Name: Observación del Movimiento ciliar de las células epiteliales del plexo coroideo Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende a analizar el movimiento ciliar de células epiteliales del plexo coroideo ex vivo mediante microscopía DIC en ratones. Este método permite categorizar y cuantificar patrones de movimiento para estudiar el control del movimiento ciliar durante el desarrollo.

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Este trabajo fue apoyado por un Proyecto para Universidades Privadas: subvención de fondos de contrapartida del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón (T.I.) y Subvenciones de Ayuda para la Investigación Científica (C) de MEXT (S.T. y K.N).

Los protocolos y uso de animales experimentales fueron aprobados por los comités de cuidado animal y el uso institucional de la Universidad de Yamanashi y la Universidad de Waseda. Cuidado de los animales se realizó de acuerdo con las directrices institucionales. 1. Preparación CPEC <ol><li> Preparar los siguientes aparatos y materiales: un microscopio estéreo, preferiblemente capaz de transmitir la iluminación desde la parte inferior; un par de pinzas de relojero (Dumont # 3 o # 4), llama-esterilizado, tijeras de funcionamiento rectas, llama-esterilizado; dos platos de 10 cm de plástico estériles que contienen 20 ml de hielo frío medio Leibovitz L-15; Platos con fondo de cristal de 35 mm que contienen 2 ml RT Leibovitz medio L-15; un vaso de precipitados de 100 ml que contiene 70% de etanol; cachorros neonatales ratón. </li><li> Brevemente sumerja un ratón neonatal en etanol al 70% y la eutanasia de forma rápida por decapitación con las tijeras que operan. </li><li> Coloque la cabeza inmediatamente helada Leibovitz L-15 en el medio estéril 10 cm dish. </li><li> Retire la piel de los bóveda craneal utilizando el par de pinzas relojero, cortar el cráneo para exponer el cerebro, y luego cortar los nervios craneales para aislar todo el cerebro. </li><li> Transferir el cerebro a un nuevo plato que contiene helado Leibovitz L-15 medio y observar bajo el microscopio estereoscópico, asegurándose de que el cerebro está completamente inmerso en el medio. </li><li> Establezca la cara dorsal del cerebro hacia arriba, y orientar el cerebro para que los bulbos olfatorios residen en la posición tres (para personas diestras). Mantenga el cerebro suavemente con las pinzas en la mano izquierda. </li><li> Usando las pinzas de disección finas (Dumont # 3 o # 4) en la mano derecha, cortar el cuerpo calloso y debajo del parénquima que conecta los hemisferios cerebrales, a lo largo de la fisura longitudinal del cerebro. </li><li> Presione suavemente los hemisferios cerebrales de distancia a los lados laterales y exponer la fisura cerebral transversal. </li><li> Separar los hemisferios pellizcando a cabo ªe parénquima entre el hemisferio y el tálamo. </li><li> Retire con cuidado el plexo coroideo del ventrículo lateral que se adjuntan a la parte lateral del hipocampo por el Affixa lámina. </li><li> Transferir el plexo coroideo aisladas para el plato de fondo de vidrio de 35 mm que contiene frescos medio Leibovitz L-15, y las cubrirás de un peso (Lista de Materiales) suavemente para mantener el tejido en su lugar. </li></ol> 2. imágenes en vivo de CPEC cilios <ol><li> Confirmar ultravioleta adecuada (UV) y el filtro (s) deducido (IR) de corte para bloquear la luz corta que 400 nm y más de 700 nm, y que de densidad neutra (ND) Filtros (25% y 6%) se inserta en la trayectoria de la luz del microscopio invertido. </li><li> Ajuste el enfoque de la lente objetivo más o menos a ojo, y luego ajustar el condensador de modo que el centro y el enfoque para ajustarse a la iluminación Köhler. Insertar un contraste de interferencia diferencial apropiado (DIC) prisma, un elemento de DIC, así como elementos del analizador y el polarizador en el