Name: Roedor cerebro microinyección para el Estudio de los sustratos moleculares de Comportamiento Motivado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende microinyección cerebral en roedores despiertos para investigar sustratos moleculares del comportamiento y trastornos psiquiátricos. Este método permite la entrega precisa de reactivos en regiones cerebrales específicas.

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</ol>

Ninguno de los autores tiene intereses contrapuestos o en conflicto.

El procedimiento que aquí se presenta es un medio eficaz para la fabricación de cánulas microinyección y microinyectores que ayudarán en la aclaración de los sustratos moleculares de la conducta motivada. Este método ofrece varias ventajas. En primer lugar, mediante la fabricación de los propios implantes y microinyectores, nuevos parámetros experimentales se pueden optimizar con rapidez, es decir, uno no necesita esperar a que los componentes a medida que lleguen. En segundo lugar, debido al pequeño diámetro de la cánula, más cánulas pueden ser implantados simultáneamente. Esto acorta el tiempo quirúrgico requerido, lo que puede mejorar la supervivencia, y también permite que múltiples implantes por animal. En tercer lugar, el software utilizado para controlar las cámaras operantes acomoda fácilmente Escala de tasa progresivas desde un paradigma proporción fija se puede convertir rápidamente a un paradigma relación progresiva mediante la simple aplicación de una lista de parámetros de transición caso de que contiene el programa de refuerzo deseado. Serampliamente útil, un procedimiento de microinyección genérico se presentó que debería ser ampliamente aplicable para la microinyección de casi cualquier reactivo disponible actualmente. En consecuencia, esperamos que esta técnica seguirá siendo de gran utilidad similar en el futuro con pequeñas modificaciones. Por cambiando sólo unas pocas variables, este enfoque se puede aplicar a un amplio número de reactivos. Los parámetros que se pueden manipular más comúnmente incluyen la longitud que el microinyector sobresale de la cánula, el volumen de la inyección, y la velocidad de inyección. Por ejemplo, uno puede desear el inyector sobresalga más lejos de la punta de la cánula para evitar la cicatriz glial que normalmente se forma alrededor de los implantes crónicas. Adicionalmente, se puede desear para inyectar un volumen mayor. Para microinyecciones virus del estriado, un volumen de 1 l se utiliza normalmente y este volumen se inyecta típicamente durante un período de tiempo más largo (con frecuencia 7 - 10 min plus 3 - 10 min tiempo de difusión adicional) en comparación con que el usod para los reactivos farmacológicos (típicamente 0,3 - 0,5 l más de 2 - 3 minutos más 1 - 3 min tiempo de difusión adicional). El usuario debe consultar la literatura y / o empíricamente determinar los parámetros más adecuados para sus necesidades. Independientemente, el éxito de este procedimiento depende críticamente de 4 variables: 1) la longitud de la cánula, 2) longitud microinyector, 3) calidad de patrón de pulverización microinyector, y 4) la integridad del sistema antes de la inyección. Debido a la ubicación microinyección depende de la profundidad que el microinyector sobresale de la cánula, es imperativo que tanto cánulas (Paso 1.2.8) y la longitud microinyector (post-flexión, Paso 2.2.1) son ambos precisamente conocida y uniforme entre todos los sujetos . Esto puede ser fácilmente controlado por fácilmente rechazar cualquier utensilio que no es la longitud requerida en la final de la re-medición. Por otra parte, la ubicación de inyección sólo puede predecirse si se produce inmediatamente por debajo de la cánula guía. Por lo tanto, cualquier microinyector que el DOEs No rocíe un largo arroyo, bien en las pruebas (Pasos 2.4.6) debe ser rechazada. Una inyección de calidad también está relacionada con la integridad del sistema antes de la inyección. Si después de dispensar toda el agua del inyector (antes de llenar con el reactivo) se observan varios puntos en el laboratorio de borrado, entonces una fuga necesita ser remediado (Nota sobre el paso 2.4.8). Además, si la burbuja (Paso 2.4.9) que separa el medicamento del agua en la tubería PE20 es no uno, burbuja única (después de llenar el microinyector con el reactivo), entonces el inyector está parcialmente obstruido. Esta obstrucción puede prevenir o desviar la inyección. Esto también se puede remediar fácilmente (Nota en el paso 2.4.8). Si uno desea microinyectar mientras el animal está en el marco estereotáxico hay tres alternativas. En primer lugar, se podría aumentar la longitud del collar microinyector tal que puede ser sostenida firmemente por el manipulador estereotáxico y también se extiende lo suficiente para permitir la conexión a un tubo de PE20. En segundo lugar, ene temporalmente podría implantar una cánula y utilizar el microinyector norma que aquí se presenta. En tercer lugar, se podría utilizar dibujado y pipetas de vidrio pulido. 16,17 Una limitación importante del procedimiento que aquí se presenta es que se realiza mejor en ratas bien manejados, que están familiarizados con el procedimiento. Las ratas utilizadas para los datos que se describen en la sección de resultados requieren procedimientos especiales de manipulación debido a que el mismo investigador maneja las ratas sobre una base diaria durante más de 2 meses. Esto incluyó la observación diaria y la manipulación del implante quirúrgico durante al menos 2 semanas. Sin embargo, las ratas se habituaron rápidamente pueden por una serie de técnicas que se utilizan para antes del ensayo de inhibición pre-pulso, que puede verse afectada por el estrés. Estas técnicas especiales de habituación han sido muy bien detallado anteriormente. 43 Además de estos procedimientos, es aconsejable que las ratas se habituaron al procedimiento de microinyección donde se utilizan microinyectores acortados duinyecciones anillo &#39;farsa&#39;. Durante estas inyecciones simuladas, es fundamental que el microinyector no sobresale en el tejido con el fin de limitar el daño a los tejidos. En otras palabras, el microinyector debe ser de no más de 14 mm se inclinó. Por lo tanto, la habituación a fondo requerida para la aplicación óptima de esta técnica podría ser visto como una limitación. Si bien existen varios paradigmas de comportamiento para medir la motivación, la relación progresiva se utiliza comúnmente para cuantificar el esfuerzo que el sujeto está dispuesto para ejercer para obtener un reforzador. El paradigma relación progresiva produce una medida conocida como punto de interrupción, que a menudo se define como el número máximo de pulsaciones de palanca en la última relación completado;.. Es decir, máxima respuesta que genera un reforzador 21 La relación progresiva es sensible a reforzador magnitud. Por ejemplo, el aumento de las dosis de cocaína (o sacarosa) producen un mayor punto de interrupción y la cocaína inferior (o sacarosa) dosis producen una breakp menormixto. 21,22 En consecuencia, punto de interrupción es un proxy utilizado habitualmente para la motivación y / o eficacia de refuerzo. 21,23-26 Porque la intención del punto de interrupción es determinar cuando el animal deja de responder, un parámetro importante del paradigma de relación progresiva es duración de la sesión. Duración de la sesión finitos puede poner una tapa falsa en los valores de punto de interrupción y esto puede ser exacerbada por los pre-tratamientos que disminuyen de forma anormal la tasa de auto-administración o que pausa aumento post-refuerzo. Este factor de confusión puede ser superada por cualquier número de enfoques;.. Por ejemplo, las sesiones que terminan cuando el animal ha retenido responder por algún múltiplo del intervalo promedio entre infusión 44 Una variante más comúnmente aplicada de este enfoque es a terminar sesiones vez de responder tiene sido retenida por algún valor determinado empíricamente que se mantiene constante a través de temas. Hemos proporcionado el método para aplicar este enfoque en el Paso 4.4.9.11.

