TRAP-rc, Traducción ribosoma Affinity Purificación de poblaciones de células raras de Drosophila Los embriones

El objetivo general de este procedimiento es aislar el ARN de traducción involucrado en la traducción de una manera específica por tipo celular en embriones de Drosophila. Esto se logra recolectando primero embriones de una línea de mosca transgénica, lo que permite la expresión específica de una subunidad ribosómica marcada con GFP en el tipo de célula objetivo, en este caso, las células musculares encorvadas. El segundo paso es generar un lisado para obtener una preparación de polisomas que contenga una mezcla de ribosomas marcados y no marcados.

A continuación, se estima la concentración de proteínas en el lisado y se realiza la purificación de la afinidad con perlas acopladas a anticuerpos GFP para capturar complejos de ARN de ribosoma del tipo de célula de interés. El paso final está dedicado al triol, el ARN, la extracción y la purificación. En última instancia, las evaluaciones de calidad y especificidad se realizan con un bioanalizador y R-T-Q-P-C-R respectivamente.

A continuación, el ARN se puede utilizar para el análisis cuantitativo global mediante secuenciación de ARN o microarrays. La principal ventaja de esta técnica de nuestro método actual, como la clasificación VX, es que no requiere un paso de labo de disociación celular. Se puede realizar en el banco.

Es rápido y permite la identificación directa de ARN traducido en poblaciones muy pequeñas de células, lo que supone un beneficio medido para la comprensión de la adquisición de propiedades celulares. Aunque este método puede proporcionar información sobre la miogénesis en el embrión Josephine, también se puede aplicar a otros tejidos u organismos modernos, como plantas, cebras, peces o ratones, y también podría ayudar a seguir el impacto del tratamiento en la síntesis de proteínas en caso de patología. La demostración del procedimiento estará a cargo de Benjamín Berta, un estudiante de doctorado de mi laboratorio Después de la ingeniería, ambas líneas transgénicas de acuerdo con las instrucciones en la parte escrita del protocolo y el cruce para crear la trampa de doble cruz transgénica, amplificar la línea preparando primero ocho grandes jaulas cilíndricas de población que contienen alrededor de 40 gramos de moscas jóvenes por jaula, lo que corresponde a unas 180.000 moscas por jaula.

Prepare placas de Petri de 11 centímetros de diámetro que contengan una mezcla de agar solidificado y jugo de uva con un tercio de la superficie cubierta con pasta de levadura recién hecha, y deje que las moscas pongan huevos en estas placas durante una hora. Repita este proceso en dos juegos más de platos de jugo de uva fresco para permitir que las moscas vacíen completamente sus tubos. Los embriones transgénicos dobles deseados de la cruz se colocarán en la cuarta placa.

Retire las placas que contienen los embriones deseados de las jaulas y déjelos incubar hasta la etapa de desarrollo deseada a temperatura ambiente. Aquí se utiliza una incubación de 13 horas. A continuación, vuelva a suspender el contenido de la placa con unos 50 mililitros de agua con un cepillo.

Separar los embriones de las moscas muertas haciendo pasar el líquido por tres tamices de 700, 355 y 112 micras de diámetro. Enjuague los embriones recolectados en el tamiz de diámetro más pequeño con el agua ionizada. Recubra los embriones con lejía al 4,5% en el agua ionizada durante dos minutos y luego enjuague bien con el agua ionizada durante 30 a 60 segundos.

Incubar los embriones en PBS 0.01%T entre 20 y 100 microgramos por mililitro. Cicloheide durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Después de secar los embriones en láminas absorbentes de celulosa, transfiéralos a tubos de microcentrífuga, luego pese los tubos y flashee, congele los embriones por inmersión en nitrógeno líquido.

En esta etapa, los embriones secos pueden almacenarse durante varios meses a menos 80 grados centígrados. Tendencia a transferir 1,5 gramos de los embriones secos a tubos pre enfriados de 15 mililitros, conteniendo cuatro mililitros de polisomas de extracción, tampón y homogeneizados. Utilizando una pipeta serológica estéril de 10 mililitros.