liruta luchar para ajustarse a la óptica DIC. </li><li> Ajustar el contraste de la vista por la posición del prisma DIC modo que la estructura de la superficie del tejido es más reconocible. Si todos los cilios de las células diana son móviles, una visión clara de cilios móviles no se puede obtener por el ojo a causa de su movimiento. </li><li> Cambie la trayectoria de la luz a la cámara de video, y quitar los filtros ND para aumentar la potencia de la luz. </li><li> Utilice la cámara en el modo de enfoque para ajustar el campo de visión y el enfoque. Durante el enfoque, en el que las imágenes de vídeo se visualizan en tiempo real en el monitor, una visión clara de cilios móviles no está disponible. </li><li> Utilice la cámara a 200 Hz con un tiempo de exposición de 0,1 ms para el período (segundos a minutos) deseado. Después de la adquisición de la pila de imágenes, cuadros individuales se mostrarán las estructuras ciliares claras. Si bordes ciliares están borrosas, aumentar la velocidad de fotogramas o utilizar un tiempo de exposición corto. </li><li> Registrar el movimiento de los cilios CPEC dentro 25-60 minutos después de la eutanasia en LeibovitzL-15 medio. </li></ol> 3. Análisis de movimiento ciliar <ol><li> Rastrear manualmente superando patrones de cada cilio en el monitor de la computadora. Marcar las posiciones de punta ciliar en cada cuadro con el puntero del ratón, que se ensamblan para obtener información trayectoria de cada cilio. Cualquiera de analizar la información de trayectoria utilizando el mismo software o exportar a otras aplicaciones más generales para su posterior análisis. La eficiencia de este paso de análisis se describe en la discusión. </li><li> Clasificar las trayectorias en dos modos de movimiento, de ida y vuelta o de rotación, por ojo. </li><li> Calcular la frecuencia de latido ciliar (CBF) utilizando la siguiente fórmula: [CBF = (número de fotogramas por segundo) / (número promedio de marcos para un solo latido)] 14, que se puede obtener a partir de un diagrama de movimiento punta ciliar (Figura 3 ). Repetir este cálculo para múltiples ciclos de batido ciliar, porque otra cilios en la misma célula puede interferir con el movimiento de cada cilium, resultando en irregularidad. </li><li> Para analizar la uniformidad angular de la ciliar superando ejes dentro de una sola célula, definir el ángulo θ golpes para cada trayectoria (Figura 4). Para trayectorias de nuevo adelante y hacia atrás, ajuste la posición de la punta cilios a una línea recta, y definir θ como el ángulo de la línea hace con el eje x. Para las trayectorias de rotación, encajar las posiciones a una elipse, y definir θ como el ángulo del eje mayor de la elipse hace con eje x. Los detalles de la instalación se describen en la sección de Resultados Representante. </li><li> Para obtener una descripción cuantitativa de cada trayectoria, calcular generalizada relación de aspecto AR. Brevemente, rotar la trayectoria por - θ y definir AR como la relación entre las anchuras de la distribución a lo largo de x - y -axes Y (Figura 4B). Los detalles se muestran en la sección Resultados Representante, y la interpretación, El significado y la limitación de los parámetros se describen en la Discusión. </li></ol> 4. Preparación de muestras para SEM Nota: SEM es un método importante para evaluar el estado de los cilios en CPECs de una manera integral. Para preparar muestras para SEM, un procedimiento estándar se informó anteriormente 15 se emplea con ligeras modificaciones. <ol><li> Antes de la disección de los tejidos del cerebro, preparar el fijador en un vial de vidrio de 5 ml con un tapón de polietileno. El fijador se compone de 2% de paraformaldehído, 2.5% de glutaraldehído (solución media de Karnovsky 16) en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4. </li><li> Diseccionar el tejido del cerebro como se describe