Name: Kupffer aislamiento de células de nanopartículas de Pruebas de Toxicidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende a aislar células de Kupffer de ratón mediante perfusión hepática y centrifugación en gradiente de densidad para evaluar la toxicidad de nanopartículas. Este método permite obtener cultivos de alta pureza para estudios de nanotoxicología.

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Este trabajo fue apoyado por el programa de la Red Marie-Curie de FP7-ITN de la UE, RADDEL. MB y KAJ desean agradecer a Joe Varguese y Rui Serra Maia por su ayuda y sugerencias a lo largo de la optimización del aislamiento de la célula de Kupffer.

Todos los experimentos con animales fueron ejecutados en cumplimiento de todas las directrices pertinentes, los reglamentos y las agencias reguladoras. El protocolo que se demostró fue realizado bajo la dirección y aprobación del reglamento oficina del Reino Unido Inicio 1. Perfusión y Cell Collection (Figura 1) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> Figura 1:. Liver perfusión Después de la anestesia del ratón, el tracto digestivo se mueve lateralmente hacia la izquierda del abdomen con el fin de hacer que la vena portal (PV) accesible. El PV se canula utilizando una tasa de flujo lento (1-3 ml / min) de solución de EGTA / HBSS y el Veina cava inferior (IVC) es inmediatamente roto para evitar cualquier exceso de presión dentro del hígado. Dentro de la primera minutos de perfusión, el caudal se incrementa gradualmente a 7 ml / min. La solución de colagenasa se perfunde después a 10 ml / min hasta que se logra su digestión completa. <ol><li> Prepare recién todos los reactivos descritos en la tabla de material. </li><li> Calentar el EGTA (etilenglicol Tetra-ácido acético) / HBSS (solución salina equilibrada de Hank) solución (50 ml por ratón) y la solución de colagenasa (100 ml por ratón) durante 30 min a 40 ° C. </li><li> Enjuague el tubo flexible de la bomba primero con etanol al 70%. Verter 40 ml de solución de EGTA / HBSS en un tubo de centrífuga sumergida en el baño de agua y enjuagar el tubo flexible de la bomba con la solución de EGTA / HBSS precalentado. </li><li> Realizar la anestesia terminal usando un barbitúrico para producir de forma fiable la inconsciencia antes de la depresión respiratoria y la muerte. Inyectar fenobarbital a 1 mg / kg, ip en un ratón CD1 hembra o macho (35-45 g). Confirme la anestesia mediante pellizcos dedo del pie. </li><li> Afeitado pelos abdominales y esterilizar la superficie abdominal con solución de etanol al 70%. </li><li> Corte a través de la cavidad abdominal y exponer la vena porta y la vena cava inferior moviendo el intestino lateralmente a la izquierda del abdomen. </li><li> Estrellat la bomba a una velocidad de 1-3 ml / min con solución de EGTA / HBSS y canular la vena portal usando una aguja de 23 g mariposa (alas cortadas). Abrazadera de la sección de la vena portal canulado con la aguja 23 G y, a continuación voltear el fórceps serrefine en la superficie del abdomen del ratón abierto. El hígado debe pálido rápidamente dentro de los primeros 30 segundos de la perfusión EGTA Solución / HBSS. </li><li> Rápidamente incisión en la parte inferior de la vena cava inferior para evitar edificio exceso de presión en el hígado, y luego aumentar la velocidad de flujo gradualmente a 7 ​​ml / min, sobre la primera minutos de perfusión. El animal muere debido a la hemorragia secundaria a la vena cava punción venosa. </li><li> Cuando menos de 5 ml de solución EGTA / HBSS es permanecer en el tubo de centrífuga, llenarlo con colagenasa solución (40-50 ml). Aumentar la tasa de flujo gradualmente a 10 ml / min, durante 30 s. </li><li> Hacer que el hígado se inflame mediante la aplicación de presión a la vena cava inferior, usando pinzas, para los intervalos de 5-10 seg. This se puede hacer periódicamente (5-10 veces durante la digestión). Este paso va a mejorar la disociación de células del hígado y reducir el tiempo de perfusión con colagenasa. </li><li> Cuando menos de 10 ml de solución de colagenasa se mantiene dentro del tubo de centrífuga, se vierte 40-50 ml de la solución de pre-calentado colagenasa en el tubo de centrífuga. </li><li> Después de 10-15 min de perfusión y unos 70-80 ml de solución de colagenasa perfundidos, aplicar una pequeña presión sobre la superficie del hígado con un fórceps. Una impresión de la presión indica que las células hepáticas se disocian. </li><li> Retire el hígado de la cavidad abdominal como una sola pieza y colocarla en un tubo de centrífuga que contiene 20 a 30 ml de células Kupffer Aislamiento medio. Mantenga las células del hígado en hielo oa 4 ° C durante un período máximo de 3 horas para no afectar la viabilidad celular hepática. </li><li> Repita el procedimiento de perfusión en varios animales si es necesario, manteniendo el hígado perfundido en hielo. Piscina dos y cincuenta y nueve hígados para la purificación y proceder con la etapa 3. </li></ol> 2. Preparación del gradiente de densidad para la centrifugación (Figura 2) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> Figura 2:. Preparación del gradiente de densidad Todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones estériles. El SIP se prepara mezclando 15,3 ml de solución de partículas de sílice revestido con 1,7 ml de 10 x PBS. A 5 ml de SIP se mezclan con 15 ml de PBS para hacer una solución SIP 20 ml de 25%. 