Observación del Movimiento ciliar de las células epiteliales del plexo coroideo Ex Vivo

El objetivo general del siguiente experimento es analizar el movimiento de la célula epitelial del plexo coroideo, Celia ex vivo. Esto se logra extirpando primero el cerebro de un embrión o cachorro de ratón para aislar el tejido del plexo coroideo. El movimiento móvil se visualiza mediante contraste de interferencia diferencial, o microscopía DIC, y luego se obtiene una película digital de las puntas ciliares para el seguimiento manual de las posiciones de las puntas ciliares.

En última instancia, los movimientos de la punta reconstituida del Celia se categorizan y cuantifican en función de los patrones de sus movimientos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como ¿Cómo se controla la mortalidad de Celia durante el desarrollo y cómo cambia el patrón de movilidad con el tiempo? La implicación de estas técnicas fue el análisis fisiológico de la ruta y el diagnóstico.

Las enfermedades asociadas a Siria como nuestra comprensión fundamental de la cinética de Siria siguen siendo estímulos. Comience colocando un ratón neonatal enjuagado con etanol al 70%, la cabeza en liebovitz L 15 helado, medio en un plato estéril de 10 centímetros inmediatamente después de la decapitación. A continuación, utilice un par de pinzas de relojero para extraer el cuero cabelludo del cráneo.

A continuación, se corta el cráneo por una sección mediana a lo largo de la sutura longitudinal para exponer el cerebro, seguido de un corte de los nervios craneales para extraer todo el órgano. Transfiera el cerebro aislado a un nuevo plato lleno de hielo fresco, medio frío, con la cara dorsal hacia arriba y coloque el plato bajo un microscopio estereoscópico. A continuación, oriente el tejido de modo que los bulbos olfativos se coloquen a las tres en punto y agarre el cerebro suavemente con las pinzas del relojero.

Con la otra mano, use pinzas de disección fina para cortar las polas cerebrales que conectan los hemisferios cerebrales con el tronco cerebral. Pellizque el céfalo de Dion para separar aún más los hemisferios y coloque la superficie cortada hacia arriba, seguido de tirar de la lámina ápica para eliminar el plexo coroideo ventricular lateral unido al lado lateral del hipocampo. Cuando se haya aislado el plexo coroideo, transfiera el tejido a un plato con fondo de vidrio de 35 milímetros que contenga medio fresco y coloque un peso sobre el tejido para mantenerlo suavemente en su lugar dentro de los 25 a 60 minutos posteriores a la eutanasia, comience la imagen en vivo de la célula epitelial del plexo coroideo Celia, ajustando el enfoque de la lente del objetivo a ojo.

Ajuste el condensador para que el centro y el enfoque se ajusten a la iluminación Kula. A continuación, inserte los elementos ópticos adecuados en la trayectoria de la luz para que se ajusten a la óptica DIC. Mueva el prisma DIC para ajustar el contraste de las imágenes a una posición en la que se reconozca claramente la estructura de la superficie del tejido.

A continuación, cambie la trayectoria de la luz a la cámara de vídeo y aumente la potencia de la luz. Con la eliminación de los filtros de densidad neutra, ajuste un campo de observación y enfoque, configurando la resolución temporal de la cámara de video a 200 hercios y el tiempo de exposición a 0,1 milisegundos para el período de imagen deseado. A continuación, adquiera las imágenes después de que se haya obtenido la pila de imágenes, cada fotograma mostrará una imagen clara de Celia para realizar un seguimiento manual de los patrones de batido de cada cilio.

Utilice el puntero del ratón para marcar la posición de las puntas ciliares en cada fotograma. A continuación, utilizando el software adecuado, analice los datos de la trayectoria y clasifique las trayectorias en uno de los dos modos de movimiento hacia adelante y hacia atrás o rotación a ojo. Usando la fórmula, calcule la frecuencia de batido ciliar para múltiples ciclos de batido ciliar.

Al igual que otros Celia en la misma célula pueden interferir con el movimiento de cada cilio. A continuación, analizar la uniformidad angular de los ejes ciliares de batido dentro de una sola celda. Para las trayectorias de ida y vuelta, ajuste las posiciones de las puntas de Celia a una línea recta, definiendo theta como el ángulo que forma la línea con el eje X.

Para las trayectorias de rotación, ajuste las posiciones a una elipse, definiendo theta como el ángulo que forma el eje mayor de la elipse con el eje x. Finalmente, para una descripción cuantitativa de cada trayectoria, gire las trayectorias por theta definiendo sus relaciones de aspecto como las relaciones entre los anchos de su distribución a lo largo de los ejes x e y. En este primer clip, se muestra una vista superior de las células epiteliales del plexo coroideo con Celia de una cría de ratón del segundo día postnatal fotografiada por microscopía de video de alta velocidad, la superficie irregular del tejido del plexo coroideo lo hace visible tanto en los planos enfocados como desenfocados.

En este segundo clip, se muestra una vista ampliada del área en caja de la película anterior, lo que permite una observación más cercana de los movimientos de rotación y de ida y vuelta exhibidos por el cilio individual. Aquí, se presentan las trayectorias de los movimientos representativos de la punta ciliar reconstituidos a partir de registros de película a lo largo de múltiples ciclos, con los cursos de tiempo de las coordenadas x e y de las posiciones de la punta trazadas en los gráficos. Para demostrar un cambio de fase entre las dos coordenadas en estos gráficos, las coordenadas x e y se superpusieron y se superpusieron .

Si bien los CLIA móviles se reconocen fácilmente por imágenes en vivo, no es fácil identificar los CLIA no móviles por este método. Para superar esta dificultad, la microscopía electrónica de barrido puede ser indispensable para obtener imágenes completas de la clia, independientemente de su motilidad. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar la disección con la suficiente prontitud para que se conserve la frescura de la muestra y se mantenga la motilidad de Siria.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras de tejido con cereales virales, así como cómo monitorear y cuantificar la mortalidad del CX vivo.