en el paso 1. </li><li> Brevemente enjuagar el tejido aislado con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en un nuevo plato y luego fijar el tejido en el fijador en el vial de vidrio durante 1 hora a temperatura ambiente. Utilice pipetas de transferencia desechables y manipular las muestras gently. Después de enjuagar en HBSS, el tejido se vuelve pegajosa. <ol><li> Para transferir los especímenes en la solución de fijación, expulsar lentamente una pequeña cantidad de solución que contiene el tejido de la pipeta de transferencia como una gotita y añadir a la fijador. </li></ol></li><li> Después de la fijación, deseche el fijador y lavar el tejido con tampón fosfato tres veces. </li><li> Sumergir el tejido en una solución de sacarosa al 10% para lavar los aldehídos restantes. Para garantizar la eliminación completa de los aldehídos, sumergir las muestras en la solución durante 10 min y luego repetir dos veces con 10% de sacarosa fresco. Este paso es importante para lograr la adecuada post-fijación en los pasos posteriores. </li><li> Sumergir el tejido en una solución de 1% de tetróxido de osmio en tampón fosfato durante 30 min y luego se coloca en hielo durante post-fijación. Juzgar el grado de osmification por el color de la muestra: cuando aldehídos se eliminan por completo, la muestra es de color negro. </li><li> Lavar las muestras de tejidos después de la fijada extensamente con doble destiladad agua varias veces. </li><li> Deshidratar las muestras por inmersión en concentraciones graduadas de etanol, por lo general 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, y 100%, durante 10 min cada uno. Obtener etanol anhidro mediante la colocación de tamices moleculares en etanol 99,5% de una botella que acaba de adquirir. Repita deshidratación con etanol anhidro tres veces. </li><li> Colocar las muestras deshidratadas en acetato de isoamilo, un reactivo de sustitución de secado de punto crítico, para 10 min. Repita este paso dos veces. Este reactivo se evapora rápidamente y la muestra puede convertirse en seco, lo que resulta en la destrucción por la tensión superficial. Por lo tanto, no secar la muestra por completo. </li><li> Después de que el intercambio final de acetato de isoamilo, eliminar la mayor parte del disolvente, inmediatamente envolver el vial de vidrio abierto con papel de aluminio, y colocar el vial en hielo seco. Usando una aguja o unas pinzas finas, hacer varios agujeros en la lámina que cubre la boca del vial, de modo que el dióxido de carbono líquido fluye fácilmente en el vial en el secador de punto crítico. Continúe con el siguiente pasolo más rápido posible. </li><li> En este paso, minimizar el arrastre de acetato de isoamilo en la cámara de la secadora, pero no dejes que la muestra se seque completamente antes de secado de punto crítico. Además, no deje la muestra en hielo seco durante un tiempo innecesariamente largo para evitar la formación de escarcha en el vial. </li><li> La transferencia de los viales de vidrio envueltas en papel aluminio que contienen las muestras de tejido en el secador de punto crítico que asegura la estructura de la superficie del tejido permanece intacta, mientras que la eliminación de agua contenida en el tejido. La información detallada sobre el funcionamiento del secador de punto crítico puede obtenerse a partir de las instrucciones del fabricante. </li><li> Maneje las muestras cuidadosamente con un palillo de dientes para minimizar el daño mecánico. Las muestras de tejido secas resultantes son frágiles. Montar las muestras en trozos de metal y escudo de oro-paladio usando una pulverización catódica de iones. </li></ol> 5. Observación por SEM <ol><li> Observe por SEM y grabar imágenes con una cámara digitalequipado para microscopio electrónico de barrido. </li><li> Transferir datos de imagen digital a un PC para su análisis. </li></ol>

