Name: Procedimiento para Descelularización de rata hígados en un dispositivo de perfusión oscilante presión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprende a descelularizar hígados de rata mediante perfusión arterial con presión oscilante en un dispositivo especializado. Este método optimiza la homogeneidad del proceso para aplicaciones en ingeniería de tejidos y trasplantes.

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Los autores desean agradecer a Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens y Katharina Struecker por su ayuda durante este proyecto.

Los animales se mantuvieron en el Centro de Medicina Experimental (FEM, Charité, Berlín, Alemania), y todos los protocolos experimentales fueron revisados ​​y aprobados por la Oficina Estatal de Sanidad y Locales (LAGeSo, Berlín, Alemania; Reg. No. O 0365 / 11). Cosecha 1. Hígado <ol><li> Preparación prequirúrgica <ol><li> Utilice una placa de corcho para la fijación. Ponga un paño médica en el plato. Utilizando cuatro agujas, fijar una máscara de inhalación en la placa de corcho para la narcosis por inhalación intraoperatoria. </li></ol></li><li> Predisposición del Portal venosa cánula <ol><li> Conecte un catéter venoso periférico (G 20) a una llave de tres vías. El catéter venoso debe ser cortado oblicuamente, con una longitud de aprox. 1,5 cm. </li><li> De-aire del sistema usando una jeringa de 10 ml llena con solución Ringer. Es muy importante cuidadosamente-air de embolia de gas porque puede afectar negativamente a la descelularización perfusión. </li></ol></li><li> Predisposiciónde la cánula arterial <ol><li> Utilice una cánula de mariposa y cortar la aguja a una longitud de 5 mm. Colocar un tubo de 5 cm (ID 0,58 mm; OD 0.96 mm) a la aguja 5 mm y fijarlo con pegamento. Inserte un tubo de 2 cm de largo (ID 0,28 mm; OD 0.61 mm) en el tubo más grande y fijarlo con pegamento. </li><li> Slip otro tubo sobre esta construcción como tope y fijarlo con pegamento. De-aire de la cánula arterial con una jeringa de 5 ml llena con solución Ringer. </li></ol></li><li> Anestesia y Analgesia <ol><li> Inducir narcosis de la rata en la cámara de inducción de la anestesia por 3,5% de isoflurano en oxígeno a una velocidad de flujo de 1,5 L / min. </li><li> Para asegurar la analgesia segura durante la operación, inyecte metamizol (100 mg de masa corporal / kg) y dosis bajas de ketamina / medetomidina (10 mg / 0,1 mg por kg de masa corporal) por vía intraperitoneal. </li><li> Suministro de 1,5% de isoflurano en 1 L / min de oxígeno a través de la máscara de inhalación para su posterior mantenimiento de la anestesia quirúrgica. </li></ol></li><li> Arreglos preoperatorias &lt;ol&gt; <li> Afeitarse el abdomen liberalmente con una máquina de corte eléctrico. Humedecer el sitio de la incisión en el abdomen afeitado con etanol al 70% para la desinfección. </li><li> Colocar el animal en posición supina en el plato preparado, inserte la cabeza en la máscara de inhalación y fijar las extremidades con cinta y los pines médica. Retire el exceso de etanol y la piel con una compresa de gasa. </li></ol></li><li> Evaluación Anestesia <ol><li> Evaluar la profundidad de anestesia viendo la frecuencia respiratoria. Cuando la anestesia parece bastante profunda (40 a 60 respiraciones / min), comprobar si la analgesia es suficiente por tratar de desencadenar el reflejo pizca dedo utilizando pinzas quirúrgicas para pellizcar la piel entre los dedos de ambas extremidades posteriores. </li></ol></li><li> Enfoque abdominal <ol><li> Haga una incisión mediana en la pared abdominal caudal por encima de la vejiga. Cortar en este punto a los dos arcos costales laterales en forma en forma de V. Tenga cuidado de no cortar el diafragma. Tire de la pared abdominal cortar sobre el pecho. </li&gt; <li> Fijar el xifoides con una pinza Overholt, tire de él craneal y fijarlo con una banda elástica. Use hisopos de algodón mojado para evacuar el intestino. Envuelva el intestino en un vendaje de gasa húmeda. Por otra parte, cubrir todos los márgenes abdominales con vendajes