Name: Una referencia Caldo método de microdilución para Dalbavancina In Vitro Pruebas de Susceptibilidad de bacterias que crecen en aerobiosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprenda el método de microdilución en caldo para determinar la concentración inhibitoria mínima de dalbavancin en bacterias Gram positivas. Este protocolo estandarizado garantiza resultados reproducibles y precisos en microbiología clínica.

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El trabajo previo con respecto a las pruebas de susceptibilidad de dalbavancina ha sido valioso en el desarrollo de métodos estandarizados y se da reconocimiento por este trabajo a JMI Laboratories, Robert Rennie y Beth Goldstein.

Nota: Consulte los documentos del CLSI M7-A10 y M100-S25 y / o ISO / FDIS 20776-1 para los detalles completos del método de referencia de caldo de microdilución para susceptibilidad antimicrobiana 2, 3, 4 Los métodos de referencia permiten opciones en algunos de los. procedimientos específicos para la preparación del inóculo y el panel MIC producción para lograr el mismo resultado final. El método detallado aquí se refiere a un agente antimicrobiano, dalbavancina, y algunos de los pasos representan potencialmente una de varias maneras el procedimiento de referencia se puede hacer. Precauciones de seguridad apropiada (en consonancia con el nivel de bioseguridad 2) se deben utilizar 10. El formato de panel MIC utilizado para el propósito de esta publicación de vídeo se muestra en la Tabla 1. 1. Tienda Dalbavancina Polvo <ol><li> Tras la recepción de diagnóstico polvo dalbavancina grado, almacenar a -20 ° C en un ambiente desecado en un congelador sin descongelar. Antes de su uso, el polvo debe equilibrar allegar a RT antes de abrir. </li></ol> 2. Prepare diluciones Panel MIC <ol><li> Preparar una solución madre no superior a 1.600 g / ml de dalbavancina ordenada en DMSO (puro) en tubos de vidrio o de plástico estériles, y el uso en el mismo día de la preparación o almacenar a -20 a -60 ° C o por debajo para su uso futuro en un congelador sin descongelar. Tome en cuenta la potencia de dalbavancina lo dispuesto en la documentación recibida con el polvo, al pesar el polvo (véase la ecuación 1, por ejemplo, 800 mg de preparación de pasta / ml). </li><li> Diluir la dilución Stock similar al esquema como se muestra en la columna 1 (&quot;Concentración Fuente&quot;) en la Tabla 2 con DMSO puro en tubos de vidrio o de plástico estériles. Utilice una pipeta para medir diluyente y otra pipeta para añadir el dalbavancina el stock inicial al primer tubo. Para cada una posterior concentración dalbavancina Stock utilizar una nueva pipeta. </li><li> Preparar 100X última concent panel de MICdiluciones de racionamiento (concentraciones intermedias) con DMSO puro. Como se muestra en las columnas 2-4 de la Tabla 2, combinar volúmenes apropiados de origen y DMSO para lograr concentración intermedia deseada (volúmenes que se utilizarán dependerá del número de paneles MIC a realizar). </li><li> Preparar 0,004% P80: Se prepara una solución madre de trabajo fresca del 2% P80 mediante la adición de 0,1 ml a 4,9 ml P80 H2Od Esterilizar pasando a través de un filtro y el uso solución de 0,22 micras en el mismo día de la preparación. Preparar 0.004% de diluyente P80 haciendo una dilución 1: 500 de 2% P80 (por ejemplo, 0,3 ml de 2% P80 a 149,7 ml de CAMHB). </li><li> Además diluir las concentraciones intermedio preparado en el Paso 2.2 1: 100 en catión ajustado Mueller Hinton caldo (CAMHB) suplementado con 0,004% (v / v) de polisorbato-80 (80 P) P-80 y / o LHB (por estreptococos) añadido al doble de la concentración final debido a la adición de inóculo (paso 4.3) se traducirá en una dilución 1: 2. Ver las columnas 6 y 7 de la Tabla 2 </strong&gt;. </li></ol> 3. Prepare los paneles MIC <ol><li> Dispensar 50 l de cada solución dalbavancina preparado en la etapa 2.3 en los pozos apropiados del panel de MIC e incluir los medios de comunicación sólo en un pocillo (control de crecimiento también). Una pipeta de múltiples canales con puntas estériles se puede utilizar para este paso. </li><li> Utilice los paneles inmediatamente o sellar con una película de plástico, colocar en bolsas de plástico y colocar inmediatamente en un congelador no descongelar a ≤-20 o C (preferiblemente a ≤-60 ° C) hasta que se necesite. Si se utilizan paneles congelados, retire los sellos y colocar paneles individuales de mesa de laboratorio durante 15-30 minutos (hasta que se descongelan contenidos así) antes de proceder al panel de la inoculación. </li></ol> 4. Inocular paneles MIC, Realizar Pureza y Colonia Configuración Conde <ol><li> Seleccione varias colonias bien aisladas de un agar sangre 18-24 hr u otra placa de agar no selectivo. Toque la parte superior de cada colonia con un asa estéril o hisopo y traslado a 1.5 ml CAMHB o saline hasta que la turbidez es equivalente a un estándar McFarland 0,5. Evaluar la turbidez por comparación visual al 0,5 McFarland o con un dispositivo fotométrico. </li><li> Dentro de 15-30 min de preparación, diluir el inóculo 1: 100 en CAMHB (100 l en 10 ml CAMHB). Para la mayoría de bacterias probadas contra dalbavancina, con la excepción de S. pneumoniae, esta dilución será así proporcionar una concentración final de 5 x 10 5 UFC / ml (intervalo aceptable a 2-8 x 10 5 CFU / ml). Para S. pneumoniae, concentración bacteriana basada en la comparación de la turbidez a un 0,5 McFarland es típicamente considerablemente menor, por lo tanto, diluir el inóculo 1:25 (400 l en 10 ml CAMHB + 10% + LHB). </li><li> Dentro de 15 min después de la preparación del inóculo, transferir 50 l de la inóculo final a cada pocillo (con excepción del control de la esterilidad también) del panel MIC preparada en el paso 3. Una pipeta multicanal usando puntas estériles se puede utilizar para este paso. </li><li> Realizar una comprobación de la purezamediante la transferencia y la difusión de una parte alícuota de 1 a 10 l del testigo de crecimiento positivo utilizando un asa estéril a un agar no selectivo (por ejemplo, agar tripticasa de soja con 5% de sangre de oveja). </li><li> Configuración de recuento de colonias mediante la eliminación de 10 l del control de crecimiento bien con un solo canal pipeta y la punta estéril y transferencia a 10 ml de solución salina (1: 1000 dilución). Mezclar y transferir 100 l con un solo canal pipeta y la punta estéril para un medio adecuado, no selectivo de agar (por ejemplo, agar tripticasa de soja con 5% de sangre de oveja) y se extendió sobre toda la superficie de agar con un asa estéril, repitiendo dos veces en diferentes direcciones para asegurar una distribución uniforme del inóculo (dilución 1:10). </li></ol> 5. Paneles Incubar MIC, Colonia Conde y placas Pureza <ol><li> Selle cada panel MIC o pila de no más de 4 paneles en una bolsa de plástico, con cinta de plástico o con una cubierta de plástico hermética antes de incubar. Como alternativa, coloque el panel MIC vacío en el top de la pila de no más de 4 paneles MIC, coloque una toalla de papel húmeda en un recipiente de plástico, paneles lugar de MIC en el recipiente de plástico y cerca de contenedores de forma segura con tapa. </li><li> Incubar paneles MIC en una incubadora de aire ambiente a 35 ° C ± 2 ° C durante 16-20 horas (estafilococos y enterococos) y 20 a 24 h (estreptococos) dentro de los 30 minutos de la inoculación. Incubar el recuento de colonias y placas de pureza en las mismas condiciones, excepto los estreptococos incubado en un incubador de CO2 al 5%. </li></ol> 6. Lea el MIC y Colonia Conde placas; Compruebe la Pureza Plate <ol><li> Lea el MIC como la concentración más baja que inhibe completamente el crecimiento bacteriano en los pozos detectada por el ojo humano. </li><li> Recuento de las colonias de la placa de recuento de colonias. Multiplicar cada colonia por factor de dilución (1: 10.000) (por ejemplo, 50 colonias es equivalente a 5 x 10 5 CFU / ml). Un rango aceptable es de 20-80 colonias (2-8 x 10 5 UFC / ml) y se utiliza como un aprodirectriz ximate. </li><li> Compruebe la placa de pureza. Si todas las colonias son similares a las colonias utilizados en el paso 4.1, entonces el inóculo puede ser considerado puro. Si hay otras colonias presentes, entonces existe la posibilidad de un contaminante esté presente en el panel de MIC y la prueba debe repetirse. </li></ol> 7. Verificar resultados de control de calidad. <ol><li> Consulte la Tabla 3 para los rangos esperados de las cepas de control de calidad del CLSI. Sólo informar los resultados de la prueba de los aislamientos si los resultados de CIM para dalbavancina organismo (s) de control de calidad se encuentran dentro del rango esperado. </li><li> Si se obtiene una MIC de ≥0.25 mu g / ml para cualquier S. clínica aureus aislar, repita la prueba MIC dalbavancina y / o enviar a un laboratorio de referencia para la verificación. </li></ol>