10 ml de SIP se mezclan con 10 ml de PBS para hacer una solución SIP 20 ml de 50%. Un tubo de centrífuga que contiene la solución de 50% SIP (20 ml) se inclina y la solución SIP 25% (20 ml) se añade lentamente usando una pipeta serológica de 25 ml. <ol><li> Continúe con los pasos siguientes (artículo 2., 3. y 5.) bajo condiciones estériles y mantener las células en hielo oa 4 ° C. Prepare el SIP (Solución de partículas de sílice recubiertas isotónica) mezclando 15,3 ml de solución de partículas de sílice revestido con 1,7 ml de 10 x PBS. </li&gt; <li> Para hacer 20 ml de solución de SIP 25%, mezclar 5 ml de SIP con 15 ml de PBS. Para hacer 20 ml de solución de SIP 50%, mezclar 10 ml de SIP con 10 ml de PBS. </li><li> Llene un tubo de centrífuga con 20 ml de la solución de SIP 50%. Incline el tubo de centrífuga en un ángulo próximo a 90 ° y se añade lentamente la solución SIP 25% (20 ml) en la pared lateral del tubo utilizando una pipeta serológica de 25 ml, sin tocar la superficie de la capa de SIP 50%. Cuando la adición de la solución SIP 25%, reducir progresivamente el ángulo del tubo. Mantenga el gradiente de densidad en hielo hasta su uso. </li></ol> 3. Kupffer Purificación celular (Figura 3) <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> Figura 3:. La purificación de las células de Kupffer por centrifugación en gradiente de densidad y la adhesión celular Todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones estériles. (A) Después de la rotura de la cápsula de Glisson, las células del hígado se filtran a través de un 100 micras colador. La suspensión se centrifugó a 50 x g para descartar hepatocitos (pellets) y recoger la fracción de células no parenquimatosas (sobrenadante). Este paso se repite 3 veces. Las células no parenquimatosas se añaden en la parte superior de un gradiente discontinuo isotónica y se centrifugaron a 800 xg durante 15 min. Las células de Kupffer recogidos de la almohadilla SIP 25% se purifican adicionalmente por la selección de la adhesión celular. (B) Las células se sembraron en placa de 24 pocillos y se incubaron a 37 ° C y 5% de CO2 durante 30 min. Las células no adherentes se lavaron una vez con 500 l de HBSS. Las células de Kupffer muestran su morfología adherente 4 hr después de la siembra, cuando -CNTs f se pueden añadir a las células. La barra de escala representa 25 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol><li> Poner un hígado perfundido en un plato de Petri con 15 ml de aislamiento de células Kupffer Medium. Romper la cápsula de Glisson (membrana del hígado) usando tijeras y liberar todas las células hepáticas en el medio de aislamiento de células Kupffer. Filtrar la solución a través de un filtro de células de 100 micras que se recoge en un tubo de centrífuga. Repita el procedimiento de perfusión de hígados perfundidos adicionales y poner en común las células en el mismo tubo de centrífuga (15 ml de un ratón, hasta 45 ml de tres ratones). </li><li> Centrifugar la suspensión celular a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Las células del parénquima (hepatocitos) estarán en el sedimento y las células no parenquimatosas (incluyendo células de Kupffer) estarán en el sobrenadante. </li><li> Recoger el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio y centrifugar a 50 xg durante 2 min cada una. Repita este paso tres veces más. </li><li> Centrifugar a 1350 xg durante 15 min para sedimentar las células no parenquimatosas. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de Kupffer aislamiento de células Medio. </li><li> Añadir la solución de células no parenquimatosas en el gradiente isotónico discontinua 25/50% como se describe en 2.3. Centavorifuge a 850 xg durante 15 min sin aceleración o descanso. </li><li> Localizar la fracción de células Kupffer enriquecido que aparece turbia dentro de la fracción SIP 25% cerca de la interfaz de SIP 25/50% (Figura 3). Usando una pipeta serológica de 10 ml, aspirado sobre 12 ml de la fracción de células Kupffer enriquecido. La transferencia de células en un tubo de centrífuga que contiene 35 a 40 ml de Kupffer aislamiento de células Medio. Mezclar suavemente y centrifugar a 1350 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar las células. </li><li> Deseche las células sobrenadante y resuspender en 5-10 ml de pre-calentado célula Kupffer medio de cultivo. Recuento de células (hemocitómetro) y medir la viabilidad mediante la tinción de azul de tripano. </li><li> Placa de las células no parenquimatosas purificadas en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 x 10 5 células / pocillo. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 (Figura 3). Después de 30 minutos, retire con cuidado el medio, lavar con pre-calentado solución salina equilibrada de Hank (HBSS) una vez que vuelva a colocarcon 500 l de fresco y pre-calentado Kupffer Cell Culture Medium (por pocillo). </li><li> Deja células de Kupffer durante al menos 4 horas a 37 ° C y 5% de CO 2 antes del tratamiento con nanopartículas, para permitir que adquieran su morfología adherente. </li></ol> 4. Caracterización <ol><li> Las células de Kupffer Pureza <ol><li> Preparar fresca solución de PBS / BSA utilizado para mantener la viabilidad de células de Kupffer. Lavar las células una vez con 500 l de solución de PBS / BSA. Retire la solución de PBS / BSA y separar las células de Kupffer en 500 l de solución de PBS / BSA fresca utilizando raspado suave. Cuando las células se sembraron en placas de 24 pocillos, acortar los extremos de las cuchillas raspadoras con tijeras para hacer más fácil el desprendimiento de proceder. Transferencia de células en tubos de citometría de flujo. </li><li> Contar las células de Kupffer utilizando un hemocitómetro y centrifugar 1 x 10 5 células a 1350 x g. Resuspender las células de Kupffer en 30 l de F4 / 80 anticuerpo (puro). Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Mantener las células no teñidas (no incubadas con el anticuerpo) en hielo. </li><li> Añadir 2 ml de solución de PBS / BSA en células teñidas, se centrifuga a 1350 g durante 5 min y descartar el sobrenadante resultante. Resuspender las células teñidas en 200 l de PBS / BSA. </li><li> Para el análisis de citometría de flujo, puerta 10000 sin teñir las células de Kupffer de acuerdo a su tamaño (dispersión hacia adelante) y granularidad (dispersión lateral). Analizar la fluorescencia de las células cerradas en FL-1 canal. </li><li> Repita el procedimiento para las células de Kupffer manchadas manteniendo los mismos ajustes utilizados para la citometría de flujo análisis de las células de Kupffer sin teñir. Seleccionar y cuantificar la fluorescencia de las células teñidas para evaluar la pureza de las células de Kupffer. </li></ol></li><li> Kupffer célula fagocítica Actividad <ol><li> Reemplace los medios con un 0,5% (v / v) perlas fluorescentes en Kupffer Cultivo Celular Medio e incubar durante 4 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Con el fin de eliminar las perlas no internalizadas, células de Kupffer de centrífuga a 1350 xg, discard las células sobrenadante y resuspender en 500 l de PBS Solución / BSA. Repita este paso 2 veces más. </li><li> Raspe células de Kupffer en 500 l de células de la solución y de transferencia de PBS / BSA en un tubo de citometría de flujo. </li><li> Centrifugar las células de Kupffer en 1350 xg, descartan las células sobrenadante y resuspender en 200 l de PBS Solución / BSA. </li><li> Para el análisis de citometría de flujo, puerta 10000 sin teñir las células de Kupffer de acuerdo a su tamaño (dispersión hacia adelante) y granularidad (dispersión lateral). Analizar la fluorescencia de las células cerradas en FL-2 canal. </li></ol></li></ol> 5. La incubación de carbono funcionalizados químicamente nanotubos (f -CNTs) <ol><li> Preparar una dispersión de -CNTs f (1 mg / ml) en agua por tratamiento con ultrasonidos durante 15 minutos antes de su uso. -CNTs F se preparan en la casa 22. </li><li> Preparar 2x CNT f- concentrados dispersión en Kupffer Cell Culture Medium. CNT f- sonicado dispersas en un medio para2 min antes de proceder con el paso 5.3). </li><li> Para cada bien, sustituya 250 l de edad media con 250 l de 2x dispersión -CNTs f. Pozos sin tratar (250 l de medio acondicionado + 250 l de fresco Kupffer Cell Culture Medium) y los pocillos tratados con 10% de DMSO se utilizan como control negativo y positivo, respectivamente. </li><li> Se incuban las células de Kupffer a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 o 72 horas. </li></ol> 6. Evaluación de la toxicidad de -CNTs f en células de Kupffer por la lactato deshidrogenasa (LDH) Ensayo Modificado <ol><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 200 l (por pocillo de placa de 24 pocillos) de tampón de lisis y se incuba a 37 ° C durante 30 min-1 hr. </li><li> Después de llevar a cabo el pipeteo vigoroso, recoja lisaron las células de Kupffer en tubos de microcentrífuga y se centrifuga a 40.000 xg durante 10 min para sedimentar -CNTs f que fueron tomados por las células y los restos celulares. </li><li> Reunir los sobrenadantes (ƒ-CNT gratuita) entubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C o vaya al paso 6.5). </li><li> Transferencia de 50 l en una placa de 96 pocillos y añadir un volumen igual de la solución de mezcla de sustrato (kit LDH) a cada pocillo. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 15 min antes de añadir 50 l de la solución de parada (kit LDH). Añadir triplicados de pocillos de blanco que contienen 50 l de tampón de lisis, 50 l de solución de mezcla de sustrato y 50 l de solución de parada. </li><li> Leer la absorbancia a 490 nm en un lector de microplacas y utilizar la siguiente fórmula para calcular el (%) la viabilidad celular. </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los siguientes pasos son fundamentales para lograr un alto rendimiento y una alta viabilidad de las células de Kupffer. Las condiciones asépticas deben utilizarse para limitar el riesgo de contaminación bacteriana y fúngica. Todos los instrumentos deben ser esterilizados antes de su uso. Los reactivos deben prepararse justo antes de llevar a cabo el procedimiento de aislamiento. La elección de la colagenasa IV, con baja actividad tríptico, es crucial. Los diferentes lotes del mismo proveedor...