<ol><li>Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+ciliary+motility+on+choroid+plexus+epithelial+cells+during+the+perinatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period.</a> Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).</li>
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<li>Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+digital+imaging+of+ependymal+cilia+in+the+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain.</a> Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).</li>
<li>Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nodal+cilia+movement+and+measurement+of+nodal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).</li>
<li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+pattern+is+associated+with+specific+ultrastructural+defects+in+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).</li>
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<li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolarity+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Este documento tiene por objeto informar metodología detallada para observar la motilidad de los cilios en los tejidos del plexo coroideo aisladas. Novedades científicas se han reportado en estudios anteriores 1,8.

Perspectivas de este método Aunque la técnica descrita aquí no proporciona un análisis más detallado de los cilios que los métodos publicados anteriormente, la importancia de esta técnica reside en la simplicidad del sistema y la eficacia de costes, que se puede aplicar fácilmente a cualquier tipo de detección de la motilidad ciliar ex vivo. En particular, TI Workbench proporciona una interfaz simple y fácil de usar que permite a los investigadores observar y analizar la motilidad c...

Los cilios son proyecciones en forma de pelo en la superficie de la mayoría de las células de vertebrados, que han atraído la atención de los investigadores médicos debido a una clase de enfermedades denominadas ciliopatías 2-4. A pesar de la expresión ubicua del orgánulo, se ha descrito una amplia variedad de funciones ciliares, incluyendo la motilidad y la biodetección. Por ejemplo, los cilios móviles en la superficie mucoepitelial transportan moco5 y restos epiteliales a la salida de los tractos, previniendo así la enfermedad al limpiar la superficie de los epitelios. Además, durante los períodos tempranos de desarrollo y las etapas embrionarias, los cilios regulan la proliferación de las células madre6 y están involucrados en la determinación de la asimetría izquierda-derecha del cuerpo de los vertebrados7. 
Las células epiteliales del plexo coroideo (CPECs) son derivados de las células neuroepiteliales que cubren la superficie del tejido del plexo coroideo en el cerebro, que desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis del entorno intracraneal mediante la producción de líquido cefalorraquídeo (LCR). Se ha demostrado previamente que los CPEC tienen múltiples cilios inmóviles que regulan la producción de LCR a través de receptores acoplados a proteínas G que se concentran específicamente en los cilios8. A pesar de que estos cilios habían sido considerados como cilios inmóviles inactivos, se descubrió que algunos cilios CPEC exhiben motilidad transitoria durante el período neonatal1. Este hallazgo fue muy importante porque reveló que los llamados cilios inmóviles no son necesariamente inmóviles desde el comienzo del desarrollo y podrían mostrar motilidad transitoria durante ventanas de tiempo específicas, posiblemente en respuesta a demandas y funciones fisiológicas específicas9. Para describir con precisión la naturaleza móvil de los cilios CPEC, es necesario desarrollar un sistema de observación ex vivo que abarque el análisis de los perfiles cinéticos únicos de los cilios CPEC. 
Con respecto a la motilidad, aunque varios informes técnicos han descrito observaciones de los cilios móviles del epitelio traqueal5,10, flagelos monocelulares móviles11, los llamados cilios móvilesconvencionales 12 y cilios nodales13, los métodos analíticos detallados aplicables a estructuras relativamente onduladas como el plexo coroideo no han sido bien documentados hasta ahora. Además, se requiere una alta resolución de tiempo para analizar el movimiento ciliar de los CPEC, en los que son indispensables costosas cámaras de alta velocidad. Para eludir esta necesidad y simplificar el monitoreo de la motilidad ciliar de varios tipos de células, se ha introducido una cámara de alta velocidad y bajo costo, y se ha desarrollado un método fácilmente accesible y conveniente para registrar la motilidad de los cilios móviles, especialmente para describir la velocidad y el patrón de movimiento de cada cilio1. Además, se ha utilizado aquí el software de análisis de imágenes original "TI Workbench" para facilitar el análisis detallado de la motilidad. En conjunto, este método proporciona una nueva estrategia concisa para analizar el movimiento ciliar junto con la microscopía electrónica de barrido correlativa (SEM), que puede adoptarse en una amplia gama de investigaciones sobre el cilio.