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</ol>

Sandra McCurdy es un empleado de Durata Terapéutica; Especialistas de Laboratorio, Inc., patrona de Laura Koeth y Jeanna Fisher, fue contratado por Durata Terapéutica para preparar el manuscrito. Tasas de publicación para este artículo fueron pagados por Especialistas de Laboratorio, Inc.

Los siguientes detalles de método se presentan consideraciones adicionales en la preparación para las pruebas de MIC dalbavancina. El diseño del panel MIC dependerá del número de agentes antimicrobianos a ensayar (es decir., Dalbavancina solo o múltiples agentes) y las especies de bacterias a ensayar. Las concentraciones dalbavancina deben abarcar los puntos de corte de interpretación para todas las especies bacterianas a ensayar y toda la gama de diluciones esperados durante al menos una cepa de control de calidad. La serie de dilución antimicrobiana puede ser organizada ya sea en filas o columnas en función del número de agentes antimicrobianos y / o aislados / placa y el método de la inoculación. El volumen de polvo dalbavancina y el caldo debe calcularse para asegurar que las cantidades óptimas son producidos y de los residuos es mínima. Para el ejemplo usado en esta publicación, los volúmenes se basan en preparación de dos paneles MIC. Cationes ajustados caldo Mueller Hinton debe estar preparado y en autoclave de acuerdo con el hombreinstrucciones y la esterilidad de los medios de ufacturer verificados. Paneles MIC se pueden hacer y se utilizan en el mismo día de la preparación o pueden ser probados con los organismos de control de calidad apropiados y los paneles validados almacenados congelados para uso futuro. Es importante utilizar técnicas estériles durante todo el procedimiento. No hay criterios estrictos para la verificación de la concentración de inóculo con recuentos de colonias. Recuentos de colonias pueden ser revisados ​​inicialmente para cada especie probados y / o periódicamente para validar el paso de dilución efectuada en el paso 4.2. Es importante que la validez de la norma McFarland 0.5 también se comprueba rutinariamente con E. coli ATCC 25922 usando un procedimiento similar al paso 4.5. Si los resultados no son equivalentes a 1.2 x 10 8 UFC / ml, se debe obtener un nuevo estándar McFarland 0,5. Si los recuentos de colonias de pozos MIC están fuera del rango aceptable (2-8 x / resultados ml y CIM 10 5 UFC para el aislado clínico (s) puede variar en cada ªe esperada distribución normal (por ejemplo. 0,03 a 0,12 ug / ml para S. aureus) y / o resultados de CIM para el aislado de control de calidad (s) están fuera de los rangos esperados, las pruebas de validación es necesaria y la modificación de métodos puede estar justificada. Se sugiere que un estándar McFarland 0,5 validado se utiliza para repetir el count (s) de la colonia y si los resultados son de nuevo fuera de los resultados esperados, la dilución del inóculo tal como se realiza en el paso 4.2 se debe ajustar en consecuencia y el MIC repite. Tenga en cuenta que un cheque pureza es necesario incluso si un recuento de colonias se realiza debido a que el procedimiento de recuento de colonias utiliza un volumen diluida que no se puede detectar necesariamente menores concentraciones de microorganismos contaminantes. Para una prueba de MIC se considere válida, el crecimiento aceptable debe ocurrir en el control del crecimiento también. Para la mayoría de las bacterias que se pondrá a prueba en contra dalbavancina (es decir., Estafilococos, estreptococos y enterococos, el crecimiento se verá como un botón (típicamente&gt; 2 mm) y menos frequently, el crecimiento puede aparecer como turbidez en el pozo. A diferencia de algunos agentes antimicrobianos que pueden presentar trailing efecto que las concentraciones aumentan, los puntos finales dalbavancina son bien definidos. Hay varios dispositivos de visualización destinadas a facilitar pruebas de microdilución de lectura, que se pueden usar para leer placas que contienen dalbavancina, siempre y cuando no hay compromiso en la capacidad de discernir el crecimiento en los pocillos. Los pasos críticos en el protocolo están relacionadas con las partes del procedimiento que están relacionados con la solubilidad de dalbavancina y la adición de P80. Es importante que la concentración máxima de dalbavancina utilizado es no mayor de 1,600 g / ml, que el DMSO se usa como un disolvente y que las concentraciones de intermedios se preparan en DMSO antes de hacer las diluciones de caldo de modo que la concentración final de DMSO en el MIC panel de pozos no es mayor que 1%. DMSO es higroscópico y, por tanto, el uso de botellas más antiguas de DMSO era un EXAMENde iones con respecto a la solubilidad dalbavancina. Sin embargo, mientras que un estudio de la densidad mineral ósea pequeña con cepas de control de calidad ha demostrado que esto no sea una variable importante (ver sección de resultados), es una buena práctica utilizar botellas de DMSO nuevos o recientemente abiertos. También es importante que P80 se añade al caldo en la etapa final de la preparación de dilución de fármaco y está a una concentración final de 0,002% en el MIC también. El procedimiento de la DMO incluye aquí utiliza preparación de paneles MIC utilizando 50 l / pocillo en dalbavancina y P-80 concentraciones dos veces la concentración final y la adición de inóculo con 50 l / pocillo de manera que el volumen final / pocillo es de 100 microlitros. Este método permite a un formato de panel MIC que deben prepararse para la prueba de ambos S. aureus y S. pneumoniae porque la sangre de caballo lisada se puede añadir al inóculo. Los métodos alternativos para la preparación de paneles MIC utilizando 100 l / pocillo con la adición de hasta 10 l / pocillo se describen en laProcedimientos CLSI e ISO. El punto de ruptura susceptibles dalbavancina para S. aureus es ≤0.12 mg / ml (FDA prospecto). Como se muestra en la vigilancia reciente, la mayoría de los aislamientos son inhibidas por Dalbavancina a niveles de 0,06 g / ml 15. Con un punto de interrupción susceptible cerca de la MIC modal, cualquier variación en MIC como resultado de las diferencias de método puede afectar las tasas de susceptibilidad. Debido a que el procedimiento de la DMO para dalbavancina incluye algunos pasos únicos (en concreto, el uso de DMSO en la preparación de acciones y diluciones de fármaco intermedios y 0,002% P80 en el MIC bien, es imperativo que el método se sigue exactamente. El organismo S. aureus QC (ATCC 29213) con una muy clara MIC modal dalbavancina de 0,06 g / ml, ha sido un buen indicador de la variación de método y debe utilizarse de forma rutinaria para validar el método de la DMO. Si los resultados de CIM están con el rango esperado de 0,03 hasta 0,12 mg / ml, pero están en tendencia ya sea a la baja o high lado de este rango, mayor validación del método se justifica. Se recomienda la adición de 0,002% P80 para todos los organismos Gram-positivas relevante (staphylococcci, enterococos y estreptococos.) Sin embargo, hay que destacar que se ha demostrado que lisadas sangre de caballo actúa similar a P-80 en relación con sus propiedades anti-unión capacidad y que la adición de P-80 a CAMHB + LHB no tiene ningún efecto adicional sobre los resultados de CIM estreptococos dalbavancina. Actualmente no hay ningún método de difusión en disco para la prueba dalbavancina y debido a la pobre correlación de DMO y los resultados de AD, las pruebas de sensibilidad de dalbavancina utilizando el método de AD no se recomienda 12, 14. El método de la DMO se debe utilizar para la futura evaluación de la susceptibilidad dalbavancina y como método de referencia para el desarrollo de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana comerciales.

