Kupffer aislamiento de células de nanopartículas de Pruebas de Toxicidad
August 18th, 2015
Los macrófagos hepáticos, llamados células de Kupffer, son responsables de la captura de las nanopartículas circulantes. Describimos aquí un método, de alta pureza y rendimiento celular, para el aislamiento de células de Kupffer. El ensayo de LDH modificado se utiliza aquí para medir la toxicidad inducida por los nanotubos de carbono en las células de Kupffer.
El objetivo general del siguiente experimento es aislar y purificar la copa de ratón para células en alto número para estudiar la toxicidad de las nanopartículas. Esto se logra mediante la perfusión de hígados de ratón con una solución de H-B-S-S-E-G-T-A y un colágeno, una solución para digerir suavemente el tejido hepático. A continuación, las células hepáticas se purifican por densidad, centrifugación y adhesión selectiva para obtener un cultivo de copa purificada para las células.
A continuación, se realiza un análisis de citometría de flujo para confirmar la pureza y las propiedades ácidas F de la copa para las células. Se obtienen resultados que muestran que la toxicidad de los nanotubos de carbono funcionalizados se puede medir en taza para las células. Basado en el L-D-H-S-A modificado, lo que respalda que este modelo se puede aplicar a las pruebas de toxicidad de nanopartículas.
El método que pretendemos mostrarle hoy puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nanotoxicología, como la evaluación de la toxicidad de los portadores de fármacos desarrollados recientemente, esto es bastante importante ya que la mayoría de las líneas celulares inmortalizadas utilizadas muestran propiedades significativamente diferentes a las de los tejidos de los que se derivaron. Una demostración visual de este método es crucial. Si el método se lleva a cabo con éxito, dará como resultado la obtención de un alto rendimiento y pureza de las células ke, que luego se pueden usar como modelo para detectar esa toxicidad en una variedad de nanopartículas.
Después de preparar todos los reactivos enumerados en la tabla de materiales y reactivos que se encuentran con el protocolo de texto adjunto, caliente la solución E-G-T-A-H-B-S-S y la solución de colagenasa a 40 grados Celsius durante 30 minutos, use etanol al 70% para enjuagar el tubo flexible de la bomba. A continuación, vierta 40 mililitros de solución E-G-T-A-H-B-S-S en un tubo de centrífuga sumergido en el baño de agua y utilice el E-G-T-A-H-B-S-S precalentado para enjuagar el tubo flexible de la bomba. Después de sacrificar a un ratón CD one, de acuerdo con el protocolo de texto, afeite los vellos abdominales y use etanol al 70% para desinfectar la superficie abdominal.
Confirme la anestesia mediante un pellizco de los dedos de los pies. Corta a través de la cavidad abdominal y expone la vena porta y la vena cava inferior moviendo el intestino lateralmente hacia la izquierda del abdomen. Ponga en marcha la bomba a una velocidad de uno a tres mililitros por minuto con una solución E-G-T-A-H-B-S-S y con una aguja de mariposa de calibre 23, canude la vena porta, pinza la sección canulada de la vena porta y luego voltee las pinzas sinusoidales en la superficie del abdomen del ratón abierto.
El hígado debe palidecer dentro de los primeros 30 segundos de perfusión, incidir rápidamente la parte inferior de la vena cava inferior para evitar la acumulación de exceso de presión en el hígado y aumentar la tasa de flujo gradualmente a siete mililitros por minuto durante el primer minuto de perfusión. Cuando quedan menos de cinco mililitros de solución E-G-T-A-H-B-S-S en el tubo de centrífuga. Agregue de 40 a 50 mililitros de colágeno por solución, luego aumente el caudal gradualmente a 10 mililitros por minuto durante 30 segundos.
Haga que el hígado se hinche usando pinzas para aplicar presión periódicamente a la vena cava inferior durante intervalos de 10 a 32. Esto mejorará la disociación celular y reducirá el tiempo de perfusión con la colagenasa. Cuando queden menos de 10 mililitros de solución de colagenasa dentro del tubo de centrífuga, agregue 40 a 50 mililitros adicionales de solución de colagenasa precalentada al tubo.
Luego, una vez que se hayan perfundido de 70 a 80 mililitros, use pinzas para aplicar una presión ligera sobre la superficie. Una marca de depresión indica que las células hepáticas están disociadas. Retire el hígado de la cavidad abdominal como una sola pieza y colóquelo en un tubo de centrífuga que contenga de 20 a 30 mililitros de taza para el aislamiento celular. Medio.
Mantenga las células hepáticas en hielo hasta por tres horas y agrupe hasta tres hígados para purificarlas y purificarlas para purificar las células. Coloque un hígado perfundido en una placa de Petri con 15 mililitros de taza para el aislamiento celular, medio con tijeras o pinzas. Rompe la cápsula brillante y libera todas las células hepáticas en el medio.