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reactivos requeridos</td></tr><tr><td colspan="4">para la obtención de imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 medio</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">para la preparación de SEM</fuerte></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank</td><td>Life Technologies</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehído&nbsp;</td><td>Nacalai tesque</td><td>17003-05</td><td></td></tr><tr><td>acetato de isoamilo</td><td>Nacalai tesque</td><td>02710-95</td><td></td></tr><tr><td>Tamices moleculares 4A 1/8&nbsp;</td><td>Wako Chemicals</td><td>130-08655</td><td>para la preparación de</td></tr><tr><td>solución salina (PBS) tampón de fosfato</td> de etanol anhidro (PBS)Tampón de fosfato <td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>, 0,1 M</td><td></td><td></td><td>Para hacer 100 ml, mezcle 19,0 ml de 0,1&nbsp; M NaH2PO4 y 81,0 ml de 0,1&nbsp; M Na2HPO4</td></tr><tr><td>monosódico fosfato (dihidrato)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31718-15</td><td></td></tr><tr><td>fosfato disódico (anhidro)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31801-05</td><td></td></tr><tr><td>suclose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td></td></tr><tr><td>tetróxido de osmio</td><td>Nisshin EM</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>hielo</td><td></td><td></td><td></td> seco</tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Herramientas y materiales para la disección</td></tr><tr><td colspan="4">para imagen en vivo y preparación SEM</</td></tr><tr><td>microscopio estereoscópico</td> fuerte><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>toalla</td><td></td><td></td><td></td> de papel plana</tr><tr><td>&Phi; Plato</td><td></td><td></td><td></td>de plástico de 10 cm</tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td></td><td></td><td></td>de 100 ml</tr><tr><td>tijeras de operación rectas</td> Pinza de relojero <td>Sansyo</td><td>S-2B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>No.DU-3 o -4, INOX</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">para imagen de células vivas</plato ></td></tr> <tr><td>fondo de vidrio</td> fuerte <td>Matsunami Glass D110300</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>para preparación SEM</</td></tr><tr><td>lámina</td><td></td><td></td><td></td></tr> > aluminio fuerte <tr><td>Frasco de vidrio de 5 ml con tapón de polietileno</td><td>Nichiden Rika-Glass</td><td>PS-5A</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de transferencia</td><td>Samco Scientific</td><td>SM251-1S</td><td>para transferencia de muestras</td></tr><tr><td>palillo</td><td></td><td></td> de dientes <td>para la transferencia de muestras</td></tr><tr><td>pulverización iónica con oro-paladio</td><td>Hitachi</td><td>E-1030</td><td></td></tr><tr><td>secador de punto crítico</td><td>Hitachi</td><td>HCP-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">equipos y materiales microscópicos</td></tr><tr><td colspan="4">para imagen de células vivas</</td></tr><tr><td>microscopio invertido</td><td>fuerte Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>100 W carcasa de bulto de mercurio y fuente</td> >de alimentación <td>Olympus</td><td>Se puede utilizar la lámpara de mercurio U-ULH y BH2-RFL-T3</td><td></td></tr> de <tr><td>100 W</td><td>Ushio</td><td>USH103D</td><td></td></tr><tr><td>condensador DIC, n.a. 0,55</td><td>Olympus</td><td>IX-LWUCD</td><td></td></tr>, <tr><td>obturador eléctrico</td><td>Vincent Associates</td><td>VS35S22M1R3-24 y VMM-D1</td><td>.</td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda (400-700&nbsp; nm, &Phi; 45 y nbsp; mm)</td><td>Filtro ND Koshin Kagaku</td><td>C10-110621-1</td><td></td></tr><tr><td>(&Phi; 45 mm)</td><td>Olympus</td><td>45ND6, 45ND25</td><td>combinación de filtros ND de 25% y 6% se utiliza</td></tr><tr><td>lente objetivo (inmersión en agua) con elemento DIC</td><td>Olympus</td><td>UApo 40XW/340, n.a., 1.15 con cámara de video de alta velocidad IX-DPAO40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Allied Vision Technologies</td><td>GE680</td><td>&#8805; Velocidad de fotogramas de 200 Hz y tiempo de exposición de 1 mseg</td></tr><tr><td>Software de adquisición/análisis de imágenes</td> en <td>el software</td><td>TI Workbench</td><td>capaz de adquirir a altas velocidades de fotogramas.</td></tr><tr><td>PC para control / análisis de cámaras</td><td>Apple</td><td>Mac Pro</td><td></td></tr><tr><td>mesa de aislamiento de vibraciones</td><td>Meiritsu Seiki</td><td>AD0806</td><td></td></tr><tr><td>peso para pañuelos</td><td>Kits de anclaje de corte</td><td>Warner Instruments</td><td>Se puede hacer con malla de nailon pegada a una forma de U aplastada &Phi; 0.5&nbsp; mm de alambre de platino.</td></tr><tr><td>cubreobjetos (peso alternativo al pañuelo)</td><td>Matsunami</td><td>hecho a medida</td><td>Un cubreobjetos se puede utilizar como pesa de tejido.</td></tr><tr><td colspan="4">para microscopio SEM</fuerte></td></tr><tr><td>invertido</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>microscopio electrónico de barrido</td><td>JEOL</td><td>JSM-6510</td><td></td></tr></tbody></table>