Dalbavancina es un lipoglicopéptido semi-sintético que fue aprobado por la FDA en mayo de 2014 en el tratamiento de infecciones de la piel y la estructura de la piel bacterianas agudas causadas por organismos Gram-positivas 1. El principal objetivo de detallar este método en un formato de vídeo es proporcionar una orientación clara a los científicos de laboratorio y la investigación clínica para las pruebas y la notificación de los resultados de sensibilidad dalbavancina exactos y reproducibles. La determinación de un agente antimicrobiano MIC por métodos comerciales se realiza rutinariamente en los laboratorios clínicos para la evaluación de la actividad de un agente in vitro contra bacterias patógenas. El método aquí descrito es el método de microdilución en caldo según lo recomendado por CLSI e ISO 2,3,4. Desde dalbavancina métodos de susceptibilidad comerciales no están disponibles actualmente (en el momento de esta publicación) y de difusión en disco y los métodos de dilución en agar no se recomiendan actualmente fo dalbavancina, métodos de dilución de caldo de referencia son las opciones actuales disponibles 12,14. Como este método de referencia no es un comercial y aprobado por la FDA método de diagnóstico in vitro, los laboratorios clínicos en los EE.UU. que utilizan este procedimiento para las pruebas de los pacientes deben cumplir con los requisitos reglamentarios para una prueba desarrollada laboratorio (LDT). Se prevé que como el uso dalbavancina aumenta, más laboratorios tendrán una necesidad de probar este compuesto. Pruebas de vancomicina como un sustituto para la determinación de la susceptibilidad de S. dalbavancina aureus ha sido validado 5. Sin embargo, dalbavancina puede ser activo frente a la vancomicina intermedia S. aureus (VISA) y por lo tanto, los médicos pueden solicitar resultados de CIM dalbavancina. Además, los resultados de CIM para otras especies bacterianas pueden ser solicitados. El punto de interrupción susceptible FDA para dalbavancina contra S. aureus se ha establecido en ≤0.12 mu g / ml. FDA asignado solamente un suscepticategoría ble debido a la falta de datos sobre cepas resistentes. La distribución normal MIC entre los de tipo salvaje S. aureus aislados es de entre 0,03 a 0,12 mg / ml, con una clara MIC modal de 0,06 g / ml. Una ligera variación en los resultados de CIM debido a la diferencia método, además de la variación inherente BMD de ± una dilución, lo que potencialmente podría tener un impacto significativo sobre las tasas de susceptibilidad. 6 De manera similar a otros agentes lipoglicopéptido, las pruebas de sensibilidad dalbavancina puede ser un reto como resultado de solubilidad y el tamaño relativamente grande de la molécula y sus propiedades de unión 7,8,9. El método BMD referencia aquí descrita incluye dos pasos específicos que son únicos a los agentes insolubles y / o agentes lipoglicopéptido: (1) el uso de DMSO para la preparación de las soluciones madre y (2) la adición de 0,002% P-80 en el panel MIC definitiva diluciones. El objetivo de esta publicación es de vídeo para proporcionar claridad al método BMD dalbavancina y para specificaLLY centrarse en estos pasos clave, para asegurar resultados de CIM exactos y reproducibles.

<table><tbody><tr><td>Dalbavancin</td><td>Metrics, Inc.</td><td>Greenville, NC</td><td>BI-397</td></tr><tr><td>Vancomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>St. Louis, MO</td><td>C5793</td></tr><tr><td>Caldo Mueller Hinton ajustado a cationes</td><td>Becton Dickinson</td><td>Sparks, MD</td><td>212322</td></tr><tr><td>Sangre de caballo lisada</td><td>Cleveland Scientific</td><td>Bath, OH</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica Dose-it</td><td>Integra Biosciences</td><td>Hudson, NH</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (Viaflo II)</td><td>Integra</td><td>Hudson, NH</td><td>4164</td></tr><tr><td>pipeta de 12 canales (Matrix)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de un solo canal (Ovation 10 y micro; l - 100 y micro; l)</td><td>VistaLab</td><td>Brewster, NY</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>Monroe, NC</td><td>650161</td></tr><tr><td>50 ml de tubos de centrífuga de fondo cónico con tapa plana</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>16x125 mm tubos de vidrio desechables</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>12x17 mm tapón a presión, tubos de poliestireno</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 16 ml</td><td>BioExpress</td><td>Kaysville, UT</td><td>C-3394-2</td></tr><tr><td>Depósitos de reactivos</td><td>Integra Biosciences</td><td>Hudson, NH</td><td>4312</td></tr><tr><td>Estérilel desechableLoops (1 &micro; l & 10 y micro; l)</td><td>Biologix</td><td>Lenexa, KA</td><td>65-0001,65-0010</td></tr><tr><td>Agar de soja tríptico + 5% de sangre de oveja</td><td>Becton Dickinson</td><td>Sparks, MD</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora (ambiente)</td><td>Incubadora Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5% CO2)</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Guantes</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td>52817</td></tr><tr><td>Batas de</td><td></td><td></td><td></td> laboratorio</tr></tbody></table>

una referencia caldo método de microdilución para dalbavancina<em&gt; in vitro</em&gt; pruebas de susceptibilidad de bacterias que crecen en aerobiosis