húmedos. </li></ol></li><li> Preparación de hígado <ol><li> Diseccionar el ligamento falciforme. Use un vendaje de gasa húmeda para mantener los lóbulos hepáticos medial y craneal izquierda bajo la cúpula del diafragma. Exponer el ligamento hepatoduodenal y el lóbulo del hígado omental superior. </li><li> Utilice dos microforceps y tijeras de primavera para diseccionar cuidadosamente el ligamento unido al lóbulo omental superior hasta el lóbulo es móvil. Mueva el lóbulo usando hisopos de algodón mojado bajo la compresa de gasa, la celebración de los lóbulos medial y dejados en su lugar. </li><li> Después de la movilización del lóbulo hepático omental superior, mueva el estómago a la izquierda. Fijar el estómago con una pinza y diseccionar el epiplón menor con microforceps y las tijeras de primavera. </li><li> Movilizar el omentos menorl lóbulo hepático hasta que es móvil y posteriormente mover el lóbulo de nuevo en su cavidad. Utilice una abrazadera Backhaus para retener el duodeno. Mueva el duodeno a la izquierda para estirar y exponer el ligamento hepatoduodenal. Circunscribir el conducto biliar común en el ligamento hepatoduodenal estirada. </li><li> Diseccionar el conducto de la bilis desde el tejido adiposo y páncreas. Cortar el conducto biliar 1,5 cm de la bifurcación de la vía biliar. Diseccionar la vena portal desde el tejido adiposo circundante. Exponer la vena gastroduodenal. </li><li> Ligar la vena gastroduodenal dos veces con seda 6-0 y dividir la vena entre las 2 ligaduras. Diseccionar el tronco celíaco y la arteria hepática común del tejido circundante hasta que toda ramas arteriales se revelan. </li><li> Libera la arteria gastroduodenal del tejido circundante. Ate la arteria gastroduodenal dos veces con seda 6-0, con los lazos distantes unos de otros. Diseccionar la arteria gastroduodenal entre las 2 ligaduras. </li><li> Libera la arteria esplénicadel tejido circundante. Ate la arteria esplénica dos veces con seda 6-0, con los lazos distantes unos de otros. Diseccionar la arteria esplénica entre las 2 ligaduras. </li><li> Libera la arteria gástrica izquierda desde el tejido circundante. Ate la arteria gástrica izquierda dos veces con seda 6-0, con los lazos distantes unos de otros. Diseccionar la arteria entre las 2 ligaduras. </li><li> Circunscribir la vena cava inferior entre el riñón derecho y el lóbulo del hígado lateral derecha. Diseccionar la vena desde el espacio retroperitoneal. Exponer la aorta siguiendo el tronco celíaco. </li><li> Diseccionar el tejido adiposo retroperitoneal. Inyectar 1000 IE heparina en 1 ml de solución salina en la vena cava inferior. Retirar la cánula y cerrar la incisión con un algodón. Espere 1-2 min para el efecto sistémico de la heparina. </li><li> Circunscribir la aorta con pinzas. Diseccionar la aorta y Exsanguinate la rata. Además, diseccionar la vena cava inferior distalmente desde el riñón. </li></ol></li><li> Portal venosa Canulación (Use la cánula preparado en la sección 1.2) <ol><li> Haga una incisión peces aftosa en la vena porta distal. Abra la incisión con fórceps y canular la vena porta. Enjuague el hígado con 20 ml de solución de Ringer hasta que los decolora hígado y fijar la cánula con ligaduras (seda 6-0). </li></ol></li><li> Arterial canulación (Use la cánula preparado en la sección 1.3) <ol><li> Diseccionar la aorta por encima del tronco celíaco. Libera el segmento de aorta desde el espacio retroperitoneal. Cortar el segmento de aorta longitudinalmente para generar un parche aórtico. Inserte la cánula de construcción propia en un soporte estático. </li><li> Utilice 2 pinzas para deslizar el parche aórtico sobre la cánula. Ligar la arteria hepática con seda 6-0 sobre la cánula y fijar el parche en el pilar. </li></ol></li><li> Explantación Hígado <ol><li> Abra el diafragma, hacer una incisión circular y diseccionar el hígado a partir de las estructuras circundantes. </li></ol></li><li> Almacenamiento <ol><li> Store el hígado en un tanque de 500 ml estéril lleno de solución 350 ml de timbre hasta su uso. </li></ol></li></ol> 