Procedimiento para Descelularización de rata hígados en un dispositivo de perfusión oscilante presión

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar el papel de la raíz de perfusión en la optimización de la homogeneidad de la descelularización de la perfusión hepática de rata. Esto se logra mediante la primera canulación, las venas portas y las arterias hepáticas de hígados de rata recién aislados. Como segundo paso, los hígados se conectan a un dispositivo de perfusión para la perfusión selectiva de las venas portas o las arterias hepáticas.

A continuación, se aplican cambios de presión oscilantes en la cámara de perfusión para imitar los cambios de presión intraabdominal que se producen durante la respiración. Al optimizar la microperfusión hepática, en última instancia, los hígados perfundidos a través de la arteria hepática en condiciones de presión oscilante exhiben una descelularización más homogénea y rápida según lo evaluado por la observación macroscópica y el análisis histológico y bioquímico. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la descelularización por perfusión venosa portal, es que la perfusión arterial en condiciones de presión oscilante conduce a un resultado de descelularización más homogéneo.

Sin embargo, en un tiempo más corto, este método puede proporcionar información sobre las técnicas de desaceleración. También se puede aplicar a otros sistemas, como experimentos de resolarización, configuraciones de perfusión extraoral y modelos de órganos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la recolección y la canulación arterial de hígados rojos pueden ser complicadas.

Antes de extraer el hígado, haga una incisión oblicua hasta el extremo de un trozo de 1,5 centímetros de un catéter venoso periférico G 20. Conecte el catéter a una llave de paso de tres vías y use una jeringa de 10 mililitros llena de solución de timbre para airear el sistema. A continuación, corte la aguja de una cánula de mariposa a una longitud de cinco milímetros y use superpegamento para fijar un tubo de cinco centímetros a la aguja.

Inserta un tubo de dos centímetros de largo en el tubo más grande y fíjalo también con superpegamento. Desliza otro tubo sobre esta construcción y pégalo en su lugar para crear un pilar. A continuación, utilice una jeringa de cinco mililitros llena de solución de timbre para reparar el hígado para la recolección.

Comience usando un vendaje de causa húmeda para sostener los lóbulos medial e izquierdo del hígado de una rata adulta anestesiada debajo de la cúpula del diafragma. Exponga el ligamento hepato duodenal y el lóbulo superior del hígado en este momento también. A continuación, utilice dos micropinzas y unas tijeras de muelle para diseccionar cuidadosamente el ligamento unido al lóbulo del epiplón superior hasta que el lóbulo sea móvil.

A continuación, sujetando los lóbulos medial e izquierdo en su lugar. Use hisopos de algodón húmedos para mover el lóbulo debajo de la compresa del GRE y el estómago hacia la izquierda del animal. Fije el estómago con una pinza y diseccione el impulso menor.

A continuación, diseccione el lóbulo hepático inferior o mentoniano hasta que sea móvil, y mueva el lóbulo de vuelta a su cavidad utilizando una pinza trasera para retener el duodeno, mueva el duodeno hacia la izquierda para exponer el ligamento duodenal herpeño. Circunscribir el colédoco. A continuación, diseccionar el conducto biliar del tejido adiposo y pancreático, cortando el conducto a 1,5 centímetros de la bifurcación del conducto biliar.

Diseccionar la vena sal del tejido adiposo circundante, exponiendo la vena gastroduodenal. A continuación, ligar la vena gastroduodenal dos veces con seis suturas cero y dividir la vena entre los dos nudos. Diseccionar el tronco celíaco y la arteria hepática común del tejido circundante hasta revelar todas las ramas arteriales.

Después de haber diseccionado todas las arterias, circunscriba la vena cava inferior entre el riñón derecho y el lóbulo hepático lateral derecho y diseccione la vena desde el espacio retroperitoneal. Siga el tronco celíaco para exponer la aorta. A continuación, diseccionar el tejido adiposo retroperitoneal y circunscribir la aorta por encima del tronco celíaco.

Ahora inyecte 1000 unidades de heparina en un mililitro de solución salina en el espeleólogo de la vena inferior. Cubra la incisión con una almohadilla de algodón y espere uno o dos minutos para que la heparina haga efecto. A continuación, circunscribir la aorta con fórceps y diseccionar la aorta y la espeleología de la vena inferior distalmente del riñón.

Para colocar la cánula venosa portal, haga una incisión en la boca de pez en la vena porta distal y abra la incisión con pinzas. A continuación, canular la vena porta y enjuagar el hígado con 20 mililitros de solución de ringer hasta que el hígado se deshumanice Usando seis ligaduras de seda cero para fijar la cánula en su lugar. Para colocar la cánula arterial, diseccione la aorta por encima del tronco celíaco hasta que el segmento de la aorta pueda liberarse del espacio retroperitoneal.

Corte el segmento de la aorta longitudinalmente para generar un parche aórtico e inserte la cánula autoconstruida en un soporte estático. A continuación, utilice dos pinzas para deslizar el parche aórtico sobre la cánula y ligar la arteria hepática con una sutura de seda seis cero sobre la cánula. Fijación del parche en el pilar para realizar la descelularización Conecte la llave de paso de tres vías en la cánula de la vena porta al acceso al reactor relacionado y conecte la cánula arterial al acceso arterial, teniendo cuidado de que no entre aire en los sistemas.

A continuación, conecte el respirador a la cámara de distribución de presión y conecte la cámara al reactor. Inicie la aplicación de presión. A continuación, iniciar la descelularización.

Fusionar el hígado con 1%tritton X 100 a razón de cinco mililitros por minuto. Permitir que los efluentes de desechos a través del flujo de salida del dispositivo de perfusión mantengan constante el nivel de líquido dentro de la cámara de perfusión y por encima del hígado perfundido. Después de 90 minutos, cambie el detergente a 1%SDS. Los hígados perfundidos a través de la vena de fuerza exhiben una elucidación homogénea que indica descelularización con células restantes macroscópicamente visibles durante y después del proceso, mientras que los hígados perfundidos a través de la arteria hepática demuestran un curso de descelularización más homogéneo con células restantes menos visibles.

Si los hígados se perfundían con la aplicación de condiciones de presión oscilante, no se veían las células restantes. Independientemente de la perfusión. La evaluación histológica de las matrices hepáticas descelularizadas apoya los hallazgos macroscópicos en hígados perfundidos a través de la arteria hepática.

No se observan células restantes, ya sea que hayan sido perfundidas en condiciones de presión oscilante o no, los hígados perfundidos a través de la vena porta, sin embargo, exhiben zonas de células restantes, incluso si están perfundidas en condiciones de presión oscilante, aunque estas condiciones reducen la masa celular restante en estos hígados, nótese, la preservación de las matrices extracelulares de los hígados independientemente de las condiciones de descelularización. El contenido de ADN por peso seco de la matriz hepática también disminuyó en todos los grupos experimentales en comparación con los hígados nativos. Aunque las diferencias solo fueron estadísticamente significativas en el grupo perfundido en condiciones de presión oscilante.

Además, la fundición por corrosión de las matrices hepáticas descelularizadas confirmó la preservación de la microanatomía del hígado durante el proceso de perfusión. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cosechar hígados rojos cánulos y perfundirlos para una desaceleración homogénea reproducible. No olvide que trabajar con Triton X 100 y SDS puede ser extremadamente peligroso, y también se deben tomar precauciones como el uso de guantes al realizar este procedimiento.