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (AST) se lleva a cabo para evaluar la actividad in vitro de agentes antimicrobianos contra diversas bacterias. Los resultados de AST, que se expresan como concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) se utilizan en la investigación para el desarrollo de los antimicrobianos y la supervisión del desarrollo de resistencia y en el ámbito clínico como guía la terapia antimicrobiana. Dalbavancina es un agente antimicrobiano lipoglicopéptido semi-sintético que fue aprobado en mayo de 2014 la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para el tratamiento de infecciones de la piel y la estructura de la piel bacterianas agudas causadas por organismos Gram-positivos. La ventaja de dalbavancina sobre las terapias anti-estafilocócicas actuales es su larga vida media, lo que permite la dosificación una vez por semana. Dalbavancina tiene actividad frente a Staphylococcus aureus (incluyendo tanto el S. aureus [MSSA] y resistente a la meticilina S. aureus [MRSA] sensible a meticilina), estafilococos coagulasa negativos, <em&gt; Streptococcus pneumoniae, Streptococcus grupo anginosus, estreptococos β-hemolítico y vancomicina enterococos susceptibles. Similar a otros agentes lipoglicopéptido recientes, la optimización de métodos de ensayo de susceptibilidad CLSI y el caldo ISO incluye el uso de sulfóxido de dimetilo (DMSO) como disolvente en la preparación de las soluciones madre y polisorbato 80 (P80) para aliviar la adherencia del agente de plástico. Antes de los estudios clínicos y durante el desarrollo inicial de dalbavancina, los estudios de susceptibilidad no se llevaron a cabo con el uso de P-80 y los resultados de CIM tendían a ser 2-4 veces mayor y de manera similar más alta MIC resultados se obtuvieron con el método de la susceptibilidad de dilución en agar. Dalbavancina se incluyó por primera vez en CLSI mesas metodología microdilución caldo en 2005 y enmendada en 2006 para aclarar el uso de DMSO y P-80. El procedimiento de microdilución en caldo (BMD) se muestra aquí es específico para dalbavancina y está en conformidad con los métodos CLSI e ISO, con el detalle paso a paso y FOCnosotros en los pasos críticos añadido para mayor claridad.