2. soluciones detergentes <ol><li> 10% de solución de Triton X-100 de stock <ol><li> Llene una botella de 1000 ml con 900 ml de agua destilada. y añadir 100 ml de Triton X-100 (99,9%). Utilice un agitador para disolver el Triton X-100. Llena la botella con agua destilada. hasta un volumen total de 1.000 ml se alcanza. </li></ol></li><li> 1% Triton X-100 <ol><li> Añadir 100 ml de la solución madre (10%) a una botella de 1000 ml. Añadir 900 ml de agua destilada. y agitar la botella dos veces. Filtrar la solución 1% de Triton X-100 a través de un filtro estéril. </li></ol></li><li> 10% de SDS de la Solución <ol><li> Llene una botella de 1000 ml con 900 ml de agua destilada. y añadir 66,99 g de SDS (99,9%, la densidad de 0,67). Utilice un agitador para disolver el SDS. Llena la botella con agua destilada. hasta un volumen total de 1.000 ml se alcanza. </li></ol></li><li> 1% de SDS <ol><li> Añadir 100 ml de la solución madre (10%) a un bot 1000 mltle. Añadir 900 ml de agua destilada. y agitar la botella dos veces. Se filtra la solución de SDS al 1% a través de un filtro estéril. </li></ol></li></ol> 3. Descelularización <ol><li> Puesta en marcha del dispositivo de perfusión <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> Figura 1:. Esquema del dispositivo de perfusión para Selectivo arterial y venoso portal perfusión de cuatro hígados de rata bajo oscilantes Condiciones Presión (. Modificado de Struecker et al 14) <ol><li> Enlace el drenaje a una llave de paso de tres vías y una extensión Heidelberger para regular el nivel de llenado y llenar el reactor con 500 ml de NaCl 0,9%. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> Figura 2:. Esquema de la perfusión set-up link la cámara de perfusión (1,400 cm 3) (1) al extremo distal (4) de la trampa de burbujas (5) a través del acceso venoso portal (2) o a través de la ac arterialproceso (3). La trampa de burbujas (5) debe estar equipado con una obturación (4) en el extremo distal y un orificio de ventilación (6). Conectar la trampa de burbujas (5) a una extensión de Heidelberger (7). Enlazar la extensión Heidelberger al segmento de bomba (8). Además, conectar el segmento de bomba (8) a otra extensión Heidelberger (9). Inserte la última extensión Heidelberger (9) en la botella de solución de detergente (10). Conectar el respirador (11) a la cámara de perfusión (o al distribuidor de presión en el caso de múltiples perfusiones). Para drenar los fluidos del reactor, conecte la salida de la botella de residuos (12). <ol><li> Introduce el segmento de la bomba en la bomba. Arrancar la bomba para llenar el ciclo con PBS, cerrar el extremo distal de la trampa de burbujas y abrir el respiradero. Cuando la parte inferior de la burbuja está cubierto de forma segura con PBS (2-3 cm), cerrar el respiradero y abrir el extremo distal de la trampa de burbujas. </li><li> Instalación de hígado <ol><li> Enlazar la llave de tres vías de la cánula de la vena portal para el acceso reactor relacionada. Connect la cánula arterial para el acceso arterial. Tenga cuidado para asegurar que el aire no entra en los sistemas. </li></ol></li><li> Aplicación de oscilantes Condiciones Presión <ol><li> Use un respirador con una frecuencia de 15 lpm y una amplitud de 26 mbar (min. 4 mbar, máx. 30 mbar). Conectar el respirador a la cámara de distribución de la presión y conectar la cámara al reactor. Iniciar la aplicación de presión. </li></ol></li><li> Protocolo Descelularización <ol><li> Realice los pasos de perfusión con un caudal de 5 ml / min. Iniciar la descelularización con la perfusión del hígado con 1% de Triton X-100 durante 90 min. Permitir emanación de residuos a través de la salida del dispositivo de perfusión para mantener el nivel de fluido dentro de la cámara de perfusión constante y por encima del hígado perfundido. Después de 90 min, cambiar el detergente a 1% de SDS. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="Mesa 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;p&gt; Figura 3: Protocolo de perfusión para todos los grupos experimentales.