El campo de la investigación nanotoxicología pretende caracterizar el efecto biológico de las nanopartículas. Los estudios toxicológicos sobre la base de las investigaciones in vivo siguen siendo los métodos más precisos. Sin embargo, su uso está limitado por sus requisitos de coste, tiempo y trabajo 1. Como los ensayos de alternativas, in vitro se han utilizado debido a su simplicidad y la posibilidad de desarrollar de alto rendimiento en plataformas de pruebas in vitro 2 - así se amplía el número de condiciones ensayadas. La mayoría de los estudios nanotoxicological se realizan usando ensayos in vitro con líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, hay preocupaciones con respecto a la extrapolación de estos resultados experimentales in vivo a los efectos toxicológicos 3. De hecho, las propiedades de las líneas celulares inmortalizadas pueden ser significativamente diferentes de los tejidos que se derivan de, por ejemplo, la transformación genética 4, el deterioro de las características morfológicas principales5, la pérdida de la polaridad celular 6 y alteraciones funcionales tales como la regulación de los mediadores de la inflamación 7. Las células de Kupffer son la población de macrófagos más abundante en el cuerpo y están directamente en contacto con la sangre por el forro de la pared de los sinusoides hepáticos. Como parte del sistema retículo-endotelial (RES), estos macrófagos son responsables de la captura de las nanopartículas de circulación y por lo tanto, constituyen un modelo muy adecuado para estudiar la toxicidad de nanopartículas. In vivo 8 e in vitro 9 estudios de respuestas inflamatorias asociadas con las células de Kupffer expuestos a nanopartículas se han publicado en otros lugares. Las células de Kupffer también se han involucrado en la patogénesis de las enfermedades hepáticas como la enfermedad alcohólica del hígado 10, fibrosis hepática o hepatitis viral 11 12. Se informó de que las células de Kupffer aisladas proporcionan información útil para describir los mecanismos celulares involved en la interrupción del hígado 13,14. Varios métodos han sido reportados para aislar y purificar las células de Kupffer. Aislamiento de la célula puede resultar de la mecánica o enzimática de disociación 15. Digestión con colagenasa muestra la ventaja de conservar la integridad funcional de las células de Kupffer, mientras que lleva a rendimiento celular de alta Kupffer 16. Muchos enfoques experimentales, que varían en complejidad y los costes, se han utilizado para separar las células de Kupffer de otras poblaciones de células de hígado. Por ejemplo, la pureza de células Kupffer se puede lograr por inmunoafinidad 17, electroforesis de flujo 18, 16 adhesión selectiva o mediante técnicas centrífugas 16, que seleccionan las células en función de su tamaño y densidad. Una combinación de estos métodos puede ser elegido para aumentar la pureza de la población 16. No hay consenso sobre el método ideal para el aislamiento de células de Kupffer, ya que depende principalmente de la aplicación y equipamiento disponiblest. Sin embargo, en el caso de los ensayos de toxicidad de nanopartículas, la simplicidad y de alto rendimiento de la técnica asociada con la conservación funcional de las células de Kupffer parecían ser más adecuado para esta aplicación. El método de aislamiento de células Kupffer informó aquí se basa en un método de perfusión de 2 pasos, seguido de purificación en gradiente de densidad. El método se modificó a partir del protocolo original desarrollado por Smedsrød et al. 16 diseñado para el aislamiento de células de hígado de rata. La mayoría de los estudios informaron y describen el aislamiento de las células de Kupffer de hígado de rata. En este documento, se describe un método para aislar células de Kupffer de hígado de ratón, con un alto rendimiento y pureza. El uso de ratones reduce el coste experimento y permite el procesamiento de varios hígados para obtener grandes cantidades de células de Kupffer para las pruebas de toxicidad de las nanopartículas. En el siguiente protocolo, las células de Kupffer se incubaron con nanotubos de carbono funcionalizados (f </em&gt; -CNTs). Las propiedades físico-químicas únicas de CNTs - es decir, de alta relación de longitud a diámetro y gran área de superficie, han hecho CNTs candidatos interesantes como vectores para fines de terapia y el diagnóstico. Sin embargo, han surgido preocupaciones con respecto a la toxicidad de los nanotubos de carbono 19, y el desarrollo de nuevos ensayos in vitro tiene por objeto aumentar la comprensión del efecto biológico CNT. Toxicidad en células de Kupffer se asocia con una falta de integridad estructural de la membrana celular. Esto se mide por la pérdida de la enzima LDH citoplásmica de la célula en el sobrenadante. El principio de este método, por lo tanto, es eliminar cualquier LDH liberada y medir lo que queda en las células 20. Esto se realiza con preferencia a la medición de la LDH liberada en el sobrenadante debido a la presencia de nanotubos de carbono en el sobrenadante interfiere con el ensayo 21. Proponemos el uso de este simple y rentable metho aislamiento de células Kupfferd aislar alto número de células de Kupffer funcionales. Esto permite el cribado de toxicidad de una gama de nanopartículas, en un modelo de macrófagos primaria pertinente.

