor diámetro con agua ionizada. Cubrir los embriones con una solución de lejía al 4,5 % en agua ionizada durante dos minutos, y luego enjuagar bien con agua ionizada durante 30 a 60 segundos.Incube los embriones en PBS con 0,01 % de T entre 20 y 100 microgramos por mililitro. Incube cicloheida durante cinco a diez minutos a temperatura ambiente con agitación. Después de secar los embriones en hojas absorbentes de celulosa, transfiera los embriones a tubos de microcentrífuga, pese los tubos y congele rápidamente los embriones por inmersión en nitrógeno líquido.En esta etapa, los embriones secos pueden almacenarse durante varios meses a menos 80 grados Celsius. Transfiera 1,5 gramos de los embriones secos a tubos de 15 mililitros previamente enfriados, que contengan cuatro mililitros de tampón de extracción de polisomas, y homogenice utilizando una pipeta serológica estéril de 10 mililitros.Luego, distribuya los embriones homogenizados en dos tubos preenfriados de dos mililitros y muela los embriones en un molinillo rápido de bolas multidireccional. Establezca que funcione dos veces durante 10 segundos a 5.000 RPM con una pausa de 15 segundos entre cada ciclo. Después de 10 minutos de centrifugación a 2000 G, transfiera el lisado a un tubo fresco preenfriado para microcentrífuga sobre hielo.Añada 10 % de nonil fenol etoxilado (non P 40) al sobrenadante S hasta una concentración final de 0,1 % y mezcle suavemente invirtiendo el tubo. Añada 300 micromolares de DHPC hasta una concentración final de 30 milimolares y mezcle suavemente invirtiendo el tubo. Incube la mezcla en hielo durante cinco minutos, mezclando por inversión varias veces durante la incubación.Tras la incubación en hielo, prepare el sobrenadante posmitocondrial mediante centrifugación a cuatro grados Celsius durante 10 minutos a 20.000 ×g. Después de medir la concentración de proteína mediante el método de Bradford y obtener una concentración de proteína entre 60 y 80 miligramos por mililitro, transfiera el SNAT a un tubo de microcentrífuga fresco previamente enfriado y continúe inmediatamente con el paso de preabsorción. Resuspenda los perlas magnéticas con agitación suave y luego transfiera 30 microlitros de perlas por cada mililitro de lisado a un tubo de microcentrífuga.Recoja las perlas en el imán, retire con pipeta el sobrenadante y re suspenda las perlas en 500 microlitros de tampón de extracción de polisomas. A continuación, recoja las perlas en el imán. Vuelva a añadir lisado embrionario e incube durante una hora a cuatro grados Celsius en un rotador.Retire las perlas y coloque el sobrenadante sobre hielo hasta la etapa de inmunopurificación. Reservando 100 microlitros del sobrenadante como muestra global de ARN para comparación con la muestra recolectada tras la inmunopurificación, agregue un mililitro de lisado previamente absorbido a un tubo libre de ARN que contenga 90 microlitros de perlas bloqueadas acopladas al anticuerpo GFP. Incube la muestra a cuatro grados Celsius durante dos horas o durante la noche con mezcla suave de extremo a extremo en un rotador de tubos; tras la incubación.Lave las perlas primero centrifugando las perlas restantes en una minicentrífuga. Luego, coloque el tubo sobre un imán, elimine el sobrenadante, resuspenda en 500 microlitros de tampón de lavado e incube con agitación durante 10 minutos en la sala fría. Finalice la mezcla y vuelva a recoger las perlas sobre el imán.Transfiera las perlas a un tubo nuevo libre de ARNr previamente protegido y lávelas dos veces más. Finalmente, después de recolectar las perlas en el imán, proceda a la extracción de ARN añadiendo un mililitro de TRIOL a las perlas y realizando la extracción según las instrucciones del fabricante. A continuación, realice la purificación del ARN utilizando un kit RNEZ micro según las instrucciones del fabricante.Para evaluar la especificidad del ARN atrapado, realice la transcripción inversa sobre tres nanogramos de ARN inmunopurificado y ARN de entrada según procedimientos estándar. Luego, use el ADNc obtenido para la PCR cuantitativa con conjuntos de cebadores específicos para el gen. Esta imagen confocal de un embrión en la etapa 16 muestra la expresión de RPL 10 A-E-G-F-P, específicamente en las seis células musculares slouch de cada segmento HEMI; se observa la colocalización de RPL 10 A-E-G-F-P con el marcador general de músculo beta tres tubulina.El ARN atrapado se analizó en un bioanalizador con fines de control de calidad. Obsérvese la integridad perfecta de los ARN ribosomales de ocho s y dos ocho s. Esta figura muestra los resultados de un análisis de RT-qPCR en tres réplicas biológicas de embriones en la etapa 16, y demuestra la alta especificidad del ARNm aislado mediante atrapamiento.El cambio en FO se calculó en comparación con la entrada y se normalizó frente al gen RPL 32 met. Dos transcritos presentes en todas las líneas musculares se enriquecieron 2,3 veces en comparación con la entrada, mientras que los transcritos más restringidos de slouch se enriquecieron 5,6 veces; las células neurales que expresan prospero y socks, y los genes, se redujeron 2,2 y 5,5 veces, respectivamente, tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores, particularmente en el campo de la biología del desarrollo, exploraran el compromiso autónomo y la adquisición de propiedades celulares durante la diferenciación de embriones doof.