<ol><li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+support+strategies%3A+cutting-edge+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li>
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<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+Liver+Decellularization+Under+Oscillating+Pressure+Conditions%3A+A+Technical+Refinement+to+Improve+the+Homogeneity+of+the+Decellularization+Process%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque la técnica presentada para la cosecha de hígado de rata y descelularización es fácilmente reproducible, hay ciertos pasos críticos a considerar: Durante la preparación para la cosecha del hígado, es importante para evitar el sangrado grave porque va a activar la coagulación de la sangre y puede conducir a la formación de coágulos de sangre dentro del hígado. En nuestra opinión, es ventajoso incisión en la aorta abdominal directamente antes de la canulación de la vena porta para evitar...

Descelularización y recelularización pueden permitir la generación de órganos funcionales, trasplantables in vitro 1. Mediante la eliminación de las células y material antigénico (por ejemplo., ADN, los epítopos alfa-gal) de un órgano, la matriz extracelular no o menos inmunogénico (ECM) se puede obtener. Esta matriz conserva la microanatomía tridimensional de un órgano y puede servir como la biomatriz ideal para repoblación con células de un origen diferente, posiblemente xenogénico 2. Por lo tanto, una matriz de hígado de rata descelularizado podría ser repoblado con células de hígado humano. Este micro-hígado humanizado podría servir como un modelo ex vivo para la investigación de enfermedades (por ejemplo., Enfermedades metabólicas congénitas, enfermedades virales o tumores malignos) o para las pruebas farmacéuticas preclínico 3. Varios protocolos diferentes para perfusión descelularización hígado de rata ya se han publicado 4-13. En todos los protocolos, decellularzación se logró mediante la perfusión de detergentes iónicos o no iónicos alcalinas través de la vena portal canulado. A lo mejor de nuestro conocimiento, fuimos el primer grupo reportar rata descelularización hígado por perfusión selectiva a través de la vena porta y / o la rata arteria hepática 14. Activación de la perfusión selectiva de los diferentes sistemas vasculares en el hígado puede permitir mejores resultados descelularización y, además, pueden desempeñar un papel importante en la repoblación celular. En el estudio se detalla aquí, los hígados se perfundieron en un dispositivo de perfusión de propiedad a medida, permitiendo la perfusión bajo condiciones de presión oscilantes. Estas condiciones de presión imitan la perfusión respiratoria dependiente fisiológica del hígado: in situ, el hígado cuelga bajo la cópula del diafragma, cuyo movimiento durante la respiración tiene un impacto directo en la perfusión del hígado. La inspiración conduce específicamente a la reducción del diafragma y apretando del hígado, optimizandoflujo de salida hepato-venosa, mientras que la expiración conduce a la elevación del hígado y disminución de la presión intraabdominal para optimizar flujo de entrada venosa portal-15. Nuestro objetivo fue evaluar si oscilantes condiciones de presión tienen un impacto en la homogeneidad de la perfusión descelularización hígado de rata imitando condiciones intraabdominales ex vivo. La homogeneidad del proceso de descelularización puede ser un factor subestimado en descelularización perfusión. Todos los agentes conocidos utilizan para Descelularización hígado causan alteraciones en el ECM. Las células en áreas mal perfundidas permanecen dentro de la ECM, mientras que otras áreas están ya completamente descelularizado. Para disolver las células restantes, la duración de la perfusión o la presión deben ser elevados, causando más alteraciones a las áreas bien perfundidos. Por lo tanto, los detergentes para descelularización deben ser distribuidos de forma homogénea dentro del órgano.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cánula arterial autoconstruida</td></tr><tr><td>&nbsp; Portex Tubo de Polietileno No Estéril</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0.28 mm ID 0.61 mm OD</td></tr><tr><td>&nbsp; Portex Tubo de Polietileno No Estéril</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0.58 mm ID 0.96 mm</td></tr><tr><td>OD Venodrop Catéter de mariposa seguro</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">cánula de vena</td></tr><tr><td>porta Catéter Venoso periférico</td><td>BD 393224</td><td></td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>Llave de paso de tres vías</td><td>smiths medical</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><<tr>td colspan="4"></td></tr><tr><td>cirugía Cotton Sticks</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de algodón&nbsp;</td><td>Shaoxing Zhengde Apósito quirúrgico</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>Vendaje de gasa</td><td>Hubei Haige&nbsp; Instrumentos Médicos</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Solución Ringer</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml Jeringa</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 ml/ Luer Solo</td></tr><tr><td>5 ml Jeringa</td><td>Braun</td><td>4606061V</td><td>5 ml /Luer Solo</td></tr><tr><td>Suture (Seda 6/0)</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>paño médico</td><td>Shaoxing Zhengde Apósito quirúrgico</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgical </td></tr><tr><td>portaagujas</td><td>para instrumentos Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>micropinzas</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>microtijeras</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>micropinzas</td><td>S& T&nbsp;</td><td></td><td></td>112314</tr><tr><td>Abrazadera</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>tijeras</td><td>F S T&nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>pinza quirúrgica</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Respirador de descelularización</td></tr><tr><td></td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>Dispositivo de perfusión</td><td>Charite, laboratorio de ingeniería médica</td><td>dispositivo a medida dispositivo de</td><td>descelularización</td></tr><tr><td>bomba peristáltica ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&nbsp;</td><td>4 canales</td></tr><tr><td>Extensión Heidelberger 75 cm&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA segmento de bomba</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&nbsp;</td><td>MS/CA/click'n'go/POM-C</td></tr><tr><td>Tubo de 2 tapones CA</td><td>Trampa</td> de burbujas <td>Pharmed BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td> artículo <td></td><td>hecho a medida</td></tr><tr><td>Conector de manguera Luer Lock</td><td>Neolab Nº</td><td>02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detergentes</td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>CN30.4&nbsp;</td><td>2,5 kg</td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>3051.1 y nbsp;</td><td>10 L</td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">tinción</td></tr><tr><td>Eosina 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxilina</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>tinción gomori</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>AlcainBlue-PAS tinción</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Rojo Directo 80&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