Métodos MIC estandarizados son necesarias a fin de supervisar el desarrollo de resistencia, un objetivo importante de los diversos programas de vigilancia de antimicrobianos. Resultados Dalbavancina MIC para aislamientos colectados en Europa y EE.UU. en 2011-2013 eran &lt;0,25 mg / ml para el 99,9% de S. aureus y el 100% de los estreptococos (Tabla 4). Para evaluar la importancia de utilizar fresca (sellado) DMSO, pruebas por triplicado de los PRM DMO dalbavancina para QC cepas de S. aureus ATCC 29213, y E. faecalis ATCC 29212 y duplicar pruebas para S. pneumoniae ATCC 49619 se ha realizado mediante (1) DMSO de ampollas sellados, (2) DMSO de una botella de 1 L que estaba dentro de la fecha de caducidad y que había sido utilizado anteriormente para 2 años y (3) una parte alícuota de DMSO de la misma 1 L botella (muestra 2), que se dejó reposar en un vaso de precipitados abierto durante 72 horas antes de su uso. Dalbavancina resultados de CIM utilizando paneles hechos con las tres muestras de DMSO fueron similares y wentro de los rangos aceptables de control de calidad (Tabla 5). La pérdida de actividad dalbavancina después de la exposición de la solución madre de plástico y sin la adición de P-80 ha sido bien documentado 7. En 2 estudios adicionales, la adición de P-80 a las soluciones madre iniciales e intermedias (Tabla 6) y el uso de tubos de vidrio o de plástico para la preparación de las soluciones madre iniciales e intermedias (Tabla 7) no tuvo un efecto sobre la los resultados de CIM dalbavancina. También hubo ningún efecto sobre los resultados de CIM dalbavancina cuando se utilizaron polipropileno y poliestireno placas de tres fabricantes (Tabla 7). La presencia de sangre de caballo lisada en los medios de caldo para las pruebas de los estreptococos se ha demostrado que tienen una actividad de tipo tensioactivo, comparable a P-80 7, 8. El método de referencia dalbavancina para Streptococcus Qué incluye tanto sangre de caballo P-80 y se lisaron ,Sin embargo, a diferencia de estafilococos y enterococos, dalbavancina resultados de CIM para los estreptococos son similares (dentro de +/- 1 dilución) con y sin la adición de P-80. Como se ha presentado y se muestra en la Figura 1 previamente, de dilución en agar dalbavancina (AD) MICs son típicamente 2 a 8 veces mayor en comparación con la corriente de referencia BMD 12, 13, 14. A diferencia de la DMO, la adición de 0,002% P-80 no lo hace afectar AD dalbavancina MIC como resultado 12. <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028eq1.jpg" /> Ecuación 1: Ejemplo de Dalbavancina Stock Solution Preparación pasos de preparación para 25 ml de 800 mg / ml solución dalbavancina.. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028fig1.jpg" /> Figura 1. Comparación de Dalbavancina y vancomicina DMO a AD. Los resultados del estudio que comparó dalbavaNCIN y vancomicina DMO y AD MIC resultados para seleccionar cepas bacterianas Gram-positivas. Media (A) Dalbavancina y (B) La vancomicina microdilución en caldo y agar Dilución MIC Los resultados en mg / ml para 15 Staphylococcus aureus, 8 estafilococos coagulasa negativos (CNS), 5 Enterococcus faecalis y 14 estreptococos (Grupos A, B, y C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53028/53028fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> LA </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL; 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> B </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> C </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> D </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> E </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td&gt; <td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> F </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> G </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 00.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> H </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0.015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0.06 </td><td> DAL 0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> DAL </td><td colspan="2"> Dalbavancina </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td&gt; </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="12"> Las concentraciones se expresan en g / ml después de 50 l / pocillo de inoculación </td></tr></tbody></table> Tabla 1. MIC Plate Formato. La muestra la ubicación formato de placa de 96 pocillo de diluciones dalbavancina y pocillos de control positivo utilizado como ejemplo en esta publicación de vídeo <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Conc Fuente. (g / ml) </td><td> Volumen Fuente (ml) </td><td> DMSO Volumen (ml) </td><td> Intermedio Conc. en DMSO (g / ml) </td><td> Volumen Intermedio Conc. (ml) </td><td> CAMHB Volumen + 0,004% P80 * (ml) </td><td> 2X Conc. Después de 1: 100 dilución en CAMHB (g / ml) </td><td> Concentración Final Grupo. Después de la inoculación (g / ml) </td></tr><tr><td> 800 </td><td> 1.0 </td><td>1.0 </td><td> 400 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 4 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 200 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0.5 </td><td> 15 </td><td> 100 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0.5 </td><td> 3.5 </td><td> 50 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 25 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.25 </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.5 </td><td> 15 </td><td> 12.5 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,125 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.5 </td><td> 3.5 </td><td> 6.25 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0.5 &lt;/ td&gt; <td> 0.5 </td><td> 3.13 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0.5 </td><td> 15 </td><td> 15 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0.5 </td><td> 3.5 </td><td> 0.8 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,008 </td><td> 0,004 </td></tr><tr><td> 0.8 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,004 </td><td> 0,002 </td></tr><tr><td colspan="5"> Esta tabla ha sido modificado desde CLSI M100-S25, la Tabla 8B 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 2. Esquema para la preparación de diluciones