Los roedores y los humanos responden de manera notablemente similar a los estímulos conductualmente relevantes1-3. Esto sugiere que los roedores son sujetos apropiados para dilucidar los sustratos moleculares del comportamiento y las condiciones psiquiátricas complejas4. La comprensión de los sustratos moleculares de procesos conductuales complejos, como la motivación, requiere con frecuencia microinyecciones cerebrales. Aquí se presentará tanto la técnica de microinyección cerebral como un ensayo de motivación primaria. Se utilizarán ratas como sujetos, pero estos procedimientos se pueden adaptar fácilmente a ratones bien manejados. En este documento se incluyen los procedimientos para la fabricación de las cánulas, obturadores (cánulas ficticias o estiletes) y microinyectores necesarios. El método presentado es significativamente más flexible y más rentable que los implementos prefabricados. Esta flexibilidad resultará valiosa a la hora de optimizar las condiciones. Es importante destacar que, debido a que el procedimiento de microinyección se puede utilizar para probar una gran cantidad de hipótesis; Las técnicas aquí presentadas deben ser ampliamente aplicables. Por ejemplo, los ligandos receptores se pueden microinyectar para comprender la neuroquímica3,5,6; los péptidos permeables a las células y las moléculas pequeñas se pueden microinyectar para comprender las vías de señalización intracelular7-10; Las toxinas, los bloqueadores de los canales iónicos o los cócteles antagonistas se pueden microinyectar para comprender los circuitos1,11,12.
Si bien el protocolo genérico presentado aquí puede ser fácilmente adaptado por el usuario a sus necesidades particulares, el procedimiento es particularmente adecuado para ensayos de comportamiento, ya que la microinyección ocurre en roedores despiertos que solo están bajo una leve restricción de manos. No se requiere anestesia ni restricciones especiales. Esto es posible porque el propio cerebro carece de sensación de dolor. Sin embargo, si no se utiliza anestesia, la microinyección debe realizarse a través de cánulas que previamente fueron implantadas estereotáxicamente. Esto se debe a que los nociceptores están presentes en el cuero cabelludo, las meninges,13 que son las membranas que rodean el cerebro, y el periostio,14 que es la membrana que cubre el cráneo. Cabe señalar que a veces es deseable la microinyección bajo anestesia. Un ejemplo es cuando se inyecta el virus, y es posible que desee inyectar el virus directamente a través de agujas de acero inoxidable15 o pipetas de vidrio, ya que esto puede reducir el daño tisular y mejorar la eficiencia de la transducción. 16,17 Los microinyectores que se describen a continuación pueden modificarse para este propósito y las sugerencias sobre cómo hacerlo se pueden encontrar en la Discusión. Debido a que otros artículos de JoVE han demostrado el implante de cánula cerebral estereotáxica,18-20 estos procedimientos no se tratarán aquí.
Presentamos estos procedimientos de microinyección junto con un ensayo que cuantifica la motivación. Actualmente se utilizan varios modelos de comportamiento motivado en roedores, como la caja de pista y el escalado de barrera. Aquí, describimos cómo usar un programa de reforzamiento de razón progresiva operante para cuantificar la motivación donde la respuesta operante es mantenida por un reforzador. Respondiendo en la relación progresiva responde a la magnitud del reforzador. 21,22 En consecuencia, este ensayo se utiliza de forma rutinaria como indicador de la motivación y/o de la eficacia reforzadora. 21,23-30 Debido a que varias revisiones excelentes han cubierto este tema en detalle,21,24 nos centraremos principalmente en las preocupaciones prácticas.