<table><tbody><tr><td>Euthatal (pentobarbital sódico)</td><td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1 ratones Charles</td><td>River&nbsp; &nbsp;</td><td>-</td><td>El peso del ratón debe variar de 35 a 45 g. Aconsejamos el uso de ratones machos CD1 ya que su peso aumenta rápidamente (por ejemplo un ratón macho CD1 de 7 semanas de edad supera los 35 g de peso). También se aconseja ponerse en contacto con el proveedor de animales con antelación para organizar la entrega de los animales mayores. Alternativamente, los animales pueden estar en casa para alcanzar el peso deseado.</td></tr><tr><td>HBSS (Ca2+ y Mg2+ sin , con bicarbonato)&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp; &nbsp;</td><td>14175-053</td><td>HBSS debe ser &nbsp; Ca2+ gratis.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sal tetrasódica de ácido etilenglicol tetraacético (EGTA);</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td>E8145&nbsp; &nbsp;</td><td>También se puede utilizar EDTA, pero EGTA tiene la ventaja de quelar Ca2+ selectivamente.</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp; &nbsp;</td><td>15630-056 y nbsp;</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo IV&nbsp;</td><td>Worthington&nbsp;</td><td>CSL-4&nbsp;</td><td>Se recomienda probar diferentes lotes de colagenasa o al menos mencionar al proveedor que el producto debe ser adecuado para el aislamiento de células hepáticas&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM&nbsp; Glucosa baja</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td>D5523&nbsp;</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI (con piruvato de sodio y Glutamax)&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp; &nbsp;</td><td>12633-012&nbsp;</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Penicilina/Steptomycin&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp; &nbsp;</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino&nbsp;</td><td>Primer enlace&nbsp; &nbsp;</td><td>60-00-850&nbsp;</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripán&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8154&nbsp;</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de partículas de sílice recubierta (Percoll)</td><td>GE Healtcare&nbsp; &nbsp;</td><td>17-0891-02&nbsp;</td><td>Percoll&reg; es muy estable y se puede conservar durante varios años&nbsp;</td></tr><tr><td>1x solución salina tamponada con fosfato &nbsp; &nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp; &nbsp;</td><td>10010-023</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>10x solución salina tamponada con fosfato &nbsp; &nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp; &nbsp;</td><td>70011-036</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido&nbsp;</td><td>Pescador&nbsp;</td><td>D/4120/PB08&nbsp;</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de LDH (CytoTox 96)&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G1781&nbsp;</td><td>Manténgase protegido de la luz&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM rojo fenol libre</td><td>de Life Technologies&nbsp; &nbsp;</td><td>31053-028</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo F4/80 (Alexa 488)</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497A488</td><td>No diluir, usado solo para la citometría de flujo</td></tr><tr><td>Perlas fluorescentes</td><td>Sigma</td><td>L2778</td><td>Perlas de látex, poliestireno modificado con aminas, rojo fluorescente. 1 ml</td></tr><tr><td>Nombre de la empresa de materiales</td><td>&nbsp;</td><td>Número de catálogo&nbsp;</td><td>Comentarios/Descripción&nbsp;</td></tr><tr><td>Juego de extracción de sangre de mariposa (tubo de 23 G/305 mm de longitud)&nbsp; &nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>367288</tr><tr><td>Filtros de jeringa (0,22 &mu; m Borde Azul)&nbsp;</td><td>Minisart&nbsp;</td><td>16534-K&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (tapa azul de 50 ml) &nbsp;</td><td>BD Biociencias, Halcón &nbsp;</td><td>35 2070&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (90 x 15 mm)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>BSN 101VR20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; Filtro de células M&nbsp; &nbsp;</td><td>BD&nbsp; &nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica&nbsp;</td><td>Watson Marlow&nbsp;</td><td>SciQ 300&nbsp; &nbsp;</td><td>Enjuague los tubos antes y después de cada uso con PBS estéril y etanol al 70%.</td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Corning&nbsp; &nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Corning&nbsp; &nbsp;</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5810R Lector de</td><td></td></tr><tr><td>placas</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Pinza Omega</td><td></td></tr><tr><td>Serrefine</td><td>Hammacher GmbH&nbsp;</td><td>N.º de art. HSE 004-35 / N.º de cat. 221-0051</td><td>Las pinzas de serrefine permiten sujetar el vaso canulado con la aguja de 23 G sin necesidad de sujetar las pinzas durante el procedimiento de perfusión. Dirección URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de citometría de flujo</td><td>BD Biosciences, Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>352052</tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (1,5 ml)</td><td>Elkay</td><td>&nbsp; 000-MICR-150</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>353086</td><td>Corte las extremidades de la hoja con un par de tijeras para raspar células en placas de 24 pocillos.</td></tr><tr><td>Nombre de la empresa de reactivos</td><td>&nbsp;</td><td>Número de catálogo&nbsp;</td><td>Comentarios/Descripción&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Solución EGTA (ácido tetraacético de etilenglicol)/HBSS (solución salina equilibrada de Hank)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>HBSS que contiene 0,5 mM de EGTA y 25 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7.4. Prepare 50 ml para cada hígado para perfundir. &nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de colagenasa&nbsp;</td><td></td><td></td><td>DMEM bajo en glucosa que contiene colagenasa tipo IV a 100 UI/ml, 15 mM HEPES y 1% de penicllina/estreptamicina (v/v). Ajuste el pH a 7.4. Prepare 100 ml para cada hígado para perfundir. Después de agregar la colagenasa, se recomienda calentar la solución durante 30 minutos antes de usarla. Esto permite que la actividad de la colagenasa sea óptima.</td></tr><tr><td>Medio de aislamiento celular Kupffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI contiene, 1% de aminoácidos no esenciales (v/v), 1% glutamax&reg; (v/v) y 1% de penicllina/estreptomicina (v/v). Prepare al menos 100 ml para 1-3 hígados. &nbsp;</td></tr><tr><td>Medio de cultivo celular de Kupffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI que contiene 10% Suero Fetal Bovino, 1% Aminoácidos No Esenciales (v/v), 1% Glutamax&reg; (v/v) y 1% de penicllin/estreptamicina (v/v). Prepare al menos 100 ml para 1-3 hígados. &nbsp;</td></tr><tr><td>SIP (solución de partículas de sílice recubiertas de isotónico)</td><td></td><td></td><td>Mezcle 1,7 ml de solución salina tamponada con fosfato 10x con 15,3 ml de Percoll para obtener 17 ml de SIP.</td></tr><tr><td>Solución SIP del 25%&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mezcle 5 ml de SIP con 15 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Solución SIP al 50%&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mezcle 10 ml de SIP con 10 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de lisis <td>DMEM medios con solución</td></tr><tr><td></td><td></td> Triton X-100<td>PBS/BSA</td> al 0,9 % <td>Prepare solución salina tamponada con fosfato fresco pH 7,4 con albúmina sérica bovina al 1 %.</td></tr></tbody></table>

