Una referencia Caldo método de microdilución para Dalbavancina In Vitro Pruebas de Susceptibilidad de bacterias que crecen en aerobiosis

El objetivo general del siguiente procedimiento es determinar la concentración mínima inhibitoria de dalbavancina. Usar el método de microdilución de caldo con un enfoque en los pasos clave que son exclusivos de Dalbavancin para hacer esto. La dilución caldo e intermedia de dalbavancina se realiza en DMSO y la dilución final se realiza en catión sobre caldo Mueller Hinton ajustado suplementado con polisorbato.

La dilución se dispensa en una placa de 96 pocillos y se inocula con una suspensión estandarizada de bacterias. A continuación, la placa se incuba durante 16 a 24 horas y se examina para determinar la cantidad mínima de dalbavancina necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano. La adherencia a este método estandarizado asegurará resultados consistentes con ambos aislados clínicos y, como se muestra aquí, aislados de control de calidad Dalbavancin es un agente antimicrobiano lipoglicopéptido semisintético que fue aprobado en mayo de 2014 por la FDA para el tratamiento de infecciones bacterianas agudas de la piel y la estructura de la piel causadas por organismos grampositivos.

Este método describe el caldo estandarizado, el método de susceptibilidad a la microdilución para dassin, que incluye el uso de DMSO para preparar soluciones madre en polisorbato 80 para aliviar la adherencia del agente al plástico. Como los pasos de preparación de la solución de culata y placa MIC no son típicos en comparación con la mayoría de los agentes antimicrobianos. Estos pasos son exclusivos de los agentes lipo glicopéptidos y es importante seguirlos para lograr resultados de CMI reproducibles y precisos.

demostración del procedimiento estará a cargo de Gina Fisher, una científica investigadora de mi laboratorio. Tenga en cuenta que se deben utilizar las precauciones de seguridad adecuadas de acuerdo con el nivel de bioseguridad dos al realizar el siguiente procedimiento. Comience pesando la cantidad adecuada de dalbavancina para preparar una solución madre de 800 microgramos por mililitro.

Agregue la cantidad adecuada de NEAT DMSO a un tubo estéril de vidrio o plástico, luego transfiera el polvo al tubo y vértice. Próximo. Usando la solución madre de DALBAVANCINA de 800 microgramos por mililitro, prepare 100 concentraciones finales de placa MIC como se muestra en las columnas uno a cuatro. Estas se conocen como concentraciones intermedias.

El volumen total preparado dependerá del número de paneles MIC. Finalmente, diluir las concentraciones intermedias de uno a 100 en caldo Mueller Hinten no ajustado por cationes, también conocido como C-A-M-H-B, suplementado con 0.004%P 80. La concentración de trabajo resultante de DALBAVANCINA y P 80 es el doble de la concentración final.

Dado que la adición de inóculo dará como resultado una dilución de uno a dos utilizando una pipeta multicanal con puntas estériles, dispense 50 microlitros de cada dilución de dalbavancina en los pocillos apropiados del panel de microdilución estéril de 96 pocillos. El formato de placa MIC permite analizar ocho oculares por placa. Si los paneles no se van a usar inmediatamente, aplique una película de plástico para sellarlos, luego colóquelos en bolsas de plástico y guárdelos en un congelador que no se descongele al menos a menos 60 grados centígrados hasta que se necesiten.

En esta demostración, se inoculará un plato recién preparado. Para preparar el inóculo, seleccione varias colonias bien aisladas de una barrena de sangre de 18 a 24 horas u otra placa de barrena no selectiva. En este caso, se utilizan muestras de control de calidad y cepas callosas EPHI.

Toque la parte superior de cada colonia con un hisopo estéril y transfiera parte de ella a un tubo que contenga de uno a cinco mililitros de C-A-M-H-B o solución salina. Continúe transfiriendo hasta que la turbidez coincida con un estándar de McFarland de 0.5 dentro de los 15 a 30 minutos posteriores a la preparación, diluya el inóculo de uno a 100 en C-A-M-H-B para llegar a una concentración final de cinco veces 10 a la quinta UFC por mililitro. El rango aceptable es de dos a ocho veces 10 a la quinta UFC por mililitro.

Inmediatamente, utilizando una pipeta multicanal con puntas estériles, transfiera 50 microlitros del inóculo final a cada pocillo apropiado de la placa del panel MIC aquí. Se inoculan cuatro filas con cada uno de los dos aislados para un total de cuatro réplicas por aislado. A continuación, para realizar una comprobación de pureza, utilice una pipeta para transferir de uno a 10 microlitros de la solución en el control de crecimiento positivo a un agar no selectivo, como el agar de soja de Try Decay con un 5% de sangre de oveja.