<table><tbody><tr><td>Tubo de cánula</td><td>Amazon Supply/ Piezas pequeñas</td><td>HTXX-26T-60</td><td>26 G, Hipotubo S/S 316-TW 26GA</td></tr><tr><td>Obturador</td><td>Amazon Supply/ Piezas pequeñas</td><td>GWXX-0080-30-05</td><td>Calibre 33, Alambre S/S 316LVM 0.008 IN</td></tr><tr><td>Microinyector Alambre</td><td>MicroGroup</td><td>33RW 304</td><td>Calibre 33</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td>3924AC</td><td>Líquido, no gel, se puede esterilizar en</td></tr> <tr><td>autoclaveMicroinyector Tubo de plástico</td><td>Becton Dickson</td><td>427406</td><td>PE20</td></tr><tr><td>Hemostáticos de peso medio</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241-G</td><td></td></tr><tr><td>Regla</td><td>Fisher</td><td>09-016</td><td>150 mm</td></tr><tr><td>#7 Pinzas</td><td>Stoelting</td><td>52100-77</td><td>Dumont, Dumostar</td></tr><tr><td>Herramienta rotativa</td><td>Dremmel</td><td>285</td> Disco de corte <td>de dos velocidades</td></tr><tr><td></td><td>McMaster Carr</td><td>3602</td><td>15/16" x 0.025"</td></tr> <tr><td>Bomba de microinyección</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PhD 2000</td><td></td></tr><tr><td>1 ul Jeringa de vidrio</td><td>Hamilton</td><td>7001KH</td><td>Estilo de aguja: 25s / 2.75 "/ 3</td></tr><tr><td>Aplicador con punta de algodón</td><td>Fisher</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas de laboratorio</td><td>Kimwipes</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Operant Software</td><td>Coulbourn</td><td>Cámaras Operantes de Estado</td><td></td></tr><tr><td>Gráfico</td><td>Coulborun</td><td>Habitest</td><td></td></tr></tbody></table>