kupffer aislamiento de células de nanopartículas de pruebas de toxicidad

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

La gran mayoría de los estudios in vitro nanotoxicological han utilizado líneas celulares inmortalizadas por su practicidad. Sin embargo, los resultados de las pruebas de toxicidad de nanopartículas en líneas celulares inmortalizadas o células primarias han mostrado discrepancias, destacando la necesidad de extender el uso de células primarias de ensayos in vitro. Este protocolo describe el aislamiento de los macrófagos del hígado del ratón, las células de Kupffer con nombre, y su uso para estudiar la toxicidad de nanopartículas. Las células de Kupffer son la población de macrófagos más abundante en el cuerpo y constituyen parte del sistema retículo-endotelial (RES), responsable de la captura de las nanopartículas de circulación. El método de aislamiento de células Kupffer informó aquí se basa en un método de perfusión de 2 pasos, seguido de purificación en gradiente de densidad. El método, basado en la digestión de colagenasa y centrifugación de densidad, es una adaptación del protocolo original desarrollada por Smedsrød et al. diseñado para la rata isolatio células hepáticasn y proporciona un alto rendimiento (hasta 14 x 10 6 células por ratón) y alta pureza (&gt; 95%) de las células de Kupffer. Este método de aislamiento no requiere equipo sofisticado o caro y por lo tanto representa un compromiso ideal entre la complejidad y el rendimiento celular. El uso de ratones más pesados ​​(35-45 g) mejora el rendimiento del método de aislamiento sino que también facilita notablemente el procedimiento de canulación de la vena porta. La toxicidad de los nanotubos de carbono funcionalizados f -CNTs se midió en este modelo por el ensayo de LDH modificado. Este método evalúa la viabilidad celular mediante la medición de la falta de integridad estructural de la membrana de las células de Kupffer después de la incubación con -CNTs f. Inducida por -CNTs f toxicidad puede medirse constantemente utilizando este ensayo, destacando que las células de Kupffer aisladas son útiles para las pruebas de toxicidad de las nanopartículas. La comprensión global de nanotoxicología podría beneficiarse de este tipo de modelos, por lo que la selección de nanopartículas para la traducción clínica más eficiente.

El número de células parenquimatosas no purificadas era consistente y varió entre 8 y 14 x 10 6 células por ratón (se realizaron 17 aislamientos). Cada aislamiento ratón era suficiente a la placa 16 a 28 pozos. La viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano demostró la viabilidad celular ~ 95%. Las células de Kupffer mostraron una forma redonda dentro de 30 min de incubación a 37 ° C, en relación con su morfología adherente incompletos (Figura 4A). A las 4 horas de incubación y de...

Los macrófagos hepáticos, llamados células de Kupffer, son responsables de la captura de las nanopartículas circulantes. Describimos aquí un método, de alta pureza y rendimiento celular, para el aislamiento de células de Kupffer. El ensayo de LDH modificado se utiliza aquí para medir la toxicidad inducida por los nanotubos de carbono en las células de Kupffer.