de agentes antimicrobianos insolubles en agua que se utiliza en caldo Prueba diluciones susceptibilidad. Los volúmenes de las soluciones de trabajo dalbavancina y diluyentes para la preparación de MIC definitivasoluciones Dalbavancina de 0,002 a 2 g / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> La cepa de control de calidad </td><td> Esperado Dalbavancina MIC (mg / ml) </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,008-0,03 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. esperado Dalbavancina MIC Resultados para cepas de control de calidad 3, 11. Los resultados de control de calidad del CLSI para cepas sugeridas a ensayar junto con aislados clínicos con el fin de verificar la metodología adecuada <img alt="Tabla 4" src="/files/ftp_upload/53028/53028table4.jpg" /> Tabla 4. Distribución de Dalbavancina Resultados MIC (Número en cada MIC) de EE.UU. y Europa 2011 a 2.013 SurveillANCE Estudio 15. Dalbavancina resultados de CIM de un estudio publicado de aislados clínicos recientes como un indicador de dalbavancina actual actividad in vitro. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup></colgroup><tbody><tr><td rowspan="2"> Aislar # </td><td colspan="3"> Dalbavancina MIC (mg / ml) </td></tr><tr><td> DMSO 1 </td><td> DMSO 2 </td><td> DMSO 3 </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0.12 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.12 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td rowspan="2"><em&gt; S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 1 = llama sin abrir sellado 10 ml ampollas </td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO 2 = botella 1L abierto frecuentes </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 3 = botella 1L abierto frecuentes - se sentó en el banco en vaso de precipitados destapado durante 72 horas </td></tr></tbody></table> Tabla 5. Resultados Dalbavancina MIC (mg / ml) utilizando DMSO Stock y el Intermedio diluciones Preparación con DMSO de 3 fuentes. Los resultados de un estudio que comparaba MIC dalbavancina efecto del uso de diferentes disolventes de DMSO en la preparación de las acciones dalbavancina y diluciones intermedias. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Aislar Número </td><td rowspan="2"> Replicar Número </td><td colspan="2"> Dalbavancina MIC (mg / ml) </td></tr><tr><td> Dalb w / P80 en DMSO </td><td> Dalb w / o P80 en DMSO </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> S. aureus DP80-002SA clínica </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 700699 </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td>S. pyogenes clínicos: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-004PY </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-005PY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-006PY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-007PY </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-008PY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> S. agalactiae clínica: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-009AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.12 </td></tr><tr><td> DP80-010AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-011AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> DP80-012AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> S. dysgalactiae clinical DP80-013DY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae clínica: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-014SP </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> DP80-015SP </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-016SP </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-017SP </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr></tbody></table> Tabla 6. Resultados Dalbavancina MIC utilizando DMSO Stock e Intermedio diluciones Preparación con y sin 0,002% P-80. Resultados de un estudio MIC dalbavancina que comparó el efecto de la adición de 0,002% P-80 a dalbavancina acciones y diluciones intermedias. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="3"> Aislar </td><td rowspan="3"> Replicar Número </td&gt; <td colspan="4" rowspan="2"> Stock dilución Tubos </td><td colspan="4"> Placa de microtitulación (tipo de plástico) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Poli-propileno, Greiner </td><td colspan="3"> Poliestireno </td></tr><tr><td> Vaso </td><td> Plástico </td><td> 1 hora de plástico </td><td> 1hr Plástico / 1 hora Intermedio </td><td> Greiner </td><td> Corning </td><td> Nunc </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td&gt; 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td rowspan="2"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td colspan="10"> Glass = valores iniciales recogidas en botella de vidrio, utilizado inmediatamente para hacer la concentración intermedias en tubos de plástico, que se utiliza de inmediato para hacer diluciones caldo. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plástico = Inicial social realizado en tubo de centrífuga de plástico, se utiliza inmediatamente para hacer concentraciones intermedias en tubos de plástico, que se utiliza de inmediato para hacer diluciones caldo. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plástico 1 hr = valores inicial realizado en tubo de centrífuga de plástico, deje reposar en el banco durante 1 hora y luego se utiliza para hacer concentraciones intermedias en tubos de plástico, que se utiliza de inmediato para hacer concentraciones en caldo. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plástico 1 hora / Intermedio 1 hr = valores inicial realizado en tubo de centrífuga de plástico, deje reposar en el banco durante 1 hora y luego se utiliza para hacer concentraciones intermedias en tubos de plástico, deje reposar en el banco durante 1 hora y luego se utiliza para hacer concentraciones en caldo. </td></tr></tbody></table> Tabla 7. Resultados Dalbavancina MIC utilizando diluciones de la preparación en plástico y vidrio Tubos y MIC Tipos de plástico Plate. Resultados ofa dalbavancina estudio MIC que comparó efecto del uso de tubos de plástico o de vidrio en la preparación de las soluciones madre y también efecto del uso de diferentes fuentes y tipos de plástico para placas de microtitulación.