Filtre la solución a través de un filtro de celdas de 100 micrómetros en un tubo de centrífuga. A continuación, centrifugar la suspensión de la célula a 50 GS a cuatro grados centígrados durante dos minutos. Las células parenquimatosas estarán en el pellet y las células no parenquimatosas en el sobrenadante.
Recoja el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio y centrifugue a 50 g durante dos minutos. Repita para un total de cuatro transferencias y giros. Siguiente centrífuga.
El supernat a 1, 350 GS durante 15 minutos. Para pellet las células no parenquimatosas, desechar el supernat y resuspender el pellet en 10 mililitros de taza para medio de aislamiento celular, añadir la solución de células no parenquimatosas al gradiente isotónico discontinuo 25 50% previamente preparado según el protocolo de texto y centrifugar a 850 GS durante 15 minutos sin aceleración ni interrupción. Con una pipeta serológica de 10 mililitros, aspire unos 12 mililitros del vaso enriquecido para la fracción celular que parece turbia dentro de la fracción SIP del 25 % cerca de la interfaz del 25 al 50 % SIP.
Transfiera las células a un tubo de centrífuga que contenga de 35 a 40 mililitros de taza para el aislamiento celular, medio y mezcle suavemente, luego centrifugue a 1, 350 GS y cuatro grados Celsius para pellet las celdas, deseche el súper nombrado y use de cinco a 10 mililitros de medio precalentado para resuspender las células con un hemocitómetro. Cuente las células y use la tinción con azul de trian para medir la placa de viabilidad. Las células no parenquimatosas purificadas en placas de 24 pocillos a una densidad de cinco veces 10 a la quinta celdas por pocillo.
Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. A continuación, retire suavemente el medio. Use HBSS precalentado para lavar las células y reemplácelo con 500 microlitros por pocillo de taza precalentada fresca para el medio de cultivo celular.
Vuelva a colocar las células a 37 grados centígrados durante al menos cuatro horas para permitir que las células se adhieran antes del tratamiento con partículas de nanopartículas. Después de caracterizar la pureza y la actividad fagocítica del C para las células y la incubación con nanotubos de carbono funcionalizados o fcts como se describe en el protocolo de texto, deseche el sobrenadante y agregue 200 microlitros por pocillo de tampón de lisis. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos, realizar un pipeteo vigoroso y recoger la copa de mentira para las células en tubos de microcentrífuga.
A continuación, centrifugar a 20.000 GS durante 10 minutos para extraer los fcn ts que fueron absorbidos por las células en los restos de la célula. Recoja el sobrenadante en tubos de microcentrífuga y guárdelo a 20 grados centígrados negativos. Alternativamente, transfiera 50 microlitros a una placa de 96 pocillos y agregue un volumen igual de solución de mezcla de sustrato del kit de lactato deshidrogenasa.
Incluya triplicados de pocillos en blanco que contengan 50 microlitros de tampón de lisis y 50 microlitros de solución de mezcla de sustrato. Luego cubra la placa e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de agregar 50 microlitros de solución de parada. Finalmente, lea la absorbancia a 490 nanómetros en un lector de microplacas y use la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de viabilidad celular.
Esta figura ilustra que el número de células no parenquimatosas purificadas oscila entre ocho y 14 veces 10 por las seis células por ratón y triano. La tinción azul demostró aproximadamente un 95% de viabilidad celular. El vaso adherente para las células adoptó una forma redonda a los 30 minutos de la incubación y, después de cuatro horas, las células se extendieron y comenzaron a formarse grupos, como se ve aquí.
Las células se tiñeron con el anticuerpo F 4 80 para demostrar la pureza celular, que se midió por encima del 95% mediante citometría de flujo. Además, después de 12 horas en cultivo, el análisis de citometría baja mostró que el 85% de las células eran capaces de actividad ácida PHA por su capacidad para absorber perlas fluorescentes de un micrómetro. Sin embargo, este número disminuyó a las 72 horas en cultivo, cuando solo el 40% de las células eran fagocíticas.
La taza para las células incubadas con nanotubos de carbono funcionalizados durante 24 y 72 horas tuvo morfologías similares en comparación con las células naïve. En contraste, la copa para las células incubadas con 10% de DMSO utilizada como control positivo mostró una morfología necrótica después del análisis del ensayo de LDH modificado, la copa para las células tratadas con 10% de DMSO durante 24 y 72 horas mostró una alta toxicidad en comparación, las fcts indujeron una reducción leve pero significativa en la viabilidad celular solo cuando las células se expusieron a 50 microgramos por mililitro durante 72 horas. Siguiendo este método, se pueden probar otras SC basadas en células y todos los tipos de nanopartículas utilizando células ke aisladas.