observación del movimiento ciliar de las células epiteliales del plexo coroideo<em&gt; ex vivo</em

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

El plexo coroideo se encuentra en la pared ventricular del cerebro, cuya función principal se cree que es la producción de líquido cefalorraquídeo. Las células epiteliales del plexo coroideo (CPEC) que cubren la superficie del tejido del plexo coroideo albergan múltiples cilios únicos, pero la mayoría de las funciones de estos cilios aún no se han investigado. Para descubrir la función de los cilios CPEC con especial referencia a su motilidad, se desarrolló un sistema de observación ex vivo para monitorear la motilidad ciliar durante los períodos embrionario, perinatal y postnatal. El plexo coroideo se diseccionó del ventrículo encefálico y se observó bajo un microscopio de contraste mejorado con video equipado con óptica de contraste de interferencia diferencial. Bajo esta condición, se desarrolló un método simple y cuantitativo para analizar los perfiles móviles de los cilios CPEC durante varias horas ex vivo. A continuación, se observaron los cambios morfológicos de los cilios durante el desarrollo mediante microscopía electrónica de barrido para dilucidar la relación entre la madurez morfológica de los cilios y la motilidad. Curiosamente, este método pudo delinear cambios en el número y la longitud de los cilios, que alcanzaron su punto máximo en el día postnatal (P) 2, mientras que la frecuencia de latidos alcanzó un máximo en P10, seguido de un cese abrupto en P14. Estas técnicas permitirán dilucidar las funciones de los cilios en diversos tejidos. Si bien las técnicas relacionadas se han publicado en un informe anterior1, el presente estudio se centra en técnicas detalladas para observar la motilidad y morfología de los cilios CPEC ex vivo.

Una visión general del flujo de trabajo se muestra en la Figura 1, incluyendo imágenes de los dispositivos. Observaciones de movimiento vivo de CPECs Película 1 muestra una película de CPECs aisladas a partir de un ratón perinatal, y la película 2 muestra una vista ampliada de las imágenes en la película 1. Debe tenerse en cuenta que las puntas ciliares individuales son menos claros en imágenes f...

En este estudio, se optimizó una técnica detallada de microscopía óptica para la observación y el análisis en tiempo real del movimiento de los cilios CPEC ex vivo junto con un método de microscopía electrónica para el análisis ultraestructural.

Observación del Movimiento ciliar de las células epiteliales del plexo coroideo<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

