Roedor cerebro microinyección para el Estudio de los sustratos moleculares de Comportamiento Motivado

El objetivo general de este procedimiento es fabricar con precisión una cánula y microinyectores, así como realizar correctamente la microinyección. Esto se logra fabricando primero una cánula a una longitud adecuada. El segundo paso es cortar y ensamblar los microinyectores.

A continuación, prepare los microinyectores, los tubos y una bomba para la microinyección. El paso final es completar la microinyección y dejar pasar un período de difusión. En última instancia, la microinyección se utiliza para inyectar reactivos con precisión en la región cerebral deseada, lo que demuestra un manejo adecuado.

Durante la microinyección estará Ryan Poland, un estudiante de mi laboratorio. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se debe tener especial cuidado y todos los pasos requieren una gran atención para garantizar la colocación adecuada de la cánula y la ubicación de la microinyección. Para preparar primero la cánula, dibuje una línea de referencia de 15 milímetros en la cinta con un bolígrafo de punta fina.

A continuación, utilícelo como guía para marcar las secciones de 15 milímetros secuencialmente en el tubo con un rotulador permanente afilado. A continuación, muesca el tubo de la cánula tocándolo con el disco de corte de giro lento de la herramienta rotativa. En los puntos marcados, gire la cánula 180 grados y haga una muesca en el lado opuesto del tubo.

No corte el tubo por completo porque puede provocar oclusión. Después, dobla bruscamente el tubo para romperlo en secciones de 15 milímetros. A continuación, sostenga cada extremo de la cánula perpendicular al disco de corte entre el pulgar y el índice.

Gire el tubo de la cánula mientras toca su punta con la superficie del disco de corte para generar una punta roma. A continuación, escarie ambos extremos de la cánula con una aguja biselada de calibre 26 para asegurarse de que se han eliminado todas las rebabas y de que la cánula no esté obstruida. Para preparar el obturador, pinje una cánula de aproximadamente la mitad de su longitud con hemostáticos rectos de peso medio, coloque el hemostático bloqueado en el banco de modo que la cánula quede perpendicular al banco.

A continuación, introduzca un extremo del alambre del ator en la cánula hasta que llegue al banco. Doble el alambre pellizcando con los dedos hasta lograr un ángulo de 30 grados mientras se mantiene el contacto entre el obturador y el banco. Después de eso, retire el alambre de la cánula y corte la porción sobrante a 2,5 milímetros de la curva con pequeños cortadores diagonales.

En este procedimiento, sostenga un extremo del tubo del microinyector perpendicularmente con un hemostático recto bloqueado. Gire un hemostático mientras mantiene la tensión en el tubo y enróllelo firmemente alrededor del hemostático al menos una vez. A continuación, mida 32 milímetros desde el extremo suelto opuesto del tubo del microinyector y sujete este punto perpendicularmente con un segundo hemostático.

Doble el tubo hacia adelante y hacia atrás mientras mantiene la tensión hasta que se rompa. A continuación, inspeccione el tubo del microinyector para asegurarse de que ambos extremos estén rectos y de que el diámetro interior no esté obstruido. Dibuje una línea de referencia de cinco milímetros en la cinta métrica y marque secuencialmente secciones de cinco milímetros del tubo de la cánula con un marcador permanente.

A continuación, toque el tubo de la cánula con el disco de corte de giro lento en los puntos marcados para hacer una muesca en el tubo. A continuación, doble bruscamente el tubo del collar del microinyector para romperlo en secciones de cinco milímetros. Deslice un collar en cada tubo del microinyector a unos dos centímetros del extremo.

Aplique una pequeña cantidad de superpegamento al tubo del microinyector a cinco milímetros de un extremo. A continuación, deslice el collar sobre la perla de superpegamento de modo que quede a un milímetro del extremo del tubo de microinyección. Después de eso, cubra ambos extremos del cuello con pegamento.