Esto permite recopilar datos fiables al tiempo que se minimiza el uso de animales. Esperamos que esta técnica pueda ayudar a abrir el camino para que los investigadores en el campo de la psicología de la nanotecnología puedan evaluar la seguridad de los muchos nanoportadores prometedores que se están desarrollando cada vez más.
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Visión general
Este estudio se centra en el aislamiento y purificación de células de Kupffer de ratón para investigar la toxicidad de las nanopartículas. Se emplea un método que involucra perfusión hepática y centrifugación de densidad para lograr una alta pureza y rendimiento celular.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Toxicología
Antecedentes
- Las células de Kupffer son macrófagos hepáticos que capturan nanopartículas circulantes.
- Entender la toxicidad de las nanopartículas es crucial para aplicaciones biomédicas.
- Las técnicas de aislamiento celular de alta pureza son esenciales para pruebas de toxicidad precisas.
- El ensayo de LDH modificado es un método confiable para evaluar la toxicidad celular.
Propósito del estudio
- Aislar y purificar células de Kupffer de hígados de ratón.
- Estudiar la toxicidad de los nanotubos de carbono en estas células.
- Validar el uso de células de Kupffer en pruebas de toxicidad de nanopartículas.
Métodos utilizados
- Perfusión de hígados de ratón con una solución H-B-S-S-E-G-T-A.
- Solución de colagenasa utilizada para la digestión suave del tejido hepático.
- Centrifugación de densidad para la purificación celular.
- Análisis de citometría de flujo para confirmar la pureza y funcionalidad celular.
Resultados principales
- Se obtuvieron con éxito cultivos de células de Kupffer de alta pureza.
- La toxicidad de los nanotubos de carbono fue medible en las células de Kupffer.
- El ensayo de LDH modificado evaluó eficazmente la toxicidad celular.
- Este modelo apoya más pruebas de toxicidad de nanopartículas.
Conclusiones
- El método de aislamiento proporciona un enfoque confiable para estudiar las células de Kupffer.
- Los nanotubos de carbono funcionalizados pueden ser probados para su toxicidad en este modelo.
- Los hallazgos contribuyen a entender las interacciones de las nanopartículas en el hígado.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Isolating primary Kupffer cells addresses a key limitation in nanotoxicology where immortalized cell lines yield discrepant results, improving predictive confidence in nanoparticle safety assessment. This method supports target validation by providing a physiologically relevant model of liver macrophage function, critical for de-risking nanoparticle-based drug carriers. High-yield, high-purity isolation enables reproducible screening of nanomaterials, aligning with early discovery goals for translational biomarker alignment and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modeling nanoparticle-Kupffer cell interactions in a disease-relevant system.
- Operational Value: Provides a purified primary cell source (>95% purity) for consistent target engagement and pathway clarification studies.
- Predictive Value: Supports lead identification by measuring functional outcomes like phagocytic activity and viability after nanoparticle exposure.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers a standardized biological system for quantitative LDH-based toxicity readouts, enabling reliable compound evaluation.
- Operational Value: Uses accessible equipment (centrifuge, perfusion pump) to ensure scalability and cross-lab reproducibility.
- Assay Readiness: Generates sufficient cell yield (up to 14×10⁶ cells/mouse) for multi-well plate screening of nanoparticle libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical workflows by using primary cells that reflect human liver macrophage biology more closely than immortalized lines.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through consistent toxicity measurement (e.g., LDH release) across nanoparticle doses and exposure times.
- Translational Continuity: Enables biomarker-aligned screening where Kupffer cell activation or dysfunction predicts in vivo nanoparticle clearance and safety.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a reproducible assay for nanoparticle toxicity screening before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nanoparticle uptake and macrophage activation via flow cytometry confirmation of F4/80+ phagocytic cells.
- Screening: Enables assay standardization through density gradient purification and selective adhesion steps that yield homogeneous Kupffer cell populations.
- Analytics: Generates quantitative viability data via modified LDH assay, allowing dose-response modeling and cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RES-mediated nanoparticle capture, a key determinant of biodistribution and clearance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable to diverse nanomaterials (e.g., functionalized CNTs, drug carriers) across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by using primary cells that maintain native phagocytic and cytokine signaling functions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized perfusion, digestion, and purification steps yielding >95% pure Kupffer cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early predictive confidence in nanoparticle biocompatibility, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nanocarriers based on liver macrophage toxicity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent surgery, perfusion techniques, and primary cell handling.
- Dependent on centrifugation equipment, cell strainers, and flow cytometry for validation.
- Necessitates standardization across teams for collagenase digestion times and gradient preparation to ensure consistency.
- Adaptation considerations include adjusting mouse weight (35-45 g) to optimize yield and cannulation success.
- Practical limitations include cell viability decline in culture (phagocytic activity drops from 85% to 40% over 72 hours), requiring timely assay execution.