roedor cerebro microinyección para el estudio de los sustratos moleculares de comportamiento motivado

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

La microinyección cerebral puede ayudar a la elucidación de los sustratos moleculares de comportamientos complejos, como la motivación. Para este propósito, los roedores pueden servir como modelos apropiados, en parte porque la respuesta a los estímulos relevantes para el comportamiento y los circuitos que analizan los resultados de estímulo-acción son asombrosamente similares entre humanos y roedores. En el estudio de sustratos moleculares de comportamientos complejos, la microinyección de reactivos que modifican, aumentan o silencian sistemas específicos es una técnica invaluable. Sin embargo, es crucial que el sitio de la microinyección esté dirigido con precisión para ayudar a la interpretación de los resultados. Presentamos un método para la fabricación de implementos quirúrgicos y agujas de microinyección que permite una microinyección precisa y una personalización ilimitada con un costo mínimo. Es importante destacar que esta técnica puede completarse con éxito en roedores despiertos si se lleva a cabo junto con otros artículos de JoVE que cubren los procedimientos quirúrgicos necesarios. Además, hay muchos paradigmas de comportamiento que son muy adecuados para medir la motivación. La relación progresiva es un método comúnmente utilizado que cuantifica la eficacia de un reforzador para mantener la respuesta a pesar de un requisito de trabajo (a menudo exponencial) creciente. Este ensayo es sensible a la magnitud del reforzador y a las manipulaciones farmacológicas, lo que permite determinar la eficacia y/o la motivación del reforzamiento. También presentamos un enfoque sencillo para programar el software operante para acomodar un programa de refuerzo de relación progresiva.