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un obstáculo importante para los análisis bioquímicos de los ribosomas que contienen naciente peptidil-ARNt ha sido la presencia de los ribosomas otros en las mismas muestras, los ribosomas no participan en la traducción de la secuencia del ARNm específico que se analiza. Hemos desarrollado una metodología sencilla para purificar, exclusivamente, los ribosomas que contiene la naciente peptidil-tRNA de interés.

El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque sencillo y barato para recolectar embriones de Drosophila a escala media (0,5-1 g) y preparar extractos de proteínas que pueden ser utilizados en aplicaciones proteómicas aguas abajo, tales como la purificación por afinidad-espectrometría de masas (AP-MS ).

Preparación a mediano plazo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embriones para experimentos proteómicos

Presentamos un enfoque para purificar el ARNm ligado al ribosoma a partir de células endoteliales vasculares (OC) directamente en el cerebro del ratón, los pulmones y los tejidos cardíacos a través de la etiqueta genética específica de la CE de la proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP) en ribosomas en combinación con la purificación del ARN .

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para el aislamiento de ARN de células endoteliales in vivo

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) ofrece la posibilidad de diseccionar programas de desarrollo con un procesamiento mínimo de órganos y tejidos. El protocolo produce ARN de alta calidad a partir de células dirigidas con una subunidad ribosomal etiquetada con proteína fluorescente verde (GFP). Las herramientas de análisis aguas abajo, como qRT-PCR o RNA-seq, revelan perfiles de expresión específicos del tejido y del tipo de célula.

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para investigar el desarrollo de la raíz de Arabidopsis thaliana a una escala específica de tipo de célula

Aquí, describimos la inmunoprecipitación de ribosomas y el ARN asociado de poblaciones selectas de células germinales macho adultas utilizando el sistema RiboTag. La cría estratégica y la cuidadosa inmunoprecipitación dan como resultado resultados limpios y reproducibles que informan sobre el traducto de células germinales y proporcionan información sobre los mecanismos de los fenotipos mutantes.

RiboTag Inmunoprecipitación en las células germinales del ratón macho

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de la cadena naciente, la orientación, el plegado y las vías de ensamblaje. Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

Este protocolo tiene como objetivo aislar los ARNm ribosómicos de traducción específicos del tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP.

Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular

Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, en este protocolo, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno Drosophila TRP.

Purificación de los canales potenciales del receptor transitorio de Drosophila endógeno

La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

El protocolo describe el método de hibridación in situ de fluorescencia sensible a polimorfismos de un solo nucleótido (SNP-FISH) para distinguir las transcripciones de ARN ribosómico derivadas del locus de ADN ribosómico del cromosoma X o Y en Drosophila melanogaster.

Detección de FISH sensible al polimorfismo de un solo nucleótido de la transcripción de ARN ribosómico específico del locus en Drosophila melanogaster

Aquí ofrecemos detalles sobre cómo preparar lisados y realizar la traducción in vitro utilizando embriones de Drosophila .

Traducción de ARNm in vitro libre de células en lisados de Drosophila

Aprenda el protocolo TRAP para aislar ARNm de poblaciones celulares raras en embriones de Drosophila. Este método permite capturar traducción específica de tipo celular sin disociación, facilitando el estudio de mecanismos de desarrollo.

TRAP-rc, Traducción ribosoma Affinity Purificación de poblaciones de células raras de

Explorar más videos