procedimiento para descelularización de rata hígados en un dispositivo de perfusión oscilante presión

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

La descelularización y recelularización de órganos parenquimatosos puede permitir la generación de órganos funcionales in vitro, y ya se han publicado varios protocolos para la descelularización del hígado en roedores. Nuestro objetivo fue mejorar el proceso de descelularización mediante la construcción de un dispositivo de perfusión patentado que permitiera la perfusión selectiva a través de la vena porta y/o la arteria hepática. Además, se buscó realizar la perfusión bajo condiciones de presión circundante oscilante para mejorar la homogeneidad de la descelularización. La homogeneidad de la descelularización de la perfusión ha sido un factor subestimado hasta la fecha. Durante la descelularización, las áreas dentro del órgano que están mal perfundidas aún pueden contener células, mientras que la matriz extracelular (MEC) en las áreas bien perfundidas ya puede estar afectada por detergentes alcalinos. Los cambios de presión oscilantes pueden imitar los cambios de presión intraabdominal que ocurren durante la respiración para optimizar la microperfusión dentro del hígado. En el estudio que aquí se presenta, se analizaron matrices hepáticas de rata descelularizadas mediante tinción histológica, análisis de contenido de ADN y fundición por corrosión. La perfusión a través de la arteria hepática mostró resultados más homogéneos que la perfusión venosa portal. La aplicación de condiciones de presión oscilante mejoró la efectividad de la descelularización de la perfusión. Los hígados perfundidos a través de la arteria hepática y en condiciones de presión oscilante mostraron los mejores resultados. Las técnicas presentadas para la extracción, canulación y perfusión del hígado utilizando nuestro dispositivo patentado permiten configuraciones de perfusión sofisticadas para mejorar los experimentos de descelularización y recelularización en hígados de rata.