Aquí se ilustran ejemplos de los resultados que se pueden obtener con el procedimiento anterior. Primero que se muestra es una zona típica que se transfectadas por los vectores virales (Figura 3). En general, se obtiene un volumen de ~ 1 transfectadas mm 3 en el tejido estriatal. El volumen de la región transfectadas se puede cuantificar a través de secciones en serie, utilizando el método de Cavalieri 32 Es importante destacar que, el volumen transfectadas depende de muchos factores tales como el tipo de tejido que se está transfectada.; serotipo viral; promotor; velocidad y el volumen inyectado; número de partículas inyectadas; pH inyectado; y si hiperosmolares reactivos, tales como manitol, se utilizaron 33,34. Típicamente, nos microinyectar 10 12 partículas / ml, 1 l / min secundarios sobre 10, y permiten 7 min adicionales antes de reemplazar obturadores. Además, el inyectado es generalmente alrededor de pH 8. A continuación, se muestra que la motivación puede ser manipulado por cualquiera de la expresión del transgen (Figura 4)o microinyección reactivo farmacológico (Figura 5). En la Figura 4, expresamos un receptor Diseñador Exclusivamente activado por las drogas de diseño (DREADDs). La región codificante del receptor de DREADD fue seguido por un sitio de entrada de ribosoma interno, y una casete mCitrine. El mCitrine permite la visualización conveniente de células transfectadas. El DREADD se acopló a la proteína G heterotrimeric Gαq. La activación de la DREADD acoplado Gαq puede estimular astrocitos, 28,35 y el propio DREADD puede ser activado por la administración sistémica de clozapina-N-óxido (CNO, 3 mg / kg, ip). 14,22,36 Las ratas fueron entrenadas para palanca de responder para el refuerzo de etanol, donde 3 prensas de palanca produjeron 1 oportunidad de beber durante las diarias sesiones de 1 h más de 60 días consecutivos. A continuación, las ratas fueron obligados a la abstinencia, y DREADDs acoplados Gαq se expresaron en el núcleo accumbens astrocitos centrales. Después de 3 semanas de abstinencia, la motivación para la auto-admi<html> etanol Nister se midió por punto de interrupción. 21,27-30 La activación del núcleo accumbens astrocitos fundamentales, a través de la administración sistémica CNO, disminución de la motivación de las ratas para reanudar etanol autoadministración después de la abstinencia en comparación con el vehículo. Es importante destacar que, CNO no tuvo ningún efecto en una cohorte igualmente capacitado que expresaba la proteína fluorescente verde en lugar de la DREADD. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig3.jpg" /> Figura 3. región estriatal ventral Representante transfectadas por el virus de microinyectados. Esta imagen ilustra la región de núcleo accumbens astrocitos que se transfectaron siguiendo el método anterior. Los datos se reimprimieron de Bull et al. 13 con permiso del titular de los derechos de autor. Se pueden encontrar detalles en dicha publicación y el material complementario que acompaña.blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig4.jpg" /> Figura 4. La motivación de las ratas a etanol autoadministrarse se redujo mediante la activación de un transgén que había sobre-expresa en núcleo accumbens astrocitos centrales. Virus se microinyectó y motivación mide a través de punto de interrupción después de permitir una semana para el virus de expresar. El transgén expresó fue un diseñador Receptor Exclusivamente activado por las drogas de diseño (DREADDs). Un ANOVA de una vía (F (2,30) = 3,29, p = 0,04) seguido de un post-hoc de Scheffé revelado que la activación de la DREADD por la administración sistémica de clozapina-N-óxido (CNO, 3 mg / kg, ip ) redujo significativamente la motivación de las ratas a etanol auto-administrarse después de la abstinencia comparación con el vehículo CNO no tuvo ningún efecto en una cohorte igualmente capacitado que expresaba la proteína fluorescente verde (GFP) en lugar del DREADD. Los datos se reimprimieron de Bull et al. 13 con permiso del titular de los derechos de autor. Se pueden encontrar detalles en dicha publicación y el material complementario que acompaña. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig5.jpg" /> Figura 5. La microinyección de bloqueadores de unión brecha aumentó la motivación de las ratas para autoadministrarse etanol después de la abstinencia Dos bloqueadores brecha cruce fueron evaluados por su efecto sobre la motivación (medido a través de punto de ruptura) de las ratas a autoadministrarse etanol:. Mefloquina y 18- alfa-ácido glicirretínico (18-α). Un ANOVA de dos vías reveló que la microinyección de los bloqueadores de brecha de la salida en el núcleo accumbens de núcleo aumentó la motivación de ratas para autoadministrarse etanol después de la abstinencia (F (3,40) = 5.56, p = 0.003). Los datos se reimprimieron de Bull et al. 13 con permiso del titular de los derechos de autor. Se pueden encontrar detalles en esa publicación yel material complementario que acompaña.

Los roedores son un modelo apropiado para investigar los sustratos moleculares del comportamiento y los trastornos psiquiátricos complejos. La microinyección cerebral en roedores despiertos se puede utilizar para dilucidar los sustratos de la enfermedad. Se presenta un método de microinyección cerebral eficiente y personalizable, así como la ejecución de un paradigma operante que cuantifica la motivación.