El objetivo general del siguiente experimento es analizar el movimiento de las células epiteliales del plexo coroideo, cilios, ex vivo. Esto se logra primero mediante la extracción del cerebro de un embrión o cría de ratón para aislar el tejido del plexo coroideo. El movimiento ciliar se visualiza mediante contraste de interferencia diferencial, o microscopía DIC, y luego se adquiere una película digital de las puntas de los cilios para el seguimiento manual de las posiciones de las puntas ciliares.En última instancia, los movimientos de la punta reconstruidos de los cilios se categorizan y cuantifican según los patrones de sus movimientos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como ¿cómo se controla la mortalidad de los cilios durante el desarrollo y cómo cambia el patrón de movilidad con el tiempo? La implicación de estas técnicas se extiende al análisis y diagnóstico patofisiológicos.Las enfermedades asociadas con Siria, ya que nuestros conocimientos fundamentales sobre la cinética de Siria aún son limitados. Comience colocando un ratón neonatal lavado con etanol al 70 %, la cabeza en Leibovitz L-15 frío, en un medio en una placa estéril de 10 centímetros inmediatamente después de la decapitación. A continuación, utilice un par de pinzas de relojero para retirar el cuero cabelludo del cráneo.Luego, corte el cráneo mediante una sección mediana a lo largo de la sutura longitudinal para exponer el cerebro, seguido del corte de los nervios craneales para extraer todo el órgano. Transfiera el cerebro aislado a un nuevo recipiente lleno con medio frío y hielo fresco, con la cara dorsal hacia arriba, y coloque el recipiente bajo un microscopio estereoscópico. A continuación, oriente el tejido de modo que los bulbos olfatorios queden posicionados a las tres en punto, y sujete suavemente el cerebro con la pinza de relojero.Con la otra mano, utilice pinzas de disección finas para cortar los pedúnculos cerebrales que conectan los hemisferios cerebrales con el tronco cerebral. Extraiga el cefalón de Dion para separar aún más los hemisferios y coloque la superficie cortada hacia arriba, luego tire de la lámina alia para retirar el plexo coroideo del ventrículo lateral unido al lado lateral del hipocampo. Una vez que el plexo coroideo haya sido aislado, transfiera el tejido a una placa de vidrio de 35 milímetros con fondo de vidrio que contenga medio fresco, y coloque un peso sobre el tejido para mantenerlo suavemente en su lugar. Dentro de los 25 a 60 minutos posteriores a la eutanasia, comience la imagenología en vivo de las células epiteliales cilias del plexo coroideo, ajustando manualmente el enfoque del objetivo del microscopio.Ajuste el condensador para que el centro y el enfoque coincidan con la iluminación Kula. Luego inserte los elementos ópticos adecuados en el trayecto del haz de luz para adaptarse a la óptica DIC. Mueva el prisma DIC para ajustar el contraste de las imágenes a una posición en la que la estructura superficial del tejido se reconozca claramente.Luego cambie la trayectoria de la luz a la cámara de video y aumente la potencia de la luz. Tras retirar los filtros de densidad neutra, ajuste un campo de observación y el enfoque, configurando la resolución temporal de la cámara de video en 200 hercios y el tiempo de exposición en 0,1 milisegundos durante el período de adquisición deseado. A continuación, adquiera las imágenes; tras obtener la pila de imágenes, cada cuadro individual mostrará una imagen clara de los cilios para rastrear manualmente los patrones de latido de cada uno.Utilice el puntero del ratón para marcar la posición de las puntas de los cilios en cada cuadro. Luego, mediante el software adecuado, analice los datos de la trayectoria y clasifique las trayectorias en uno de dos modos de movimiento: de ida y vuelta o rotacional, a simple vista. Utilizando la fórmula, calcule la frecuencia de latido ciliar para múltiples ciclos de latido ciliar.Dado que otras cilias en la misma célula pueden interferir con el movimiento de cada cilio. A continuación, para analizar la uniformidad angular de los ejes del latido ciliar dentro de una sola célula. Para las trayectorias de ida y vuelta, ajuste las posiciones de los extremos de las cilias a una línea recta, definiendo theta como el ángulo que forma dicha línea con el eje X.Para las trayectorias rotacionales, ajuste las posiciones a una elipse definiendo theta como el ángulo que forma el eje mayor de la elipse con el eje x. Finalmente, para una descripción cuantitativa de cada trayectoria, gire las trayectorias en theta definiendo sus proporciones como las relaciones entre los anchos de su distribución a lo largo de los ejes x e y. En este primer clip, se muestra una vista superior de las células epiteliales del plexo coroideo con Celia de un ratón recién nacido de dos días, obtenida mediante microscopía de video de alta velocidad; la superficie irregular del tejido del plexo coroideo hace que sea visible tanto en los planos enfocados como desenfocados.En este segundo clip, se muestra una vista ampliada del área delimitada en la película anterior, lo que permite una observación más detallada de los movimientos rotacionales y de ida y vuelta exhibidos por el cilío individual. Aquí se presentan las trayectorias de los movimientos representativos del extremo ciliar reconstruidas a partir de registros de película durante múltiples ciclos, junto con los cursos temporales de las coordenadas x e y de las posiciones del extremo representadas en las gráficas. Para demostrar un desfase entre las dos coordenadas en estas gráficas, las coordenadas x e y fueron normalizadas y superpuestas.Aunque los CLIA móviles se reconocen fácilmente mediante imágenes en vivo, no es sencillo identificar los CLIA no móviles con este método. Para superar esta dificultad, la microscopía electrónica de barrido puede ser indispensable para obtener imágenes completas de los clia independientemente de su movilidad. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar la disección con suficiente rapidez para que se preserve la frescura de la muestra y se mantenga la movilidad de Syria.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras de tejido con cereal viral, así como de cómo monitorear y cuantificar la mortalidad del CX in vivo.

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Investigación

JoVE Journal

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Neurociencia

Este video demuestra el desarrollo de un modelo ex vivo de brote coroideo para estudiar la angiogénesis microvascular ocular. El ensayo consiste en cultivar explantes de ojo de ratón que contienen el tejido coroideo unido a la esclerótica y el epitelio pigmentario de la retina en condiciones específicas que promueven la germinación microvascular coroidea.