A continuación, coloque una aguja de calibre 26 en la jeringa de un mililitro llena de agua estéril. Y deslice la pieza de ocho centímetros del tubo de plástico del microinyector sobre la aguja, asegurándose de no perforar el tubo después de eso, deslice el otro extremo del tubo de plástico sobre el extremo del collar del microinyector seco. Empuje el émbolo de la jeringa lleno de agua para probar la patente C.In este paso, doble el microinyector completo a 15 milímetros desde el extremo opuesto al collar en 95 grados.

A continuación, corte el tubo de plástico a 70 centímetros y deslícelo sobre el collar del microinyector. Para preparar la bomba para la microinyección, ajuste el diámetro de la aguja de microinyección, la velocidad de infusión deseada y el volumen de inyección objetivo en el tubo. A continuación, ajuste el modo de bombeo al volumen para que se suministre automáticamente un volumen preciso.

A continuación, ajuste el tope trasero de la bomba para permitir que la jeringa se llene hasta el volumen de inyección más 0,2 microlitros adicionales. Ahora coloque la punta de la jeringa apretada en el agua estéril contenida en un pequeño bote de suero y agite suavemente el émbolo para lubricar el cable interno de manera uniforme. Tire del émbolo hasta el tope trasero de la bomba para llenar la aguja de microinyección con agua.

Siguiente diapositiva. El tubo de PE 20 que se conecta al microinyector en una aguja de calibre 26 unida a una jeringa llena de agua estéril de un mililitro. Rocíe agua estéril a través del microinyector e inspeccione el patrón y la distancia de rociado.

A continuación, coloque un microinyector esterilizado sobre un campo estéril. Deslice el tubo fuera de la aguja, corte el tubo por debajo del área dañada por la aguja mientras lo mantiene en posición vertical para evitar que el agua gotee. A continuación, empuje el émbolo de la jeringa del microinyector ligeramente hacia adelante para crear una gota en el extremo de la aguja y deslice el tubo de PE 20 lleno de agua sobre la aguja.

Después de eso, empuje el émbolo completamente hacia adelante para prepararse para la carga de la muestra y asegúrese de que no queden trazas de etanol en el microinyector. Verifique la configuración para ver si hay fugas tocando la gota de agua que se forma en la punta del microinyector con una toallita de laboratorio limpia varias veces. A continuación, tire del émbolo de la jeringa hacia atrás 0,2 microlitros para crear una burbuja entre el agua estéril y el tubo de PE 20 y la solución que se va a inyectar.

Después de eso, coloque el microinyector en el reactivo que se va a inyectar y tire lentamente del émbolo de la jeringa hasta el tope trasero. Para preparar al animal para la inyección, sostenga el pecho de la rata contra el pecho del experimentador. Limpie el área alrededor de la cánula con un aplicador de algodón empapado en Betadine.

Frote la tapa de la cabeza tres veces con Betadine y luego frote con etanol dos veces. A continuación, coloque el microinyector lleno en la cánula. Presione el botón de inicio de la bomba de microinyección y controle el movimiento de las burbujas.

Cuando se complete la inyección, retire el microinyector de la cánula y reemplácelo con el obturador. Esta figura muestra la transfección de la región de los astrocitos del núcleo accumbens por virus microinyectado, y esta figura muestra la reducción de la motivación de las ratas para autoadministrarse etanol mediante la activación de un transgén que estaba sobreexpresado en el núcleo accumbens. La activación de los sitios de los astrocitos centrales del pavor por la administración sistémica de CNO redujo significativamente la motivación de las ratas para autoadministrarse etanol después de la abstinencia en comparación con el CNO del vehículo, lo que no tuvo ningún efecto en una cohorte igualmente entrenada que expresaba GFP en lugar del pavor que una vez dominó.

Esta técnica puede permitir implementos de microinyección cerebral personalizados y una mayor flexibilidad de los procedimientos experimentales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la ubicación precisa de la microinyección es imprescindible para lograr el efecto deseado.