Roedor cerebro microinyección para el Estudio de los sustratos moleculares de Comportamiento Motivado

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

El objetivo general de este procedimiento es fabricar con precisión una cánula y microinyectores, así como realizar adecuadamente la microinyección. Esto se logra primero fabricando una cánula de longitud apropiada. El segundo paso consiste en cortar y ensamblar los microinyectores.A continuación, prepare microinyectores, tubos y una bomba para la microinyección. El paso final consiste en completar la microinyección y permitir un período de difusión. En definitiva, la microinyección se utiliza para inyectar con precisión reactivos en la región cerebral deseada, demostrando un manejo adecuado.Durante la microinyección estará Ryan Poland, un estudiante en mi laboratorio. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se debe tener un cuidado especial y todos los pasos requieren mucha atención para asegurar una colocación adecuada de la cánula y una localización correcta de la microinyección. Para preparar la cánula primero, trace una línea de referencia de 15 milímetros sobre la cinta utilizando un bolígrafo de punta fina.Luego, utilícelo como guía para marcar secuencialmente secciones de 15 milímetros en el tubo con un marcador permanente de punta fina. A continuación, haga muescas en el tubo de la cánula tocándolo con el disco de corte giratorio lento de la herramienta rotatoria. En los puntos marcados, gire la cánula 180 grados y haga una muesca en el lado opuesto del tubo.No corte completamente el tubo porque podría provocar una oclusión. Posteriormente, doble el tubo bruscamente para dividirlo en secciones de 15 milímetros. Luego sostenga cada extremo de la cánula perpendicular al disco de corte entre el pulgar y el índice.Gire el tubo de la cánula mientras toca su extremo con la superficie del disco cortado para obtener una punta roma. Posteriormente, agrande ambos extremos de la cánula con una aguja biselada de calibre 26 para asegurar que se hayan eliminado todas las rebabas y que la cánula esté desobstruida. Para preparar el obturador, sujete una cánula aproximadamente en su mitad con pinzas hemostáticas rectas de peso medio, y coloque las pinzas bloqueadas sobre la mesa de trabajo de modo que la cánula quede perpendicular a la superficie.Luego, introduzca un extremo del alambre de ator en la cánula hasta que alcance la superficie de trabajo. Doble el alambre presionándolo con los dedos hasta lograr un ángulo de 30 grados, manteniendo el contacto entre el obturador y la superficie de trabajo. A continuación, retire el alambre de la cánula y corte la porción excedente a 2,5 milímetros del doblez utilizando cortadores diagonales pequeños.En este procedimiento, sostenga un extremo del tubo del microinyector perpendicularmente con un hemostato recto bloqueado. Gire el hemostato manteniendo tensión sobre el tubo y enróllelo firmemente alrededor del hemostato al menos una vez. A continuación, mida 32 milímetros desde el extremo opuesto suelto del tubo del microinyector y sujete este punto perpendicularmente con un segundo hemostato.Doble el tubo hacia adelante y hacia atrás manteniendo la tensión hasta que se rompa. Luego, inspeccione el tubo del microinyector para asegurarse de que ambos extremos estén rectos y de que el diámetro interno no esté obstruido. Dibuje una línea de referencia de cinco milímetros en la cinta métrica y marque secciones de cinco milímetros del tubo de cánula secuencialmente utilizando un marcador permanente.A continuación, toque el tubo de la cánula con el disco cortador giratorio lento en los puntos marcados para hacer muescas en el tubo. Luego, doble bruscamente el tubo del collar del microinyector para romperlo en secciones de cinco milímetros. Deslice un collar en cada tubo del microinyector a unos dos centímetros del extremo.Aplique una pequeña cantidad de pegamento instantáneo al tubo del microinyector a cinco milímetros de uno de sus extremos. A continuación, deslice el collar sobre la gota de pegamento instantáneo de modo que quede a un milímetro del extremo del tubo de microinyección. Después, cubra