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de la susceptibilidad a la dalbavancina de bacterias Gram-positivas clínicamente relevantes utilizando una metodología de referencia de microdilución de caldo.

Una referencia Caldo método de microdilución para Dalbavancina<em&gt; In Vitro</em&gt; Pruebas de Susceptibilidad de bacterias que crecen en aerobiosis

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

El objetivo general del siguiente procedimiento es determinar la concentración inhibitoria mínima para dalbavancina. Para ello, se utiliza el método de microdilución en caldo, centrándose en los pasos clave que son únicos para dalbavancina. Las soluciones stock y las diluciones intermedias de dalbavancina se preparan en DMSO, y las diluciones finales se realizan en caldo Mueller Hinton ajustado en cationes y suplementado con polisorbato.Las diluciones se dispensan en una placa de 96 pocillos e inoculan con una suspensión estandarizada de bacterias. Luego, la placa se incuba durante 16 a 24 horas y se examina para determinar la cantidad mínima de dalbavancina necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano. El cumplimiento de este método estandarizado garantizará resultados consistentes tanto con aislamientos clínicos como, como se muestra aquí, con aislamientos de control de calidad. La dalbavancina es un agente antimicrobiano lipoglicopéptido semisintético que fue aprobado en mayo de 2014 por la FDA para el tratamiento de infecciones bacterianas agudas de la piel y de las estructuras cutáneas causadas por organismos grampositivos.Este método describe el método estandarizado de susceptibilidad en caldo por microdilución para dassin, que incluye el uso de DMSO para preparar soluciones stock en polisorbato 80 con el fin de reducir la adherencia del agente al plástico. La demostración visual de este método resulta útil, ya que los pasos para la preparación de las soluciones stock y de la placa de CMI no son típicos en comparación con la mayoría de los agentes antimicrobianos. Estos pasos son específicos de los agentes lipoglicopéptidos y es fundamental seguirlos para obtener resultados de CMI reproducibles y precisos.La procedura será demostrada por Gina Fisher, una científica investigadora de mi laboratorio. Tenga en cuenta que deben utilizarse las precauciones de seguridad adecuadas, consistentes con el nivel de bioseguridad dos, al realizar el siguiente procedimiento. Comience pesando la cantidad apropiada de dalbavancina para preparar una solución stock de 800 microgramos por mililitro.Agregue la cantidad adecuada de DMSO NEAT a un tubo estéril de vidrio o plástico, luego transfiera el polvo al tubo y vortexéelo. A continuación, utilizando la solución stock de DALBAVANCINA a 800 microgramos por mililitro, prepare concentraciones intermedias 100 veces mayores que la concentración final de la placa de MIC, como se indica en las columnas uno a cuatro. Estas se denominan concentraciones intermedias.El volumen total preparado dependerá del número de placas de CMI. Finalmente, diluya las concentraciones intermedias en un rango de uno a 100 en caldo Mueller Hinton sin ajustar cationes, también conocido como C-A-M-H-B, suplementado con 0,004 % P 80. La concentración de trabajo resultante de DALBAVANCIN y P 80 es el doble de la concentración final.Dado que la adición del inóculo provocará una dilución de uno a dos, utilice una pipeta multicanal con puntas estériles y dispense 50 microlitros de cada dilución de dalbavancina en los pozos correspondientes del panel de microdilución estéril de 96 pozos. El formato de placa de CMI permite probar ocho inóculos por placa. Si los paneles no se van a usar inmediatamente, séllelos con una película plástica, colóquelos en bolsas plásticas y almacénelos en un congelador sin descongelación a al menos menos 60 grados Celsius hasta que sean necesarios.En esta demostración, se inoculará una placa recién preparada. Para preparar el inóculo, seleccione varias colonias bien aisladas de una placa de agar sangre de 18 a 24 horas u otra placa de agar no selectivo. Aquí, se utilizan cepas de control de calidad de s aria y cepas de callos EPHI.Toque la parte superior de cada colonia con un hisopo estéril y transfiera una muestra a un tubo que contenga de uno a cinco mililitros de C-A-M-H-B o solución salina. Continúe transfiriendo hasta que la turbidez coincida con un estándar de McFarland 0,5 dentro de los 15 a 30 minutos posteriores a la preparación; luego, diluya el inóculo de uno a 100 en C-A-M-H-B para obtener una concentración final de cinco veces 10 a la quinta UFC por mililitro. El rango aceptable es de dos a ocho veces 10 a la quinta UFC por mililitro.Utilizando inmediatamente una pipeta multicanal con puntas estériles, transfiera 50 microlitros del inóculo final a cada pocillo adecuado de la placa del panel de CMI aquí. Cuatro filas se inoculan con cada uno de los dos aislamientos, para un total de cuatro réplicas por aislamiento. A continuación, para realizar una verificación de pureza, utilice una pipeta para transferir de uno a 10 microlitros de la solución en el control de crecimiento positivo a un agar no selectivo, como agar de soya tripticasa con 5% de sangre de oveja.Utilice un asa estéril para