A continuación, distribuya los embriones homogeneizados en dos tubos de preenfriamiento de dos mililitros y triture los embriones en un molinillo de bolas multidireccional de alta velocidad. Configurado para ejecutarse dos veces durante 10 segundos a 5.000 RPM con una pausa de 15 segundos entre cada ciclo. Después de 10 minutos de centrifugación a 2000 G, transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga recién enfriado sobre hielo.

Añadir 10%non P 40 al sobrenadante S hasta una concentración final de 0,1% y mezclar suavemente invirtiendo el tubo. Añadir 300 micromolares de DHPC hasta una concentración final de 30 milimolares y mezclar suavemente invirtiendo el tubo. Incubar la mezcla en hielo durante cinco minutos, mezclando por inversión varias veces durante la incubación.

Después de la incubación en hielo. Prepare el supinato postmitocondrial por centrifugación a cuatro grados centígrados durante 10 minutos a 20.000 G. Después de medir la concentración de proteína por el Método Bradford y obtener una concentración de proteína entre 60 y 80 miligramos por mililitro, transfiera el SNAT a un tubo de microcentrífuga preenfriado fresco y proceda inmediatamente a la etapa de preabsorción. Vuelva a suspender las perlas magnéticas con una agitación suave y luego transfiera 30 microlitros de perlas por cada mililitro de lisado a un tubo de microcentrífuga.

Recoja las perlas en el imán, pipetee el remolcador y vuelva a suspender las perlas y 500 microlitros de tampón de extracción de polisomas. A continuación, recoja las cuentas en el imán. De nuevo, añadir embrionario, lisado e incubar durante una hora a cuatro grados centígrados en un rotador.

Retire las perlas y coloque el agente supino en hielo hasta el paso de inmunopurificación. Reservando 100 microlitros del supinato como muestra de ARN global para compararlos con la muestra recogida después de la inmunopurificación para inmunopurificar la muestra, se añada un mililitro de lisado preabsorbido a un tubo libre de ARN que contenga 90 microlitros de perlas bloqueadas acopladas al anticuerpo GFP. Incubar la muestra a cuatro grados centígrados durante dos horas o toda la noche con una mezcla suave de extremo a extremo en un rotador de tubos después de la incubación.

Lave las cuentas girando primero las cuentas restantes en una mini centrífuga. A continuación, recoger en un imán resuspender en 500 microlitros de lavado, tampar e incubar una y otra vez. Termine de mezclar 10 minutos en la cámara frigorífica y nuevamente, recoja las cuentas en el imán.

Transfiera las perlas a un tubo libre de ARN R pre escudo fresco y lave dos veces más. Finalmente, después de recolectar las perlas en el imán, proceda a la extracción de ARN agregando un mililitro de TRIOL a las perlas y realice la extracción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, limpie el ARN, utilizando un microkit de RNEZ de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para probar la especificidad del ARN atrapado, realice la transcripción inversa en tres nanogramos de ARN inmunopurificado y de entrada de acuerdo con los procedimientos estándar. A continuación, utilice el CDNA obtenido para la QPCR con conjuntos de cebadores específicos de genes. Esta imagen confocal de un embrión en estadio 16 muestra la expresión de RPL 10 A-E-G-F-P, específicamente en las seis células musculares encorvadas en cada segmento HEMI, se observa la colocalización de RPL 10 A-E-G-F-P con el marcador muscular general beta tres tubulina.

El ARN atrapado se ejecutó en un bioanalizador con fines de control de calidad. Obsérvese la perfecta integridad de los ARN ribosómicos de un ocho s y dos de ocho s. Esta figura muestra los resultados de un análisis de RT QPCR en tres réplicas biológicas de embriones en etapa 16 y demuestra la alta especificidad del ARNm aislado en trampa.

El cambio de FO se calculó en comparación con la entrada y se normalizó contra el gen RPL 32 metanfetamina. Dos transcripciones presentes en todos los linajes musculares están 2,3 veces enriquecidas en comparación con la entrada, mientras que las transcripciones más restringidas están enriquecidas 5,6 veces, las células neuronales que expresan prospero y los calcetines y los genes se agotan 2,2 veces y 5,5 veces respectivamente después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores, particularmente en el campo de la biología del desarrollo, exploraran el compromiso de autoayuda y la adquisición de propiedades celulares durante la diferenciación de embriones hembra.