ambos extremos del collar con pegamento.Luego, coloque una aguja de calibre 26 en la jeringa de un mililitro llena con agua estéril. Deslice el trozo de ocho centímetros de tubo plástico del microinyector sobre la aguja, asegurándose de no perforar el tubo; después, deslice el otro extremo del tubo plástico sobre el extremo del collar del microinyector seco. Presione el émbolo de la jeringa llena de agua para comprobar la permeabilidad. En este paso, doble el microinyector terminado a 15 milímetros del extremo opuesto al collar en un ángulo de 95 grados.A continuación, corte el tubo de plástico a 70 centímetros e introdúzcalo sobre el collar del microinyector. Para preparar la bomba para la microinyección, ajuste el diámetro de la aguja de microinyección, la velocidad de infusión deseada y el volumen de inyección objetivo en el tubo. Luego, configure el modo de la bomba en volumen para que se entregue automáticamente un volumen preciso.A continuación, ajuste el tope del émbolo de la bomba para permitir que la jeringa se llene al volumen de inyección más 0,2 microlitros adicionales. Coloque ahora la punta de la jeringa hermética al gas en el agua estéril contenida en un pequeño recipiente de suero y mueva suavemente el émbolo para lubricar uniformemente el alambre interno. Tire del émbolo hasta el tope en la bomba para llenar la aguja de microinyección con agua.Próxima diapositiva. El tubo de PE 20 que está conectado al microinyector en una aguja de calibre 26 unida a una jeringa estéril de un mililitro llena de agua estéril. Rocíe agua estéril a través del microinyector e inspeccione el patrón y la distancia del rocío.Luego, coloque un microinyector esterilizado sobre un campo estéril. Deslice el tubo fuera de la aguja, corte el tubo debajo de la zona dañada por la aguja manteniéndolo en posición vertical para evitar que gotee el agua. A continuación, empuje ligeramente hacia adelante el émbolo de la jeringa del microinyector para formar una gota en la punta de la aguja y deslice el tubo PE 20 lleno de agua sobre la aguja.A continuación, empuje completamente el émbolo hacia adelante para prepararse para la carga de la muestra y asegúrese de que no quede ningún rastro de etanol en el microinyector. Verifique la presencia de fugas tocando con una toalla de laboratorio limpia unas cuantas veces la gota de agua que se forma en la punta del microinyector. Luego, retire el émbolo de la jeringa 0,2 microlitros para crear una burbuja entre el agua estéril y el tubo de PE 20 y la solución que se va a inyectar.A continuación, coloque el microinyector en el reactivo que se va a inyectar y tire lentamente del émbolo de la jeringa hasta el tope. Para preparar al animal para la inyección, sostenga el pecho de la rata contra el pecho del experimentador. Limpie el área alrededor de la cánula con un aplicador de algodón empapado en Betadine.Pase el hisopo por la tapa de la cabeza tres veces con Betadine y luego páselo con etanol dos veces. A continuación, coloque el microinyector lleno dentro de la cánula. Presione inicio en la bomba de microinyección y supervise el movimiento de la burbuja.Una vez finalizada la inyección, retire el microinyector de la cánula y sustitúyalo por el obturador. Esta figura muestra la transfección de la región de astrocitos del núcleo accumbens mediante virus microinyectado, y esta figura muestra la reducción de la motivación de las ratas para autoministrarse etanol al activar un transgén que se sobreexpresó en el núcleo accumbens. La activación de los astrocitos del núcleo accumbens mediante la administración sistémica de CNO redujo significativamente la motivación de las ratas para autoministrarse etanol tras la abstinencia, en comparación con el vehículo CNO, que no tuvo ningún efecto en una cohorte igualmente entrenada que expresaba GFP en lugar del transgén dread.Esta técnica puede permitir la personalización de instrumentos para microinyecciones cerebrales y una mayor flexibilidad en los procedimientos experimentales. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la ubicación precisa de la microinyección es fundamental para lograr el efecto deseado.