extender la solución sobre la superficie de la placa. Gire la placa 90 grados y realice estrías nuevamente para asegurar que el inóculo se distribuya uniformemente. Tape la placa y déjela aparte.Como preparación para el recuento de colonias, utilice una pipeta de canal único para transferir 10 microlitros de la solución del pocillo de control de crecimiento a 10 mililitros de solución salina, y luego transfiera 100 microlitros a un medio de agar no selectivo adecuado, como agar de soya tripticasa con 5% de sangre de oveja, usando un asa estéril, y esparza la solución sobre toda la superficie del agar. Repita este proceso dos veces en direcciones diferentes para asegurar una distribución uniforme del inóculo. A continuación, apile hasta cuatro placas de CMI en un recipiente de plástico, asegurándose de que la placa superior esté bien sellada con una tapa.Luego, coloque una toalla de papel húmeda dentro del recipiente de plástico y ciérrelo firmemente con la tapa dentro de los 30 minutos posteriores a la inoculación. Incube las placas de concentración inhibitoria mínima, la placa de recuento de colonias y la placa de control de pureza en un incubador con aire ambiente a 35 ± 2 °C durante 16 a 20 horas. Al día siguiente, lea la concentración inhibitoria mínima como la concentración más baja que inhibe completamente el crecimiento bacteriano en los pocillos, según se detecte a simple vista.Determine el número de colonias en la placa de recuento de colonias. Multiplique el número contado por el factor de dilución. Por ejemplo, 50 colonias multiplicadas por un factor de dilución de 10,000 equivalen a cinco por 10 a la quinta UFC por mililitro.Un rango aceptable es de 20 a 80 colonias, lo que equivale a dos a ocho veces 10 a la quinta unidades formadoras de colonias por ml. La concentración del inóculo es una variable importante para controlar la prueba de susceptibilidad con el fin de obtener resultados precisos. Finalmente, verifique la placa de pureza.Si todas las colonias son similares a las colonias utilizadas como inóculo, entonces se puede considerar que son puras. Si hay otras colonias presentes, existe la posibilidad de que haya un contaminante en el panel de CMI y se debe repetir la prueba. Los resultados de CMI de DAL Bevans se compararon con los obtenidos utilizando el método de dilución en agar, como se muestra aquí.Los resultados de MIC en agar para Dal bevans suelen ser de dos a ocho veces más altos que en caldo. Resultados de MIC por microdilución. Esta diferencia contrasta con los resultados de vancomicina, que se obtienen mediante métodos en caldo y en agar.Por lo tanto, no se recomienda la dilución en agar para la prueba de caldo de dalbavancina. Los resultados de la CMI por microdilución para control de calidad deben estar dentro de los rangos esperados, como se muestra aquí. El organismo de control de calidad SS, A TCC 2 9 2 1 3, con una CMI modal muy clara de 0,06 microgramos por mililitro, ha sido un buen indicador de la variación del método.Si los resultados obtenidos están fuera de los rangos esperados para los organismos de control de calidad o tienden hacia cualquiera de los extremos, inferior o superior, del rango, se justifica una validación adicional del método. Además de validar el método utilizando organismos de control de calidad, los datos de CMI de la vancomicina, procedentes de programas regionales de vigilancia antimicrobiana, pueden proporcionar una base para anticipar los resultados de CMI que cabe esperar en el entorno del laboratorio clínico. Como se muestra aquí, los resultados de CMI de dalbavancina para aislamientos recolectados en Europa y EE. UU. entre 2011 y 2013 fueron inferiores a 0,25 microgramos por mililitro para el 99,9 % de los SIU y el 100 % de los estreptococos. Basándose en estos datos de vigilancia, es evidente que los resultados de CMI de dalbavancina para estafilococos y estreptococos superiores a 0,12 microgramos por mililitro son raros.Si se observan valores más altos, la prueba debe repetirse o enviarse a un laboratorio de referencia para su validación. La preparación de la dilución patrón en DMSO y la adición de P 80 al caldo de dilución en una concentración del 0,002 % en el pocillo final de la CMI son pasos críticos para obtener resultados precisos y reproducibles de la CMI de dalbavancina. Como siempre, pero especialmente en esta área del desarrollo de resistencia bacteriana, los resultados precisos de sensibilidad a antimicrobianos son fundamentales para que el clínico elija la terapia adecuada.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Fuente: Koeth, L. M., et. al., Un método de microdilución de caldo de referencia para pruebas de susceptibilidad in vitro a dalbavancina de bacterias que crecen aeróbicamente. J. Vis. Exp. (2015).Este video demuestra el método de microdilución en caldo para determinar la concentración inhibitoria mínima (MIC) de un antibiótico lipoglicopéptido contra bacterias grampositivas. Cubre el aislamiento de colonias bacterianas, la dilución, la inoculación de pocillos de microplacas con diferentes...

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Una referencia Caldo método de microdilución para Dalbavancina

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