Kupffer aislamiento de células de nanopartículas de Pruebas de Toxicidad

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

El objetivo general del siguiente experimento es aislar y purificar un gran número de células cup para estudiar la toxicidad de nanopartículas. Esto se logra perfundiendo hígados de ratón con una solución de H-B-S-S-E-G-T-A y una solución de colagenasa para digerir suavemente el tejido hepático. A continuación, las células hepáticas se purifican mediante centrifugación por densidad y adhesión selectiva para obtener un cultivo de células cup purificadas.Luego se realiza un análisis de citometría de flujo para confirmar la pureza y las propiedades ácidas F de las células cup. Se obtienen resultados que muestran que la toxicidad de los nanotubos de carbono funcionalizados puede medirse en células cup. Según el modelo modificado de L-D-H-S-A, este sistema puede aplicarse a la evaluación de la toxicidad de nanopartículas.El método que pretendemos mostrarle hoy puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nanotoxicología, como evaluar la toxicidad de nuevos vehículos de fármacos desarrollados recientemente; esto es muy importante ya que la mayoría de las líneas celulares inmortalizadas utilizadas presentan propiedades significativamente diferentes a los tejidos de los cuales se derivaron. Una demostración visual de este método es fundamental. Si el método se realiza con éxito, dará como resultado la obtención de un alto rendimiento y pureza de células ke, que luego podrán utilizarse como modelo para cribar una variedad de nanopartículas en cuanto a su toxicidad.Después de preparar recién todos los reactivos enumerados en la tabla de materiales y reactivos que se encuentra con el protocolo de texto adjunto, caliente la solución E-G-T-A-H-B-S-S y la solución de colagenasa a 40 grados Celsius durante 30 minutos, use etanol al 70 % para enjuagar el tubo flexible de la bomba. Luego vierta 40 mililitros de solución E-G-T-A-H-B-S-S en un tubo de centrífuga sumergido en el baño de agua y use la solución E-G-T-A-H-B-S-S precalentada para enjuagar el tubo flexible de la bomba. Después de sacrificar un ratón CD uno, según el protocolo de texto, afeite los pelos abdominales y use etanol al 70 % para desinfectar la superficie abdominal.Confirme la anestesia mediante la compresión del dedo del pie. Corte a través de la cavidad abdominal y exponga la vena porta y la vena cava inferior moviendo el intestino lateralmente hacia la izquierda del abdomen. Inicie la bomba a una velocidad de uno a tres mililitros por minuto con solución E-G-T-A-H-B-S-S y, con una aguja tipo mariposa de calibre 23, canule la vena porta, sujete con pinza la sección canulada de la vena porta y luego gire las pinzas de fuerza sinusoidal sobre la superficie del abdomen abierto del ratón.El hígado debe ponerse pálido dentro de los primeros 30 segundos de la perfusión; haga un corte rápido en la parte inferior de la vena cava inferior para evitar la acumulación excesiva de presión en el hígado y aumente gradualmente la velocidad de flujo hasta siete mililitros por minuto durante el primer minuto de perfusión. Cuando queden menos de cinco mililitros de solución E-G-T-A-H-B-S-S en el tubo de centrífuga, agregue de 40 a 50 mililitros de solución de colagenasa y luego aumente gradualmente la velocidad de flujo hasta 10 mililitros por minuto en un lapso de 30 segundos.Haga que el hígado se hinche utilizando pinzas para aplicar presión periódicamente sobre la vena cava inferior durante intervalos de 10 a 32 segundos. Esto mejorará la disociación celular y reducirá el tiempo de perfusión con colagenasa. Cuando queden menos de 10 mililitros de solución de colagenasa dentro del tubo de centrífuga, agregue 40 a 50 mililitros adicionales de solución de colagenasa precalentada al tubo.Luego, una vez que se hayan perfundido de 70 a 80 mililitros, use pinzas para aplicar una ligera presión sobre la superficie. Una marca de depresión indica que las células hepáticas están disociadas. Retire el hígado de la cavidad abdominal en una sola pieza y colóquelo en un tubo de centrífuga que contenga de 20 a 30 mililitros de medio para el aislamiento de células.Mantenga las células hepáticas en hielo durante hasta tres horas y agrupe hasta tres hígados para la purificación para purificar la taza para células. Coloque un hígado perfundido en una placa de Petri con 15 mililitros de taza para aislamiento celular, medio con tijeras o pinzas. Rupture la cápsula brillante y libere todas las células hepáticas en el medio.Filtre la solución a través de un tamiz celular de 100 micrómetros en un tubo de centrífuga. Luego, centrifugue la suspensión celular a 50 GS a cuatro grados Celsius durante dos minutos. Las células parenquimatosas estarán en el sedimento y las células no parenquimatosas estarán en el sobrenadante.Recoger el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio y centrifugar a 50 gs durante dos minutos. Repetir para un total de cuatro transferencias y centrifugaciones. A continuación, centrifugar.El sobrenadante a 1.350 ×g durante 15 minutos. Para obtener el sedimento de células no parenquimatosas, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 10 mililitros de medio de aislamiento de células CUP, agregue la solución de células no parenquimatosas al gradiente isotónico discontinuo 25-50% preparado previamente según el protocolo descrito en el texto y centrifugue a 850 ×g durante 15 minutos sin aceleración ni frenado. Utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros, aspire aproximadamente 12 mililitros de la fracción enriquecida en células CUP que aparece turbia dentro de la fracción 25% SIP, cerca de la interfase 25-50% SIP.Transfiera las células a un tubo de centrífuga que contenga 35 a 40 mililitros de medio para el aislamiento de células y mezcle suavemente. Luego, centrifugue a 1.350 ×g y 4 grados Celsius para obtener el sedimento celular. Descarte el sobrenadante y use de 5 a 10 mililitros de medio precalentado para resuspender las células con un hemocitómetro. Cuente las células y utilice la tinción con azul de tripano para medir la viabilidad. Plaque las células no parenquimatosas purificadas en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 × 10⁵ células por pocillo.Incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Luego, retire suavemente el medio. Use HBSS precalentado para lavar las células y reemplácelo con 500 microlitros por pocillo de medio fresco precalentado para cultivo celular.Devuelva las células a 37 grados Celsius durante al menos cuatro horas para permitir que se adhieran antes del tratamiento con partículas de nanopartículas. Después de caracterizar la pureza y la actividad fagocítica de las células C e incubarlas con nanotubos de carbono funcionalizados o FCTs según se describe en el protocolo del texto, deseche el sobrenadante y agregue 200 microlitros por pocillo de tampón de lisis. Incube a 37 grados Celsius durante 30 a 60 minutos, realice pipeteo vigoroso y recoja las células lisadas en tubos de microcentrífuga.Luego, centrifugue a 20.000 ×g durante 10 minutos para separar las FCN que fueron incorporadas por las células en el residuo celular. Recopile el sobrenadante en tubos de microcentrífuga y almacénelo a menos 20 grados Celsius. Alternativamente, transfiera 50 microlitros a una placa de 96 pocillos y agregue un volumen igual de la solución de mezcla de sustrato del kit de lactato deshidrogenasa.Incluya tres réplicas de pocillos en blanco que contengan 50 microlitros de tampón de lisis y 50 microlitros de solución de mezcla de sustrato. Luego, cubra la placa e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de añadir 50 microlitros de la solución de paro. Finalmente, lea la absorbancia a 490 nanómetros en un lector de microplacas y utilice la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de viabilidad celular.Esta figura muestra que el número de células no parenquimatosas purificadas oscila entre ocho y catorce veces diez elevado a seis células por ratón y trian. La tinción azul demostró una viabilidad celular de aproximadamente el 95%. Las células adheridas adoptaron una forma redonda dentro de los 30 minutos de incubación y, tras cuatro horas, las células se extendieron y comenzaron a formar agregados, como se observa aquí.Las células fueron marcadas con el anticuerpo F four 80 para demostrar la pureza celular, que fue superior al 95 % mediante citometría de flujo. Además, después de 12 horas en cultivo, el análisis de citometría mostró que el 85 % de las células eran capaces de actividad fagocítica ácida por su capacidad para incorporar microesferas fluorescentes de un micrómetro. Sin embargo, este porcentaje disminuyó a las 72 horas en cultivo, cuando solo el 40 % de las células eran fagocíticas, como se muestra aquí.Las células incubadas con nanotubos de carbono funcionalizados durante 24 y 72 horas presentaron morfologías similares en comparación con las células no tratadas. En contraste, las células incubadas con DMSO al 10 %, utilizado como control positivo, mostraron una morfología necrótica tras el análisis del ensayo modificado de LDH; las células tratadas con DMSO al 10 % durante 24 y 72 horas mostraron una alta toxicidad en comparación. Los fcts indujeron una reducción leve pero significativa en la viabilidad celular solo cuando las células estuvieron expuestas a 50 microgramos por mililitro durante 72 horas. Mediante este método, otras células madre basadas en SC y todos los tipos de nanopartículas pueden evaluarse utilizando células ke aisladas.Esto permite obtener datos confiables mientras se minimiza el uso de animales. Esperamos que esta técnica pueda ayudar a allanar el camino para que los investigadores en el campo de la psicología de la nanotecnología evalúen la seguridad de los muchos nanovehículos prometedores que se están desarrollando cada vez más.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un nuevo método para obtener los macrófagos de los cultivos primarios de células de hígado de rata se describe. Este método utiliza la proliferación de los macrófagos en la cultura, seguida de temblor en frascos de cultivo y la purificación por el apego selectivo para platos de plástico. Esta técnica proporciona de manera eficiente los macrófagos del hígado sin necesidad de equipo y habilidades complejas.

Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

Aquí se describen los protocolos para la recogida de los macrófagos alveolares murinos, que residan las células inmunes en el pulmón, y el examen de su activación en respuesta a la co-cultivo con nanopartículas polianhídrido.

Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

En este video, demostramos el aislamiento de células de Kupffer o macrófagos hepáticos del hígado de ratón. El hígado se perfunde con una solución de digestión seguida de una separación en gradiente de densidad. Las células de Kupffer adherentes aisladas se pueden utilizar para análisis posteriores.

Aislamiento y cultivo de células de Kupffer de ratón

Este video muestra el aislamiento de linfocitos, incluidas las células asesinas naturales o células NK, del tejido hepático humano para su expansión selectiva. La digestión enzimática y mecánica, seguida de la separación por gradiente de densidad, promueve el aislamiento de linfocitos, incluidas las células NK. Los linfocitos recolectados se pueden utilizar posteriormente para la expansión selectiva de las células NK.

Aislamiento de células asesinas naturales del tejido hepático para la expansión selectiva

Análisis de la interacción de nanopartículas con subpoblaciones definidas de células inmunes por citometría de flujo.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

El agua de purga de producción (PBW) se trató con nanopartículas de óxido cúprico (CuO-NPs) y se evaluó la toxicidad celular en células humanas cultivadas. El objetivo de este protocolo fue integrar la muestra ambiental nativa en un formato de cultivo celular evaluando los cambios en la toxicidad debido al tratamiento con CuO-NP.

La eliminación de oligoelementos por cúprico Óxido nanopartículas de uranio<em&gt; In Situ</em&gt; Recuperación de purga de agua y su efecto sobre la viabilidad celular

Se describe una técnica para aislar hepatocitos humanos y células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante. Los diferentes tipos de células hepáticas constituyen la base para los modelos funcionales de hígado y la ingeniería de tejidos. Este nuevo método tiene como objetivo aislar células hepáticas en un alto rendimiento y viabilidad.

Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

Microglia (células inmunitarias del cerebro), se utilizan como biosensor sustituto para determinar cómo influyen las nanopartículas en la neurotoxicidad. Describimos una serie de experimentos diseñados para analizar la respuesta de la microglía a las nanopartículas y la exposición de las neuronas hipotalámicas al sobrenadante de la microglía activada para determinar la neurotoxicidad.

Microglia como una biosensor sustituto para determinar la neurotoxicidad de nanopartículas

Este procedimiento se estableció para ser utilizado para el desarrollo de cultivos hepáticos 3D avanzados in vitro, que pueden proporcionar una evaluación más fisiológicamente relevante de los peligros genotóxicos asociados con exposiciones nanomateriales a lo largo de un régimen de dosis aguda o repetida a largo plazo.

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Este artículo tiene como objetivo proporcionar un protocolo para el aislamiento y cultivo de fibroblastos asociados al cáncer primario a partir de un modelo murino singénico de cáncer de mama triple negativo y su aplicación para el estudio preclínico de nuevas nanopartículas diseñadas para dirigirse al microambiente tumoral.

Aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer primario a partir de un modelo murino singénico de cáncer de mama para el estudio de nanopartículas dirigidas

Aquí presentamos un método no genético para generar esferoides hepáticos autólogos humanos utilizando células mononucleares aisladas de sangre periférica en estado estacionario.

Esferoides hepáticos humanos de sangre periférica para estudios de enfermedad hepática

Aprende a aislar células de Kupffer de ratón mediante perfusión hepática y centrifugación en gradiente de densidad para evaluar la toxicidad de nanopartículas. Este método permite obtener cultivos de alta pureza para estudios de nanotoxicología.

Kupffer aislamiento de células de nanopartículas de Pruebas de Toxicidad

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