rodent-brain-microinjection-to-study-molecular-substrates-motivated

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

El seguimiento de los niveles de neurotransmisores extracelular en las regiones cerebrales distintas de animales libres de movimiento además de informaciones sobre el vínculo entre la liberación de neurotransmisores y la conducta. Microdiálisis in vivo, junto con detección electroquímica ofrece anatómica excelente y la resolución de químicos, así como información sobre cómo la neurotransmisión basal se ve alterada por las manipulaciones farmacológicas o fisiológicas.

La cirugía estereotáxica de supervivencia en los roedores

Fuente: Poland, R. et al. Microinyección de cerebro de roedores para estudiar sustratos moleculares del comportamiento motivado. J. Vis. Exp. (2015)En este video, se utiliza una configuración de microinyección llena de agua que consta de una jeringa y un tubo de microinyección para una administración precisa del medicamento. Una rata con una cánula guía preimplantada se somete a una microinyección cerebral dirigida, lo que permite la administración precisa de agentes terapéuticos en animales...

Administración basada en microinyección de un agente terapéutico en un cerebro de roedor despierto

Este protocolo describe el ensamblaje y el uso de un inyecturo para la administración precisa de fármacos en regiones específicas del cerebro de una rata anestesiada, seguido de la monitorización de la actividad neuronal a través de señales eléctricas registradas.

Microinyección de fármacos con registro electrofisiológico en el cerebro de una rata

Fuente: Paolone, G., et al. Agujas personalizadas para microinyecciones en el cerebro de roedores. J. Vis. Exp. (2018).Este video muestra una inyección de microagujas de cerebro de roedores utilizando una microaguja de cuarzo con agujeros. La microaguja se conecta a una jeringa y una microbomba para controlar la velocidad de administración. La aguja con la solución inyectable se inserta en el cerebro con la velocidad de administración establecida en baja. Una vez posicionado, se aumenta la...

Microinyección de cerebro de roedores con una microaguja de cuarzo

Los microARNs tienen funciones importantes en la estructura y función del cerebro. Aquí se describe un método para hacer cumplir miRNA hipocampo sobreexpresión mediante inyección estereotáxica de un lentivirus que expresan los genes miARN ingeniería. Este enfoque puede servir como una manera relativamente rápida para evaluar...

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento

En este artículo se describe cómo microinject vectores virales en el cerebro del ratón y luego probar en un paradigma de preferencia un lugar acondicionado que incluye una fase de adquisición, extinción y reintegro.

La microinyección estereotáxica de vectores virales que expresan Cre recombinasa para estudiar el papel de los genes diana de cocaína acondicionado Place Preferencia

Aquí, creamos una pipeta de vidrio con doble función: inhibición de estructuras cerebrales profundas mediante microinyecciones de fármacos y monitorización en tiempo real de sus efectos mediante registros electrofisiológicos simultáneos.

Grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores

Inyección estereotáctica de lentivirus que expresan los ADNc o shRNAs pueden modular la expresión génica en áreas específicas del cerebro de los ratones. A continuación, presentamos un protocolo para combinar inyecciones estereotáxica con las tareas de comportamiento, como la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST).

Aplicando estereotáctica Técnica de Inyección para el Estudio de los efectos genéticos sobre Comportamientos animales

Este procedimiento describe la recolección de regiones cerebrales congeladas discretas para obtener proteínas y ARN de alta calidad utilizando herramientas baratas y comúnmente disponibles.

Colección de regiones cerebrales de roedores congelados para análisis posteriores

Este protocolo describe la construcción de un sistema de microinyección de bajo costo, su implantación estereotáxica en estructuras cerebrales profundas y el procedimiento para microinyecciones cronometradas de tetrodotoxina en ratas despiertas y sin restricciones. El objetivo es revelar la participación de las estructuras hipotalámicas en la regulación de la ovulación mediante la inhibición de su actividad neuronal.

Desentrañando el papel de las áreas discretas del cerebro de la rata en la regulación de la ovulación a través de la inactivación reversible por microinyecciones de tetrodotoxina

Aprende microinyección cerebral en roedores despiertos para investigar sustratos moleculares del comportamiento y trastornos psiquiátricos. Este método permite la entrega precisa de reactivos en regiones cerebrales específicas.

Roedor cerebro microinyección para el Estudio de los sustratos moleculares de Comportamiento Motivado

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