Use un asa estéril para esparcir la solución sobre la superficie de la placa. Gire la placa 90 grados y vuelva a rayar para asegurarse de que el inóculo se distribuya uniformemente. Cubre el plato y déjalo a un lado.

En preparación para un recuento de colonias, use una pipeta de un solo canal para transferir 10 microlitros de la solución en el pozo de control de crecimiento a 10 mililitros de mezcla salina, y luego transfiera 100 microlitros a un medio agrícola no selectivo adecuado, como probar agar de soja toay con 5% de sangre de oveja usando un circuito estéril, extienda la solución por toda la superficie agrícola. Repita este proceso dos veces en diferentes direcciones para asegurar una distribución uniforme del inóculo. A continuación, apile hasta cuatro paneles MIC en un recipiente de plástico asegurándose de que el panel superior esté herméticamente sellado con una tapa.

A continuación, coloque una toalla de papel húmeda dentro del recipiente de plástico y ciérrelo de forma segura con la tapa dentro de los 30 minutos posteriores a la inoculación. Incube los paneles MIC, la placa de recuento de colonias y la placa de control de pureza en una incubadora de aire ambiente a 35 más o menos dos grados Celsius durante 16 a 20 horas. Al día siguiente, lea la concentración inhibitoria mínima como la concentración más baja que inhibe completamente el crecimiento bacteriano en los pocillos, según lo detectado a simple vista.

Determine el número de colonias en la placa de conteo de colonias. Multiplica el número contado por el factor de dilución. Por ejemplo, 50 colonias por un factor de dilución de 10.000 es igual a cinco por 10 a la quinta UFC por mililitro.

Un rango aceptable es de 20 a 80 colonias, lo que equivale a dos a ocho veces 10 a la quinta colonia formando unidades por ml. La concentración del inóculo es una variable importante para controlar las pruebas de susceptibilidad con el fin de obtener resultados precisos. Por último, compruebe la placa de pureza.

Si todas las colonias son similares a las colonias utilizadas como inóculo, entonces se puede considerar puro. Si hay otras colonias presentes, entonces existe la posibilidad de que haya un contaminante en el panel de MIC y se debe repetir la prueba. Los resultados de DAL bevans, MIC se compararon con los obtenidos utilizando el método de dilución agrícola como se muestra aquí.

Los resultados de Agri MIC para Dal bevans suelen ser de dos a ocho veces más altos que los del caldo. Micro dilución, resultados de MIC. Este contraste resulta de la vancomicina, que se realiza por caldo y métodos agrícolas.

Por lo tanto, no se recomienda la dilución agrícola para analizar el caldo de dalbavancina. MIC de microdilución, los resultados para el control de calidad deben estar dentro de los rangos esperados como se muestra aquí. El organismo de control de calidad de las SS, A TCC 2 9 2 1 3 con una CMI modal muy clara de 0,06 microgramos por mililitro, ha sido un buen indicador de la variación del método.

Si los resultados obtenidos están fuera de los rangos esperados para los organismos de control de calidad o con una tendencia hacia el extremo inferior o superior del rango, se justifica una mayor validación del método. Además de validar el método utilizando organismos de control de calidad, dalbavancina, los datos de MIC de los programas regionales de vigilancia antimicrobiana pueden proporcionar una base para los resultados de MIC que se esperan en el entorno de laboratorio clínico, como se muestra aquí, Dal b Anson MIC, los resultados de los aislados recolectados en Europa y EE. UU. en 2011 a 2013 fueron inferiores a 0,25 microgramos por mililitro para el 99,9% de las SIU y el 100% de los estreptococos. Sobre la base de estos datos de vigilancia, es evidente que los resultados de la CMI de dalbavancina para estafilococos y estreptococos superiores a 0,12 microgramos por mililitro son raros.

Si se observan números más altos, se debe repetir la prueba y/o enviarla a un laboratorio de referencia para su validación. La preparación de la dilución de la culata en DMSO y la adición de P 80 a la dilución del caldo a una concentración del 0,002 % en el pocillo final de MIC son los pasos críticos para obtener resultados precisos y reproducibles de la CMI de dalbavancina Como siempre, pero especialmente en esta área del desarrollo de resistencia bacteriana, los resultados precisos de susceptibilidad a los antimicrobianos son fundamentales para la elección de la terapia adecuada por parte del médico.