Ensayo de brotación de coroides para el estudio de la proliferación microvascular ocular ex vivo

Este video muestra el procedimiento de aislar células inmunitarias de plexos coroideos de ratón. Este procedimiento se utiliza en la investigación de neuroinmunología para comprender cómo las células inmunitarias de los plexos coroideos afectan a la salud del cerebro y a diversas enfermedades neurológicas.

Aislamiento de células inmunitarias de plexos coroideos de ratón

Fuente: Al Omran, A. J., et al. Imágenes en vivo de los cilios ependimarios en los ventrículos laterales del cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2015).  Este video muestra una técnica de imagen en vivo utilizando microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) para observar el latido de los cilios ependimarios en secciones sagitales del cerebro de ratón. Los cilios ependimarios impulsan el líquido cefalorraquídeo (LCR), y su actividad se registra en secciones del cerebro mantenidas en...

Imágenes en vivo de la actividad ciliar de las células ependimarias en una sección de cerebro de ratón

Fuente: Van Wonterghem, E., et al. Microdisección y visualización de microscopía electrónica de barrido de montaje completo del plexo coroideo de ratón. J. Vis. Exp. (2022)Este video muestra la preparación y la obtención de imágenes del tejido del plexo coroideo del cerebro de un ratón utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM). El proceso incluye la fijación de tejidos, la deshidratación y el recubrimiento con una capa conductora de platino para estabilizar y preparar la muestra para...

Visualización del plexo coroideo cerebral de un ratón mediante microscopía electrónica de barrido

El uso de contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía de alta resolución, una observación ex vivo de la paliza de los cilios ependymal móviles ubicada dentro de los ventrículos cerebrales de ratones se demostró por imágenes en vivo. La técnica permite una grabación de la frecuencia de latido ciliar único y ángulo superando así como sus propiedades de estimulación de oscilación de calcio intracelular.

Imágenes en vivo de la ependimarios cilios en los ventrículos laterales del cerebro del ratón

Las células epiteliales del plexo coroideo (CP) forman la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (BCSFB). Un modelo in vitro del BCSFB emplea células de papiloma del plexo coroideo humano (HIBCPP). Este artículo describe el cultivo y la infección basolateral de células HIBCPP utilizando un sistema de inserción de filtro de cultivo celular.

Un modelo basado en células epiteliales del plexo coroideo de la barrera de fluido cerebroespinal humano Sangre-para estudiar la infección bacteriana desde el lado basolateral

El objetivo de este protocolo es demostrar que el cultivo del pigmento retiniano epitelial (RPE) células en membrana de Bruch humano enfermo o envejecido. Este método es adecuado para el estudio de comportamiento de células RPE en matriz extracelular comprometida.

Cultivo de células epiteliales del pigmento retiniano en un modelo Ex Vivo de la membrana de Bruch humano envejecido

El objetivo de este protocolo es caracterizar un nuevo modelo de neurodegeneración glaucomatosa basado en la cauterización térmica de 360° del plexo vascular limbal, induciendo hipertensión ocular subaguda.

Cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal para el glaucoma inducido quirúrgicamente en roedores

Este estudio utiliza citometría de flujo y dos estrategias diferentes de gating en ratones perfundidos aislados plexos coroideos cerebrales; este protocolo identifica los principales subconjuntos de células inmunes que pueblan esta estructura cerebral.

Aislamiento y caracterización de las células inmunes de plexos coroideos de ratón microdisecados

El plexo coroideo (PC), un tejido poco estudiado en neurociencia, desempeña un papel clave en la salud y la enfermedad del sistema nervioso central. Este protocolo describe una técnica de microdisección para aislar el PC y el uso de microscopía electrónica de barrido para obtener una visión global de su estructura celular.

Microdisección y microscopía electrónica de barrido de montaje completo Visualización del plexo coroideo del ratón

Aprende a analizar el movimiento ciliar de células epiteliales del plexo coroideo ex vivo mediante microscopía DIC en ratones. Este método permite categorizar y cuantificar patrones de movimiento para estudiar el control del movimiento ciliar durante el desarrollo.

Observación del Movimiento ciliar de las células epiteliales del plexo coroideo

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