La homogeneidad y por lo tanto la efectividad de diferentes protocolos de descelularización se evaluaron por observación macroscópica, el análisis histológico, y el análisis del contenido de ADN restante dentro de matrices de hígado descelularizados. Además, se realizó la colada de corrosión para visualizar la microanatomía de los hígados intactos después de descelularización. Macroscopía Durante descelularización, hígados convierten lucent, lo que indica la elim...

Las técnicas presentadas para la recolección de hígado, la canulación y la perfusión utilizando nuestro dispositivo patentado permiten sofisticadas configuraciones de perfusión para mejorar los experimentos de descelularización y recelularización en hígados de rata.

Procedimiento para Descelularización de rata hígados en un dispositivo de perfusión oscilante presión

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar el papel de la raíz de perfusión en la optimización de la homogeneidad de la descelularización del hígado de rata mediante perfusión. Esto se logra primero canulando las venas portales y las arterias hepáticas de hígados de rata recién aislados. Como segundo paso, los hígados se conectan a un dispositivo de perfusión para la perfusión selectiva de las venas portales o las arterias hepáticas.A continuación, se aplican cambios de presión oscilantes a la cámara de perfusión para imitar los cambios de presión intraabdominal que ocurren durante la respiración. Al optimizar la microperfusión hepática, los hígados perfundidos finalmente a través de la arteria hepática bajo condiciones de presión oscilante exhiben una descelularización más homogénea y rápida, según se evaluó mediante observación macroscópica y análisis histológicos y bioquímicos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la descelularización por perfusión venosa portal es que la perfusión arterial utilizando condiciones de presión oscilante conduce a un resultado de descelularización más homogéneo.En un tiempo más corto, sin embargo, este método puede proporcionar información sobre las técnicas de desaceleración. También puede aplicarse a otros sistemas, como experimentos de resolarización, montajes de perfusión extraoral y modelos de órganos. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la recolección y la canulación arterial de hígados rojos puede ser complicada.Antes de extraer el hígado, realice un corte oblicuo al final de un trozo de 1,5 centímetros de un catéter venoso periférico G 20. Conecte el catéter a una llave de paso de tres vías y utilice una jeringa de 10 mililitros llenada con solución de Ringer para desairear el sistema. A continuación, corte la aguja de una cánula tipo mariposa a una longitud de cinco milímetros y use pegamento sintético para fijar un tubo de cinco centímetros a la aguja.Inserte un tubo de dos centímetros de largo dentro del tubo más grande y fije este tubo también con pegamento rápido. Deslice otro tubo sobre esta construcción y encólelo en su lugar para crear un tope. Luego, use una jeringa de cinco mililitros llena de solución de Ringer para desobstruir la cánula arterial recién construida para reparar el hígado antes de su extracción.Comience utilizando un vendaje húmedo para sujetar los lóbulos hepáticos medial e izquierdo de una rata adulta anestesiada bajo la cúpula del diafragma. Exponga en este momento el ligamento hepatoduodenal y el lóbulo hepático superior. A continuación, utilice dos pinzas microquirúrgicas y tijeras de resorte para disecar cuidadosamente el ligamento unido al lóbulo omental superior hasta que el lóbulo quede móvil.Luego, mantenga los lóbulos medial e izquierdo en su lugar. Utilice hisopos de algodón húmedos para mover el lóbulo bajo la compresión del GRE y el estómago hacia la izquierda del animal. Fije el estómago con una pinza y diseca el pequeño momento.Luego, disecar el lóbulo hepático inferior o mental hasta que esté móvil, y devolver el lóbulo a su cavidad utilizando un clamp de Backhouse para retener el duodeno; mover el duodeno hacia la izquierda para exponer el ligamento hepatoduodenal, rodeando el conducto biliar común. A continuación, disecar el conducto biliar del tejido adiposo y pancreático, cortando el conducto a 1,5 centímetros de la bifurcación del conducto biliar.Disecar la vena sal del tejido adiposo circundante, exponiendo la vena gastroduodenal. Luego ligar la vena gastroduodenal dos veces con suturas de calibre seis cero y seccionar la vena entre los dos nudos. Disecar el tronco celíaco y la arteria hepática común del tejido circundante hasta que se revelen todas las ramas arteriales.Después de que todas las arterias hayan sido disecadas, circunscriba la vena cava inferior entre el riñón derecho y el lóbulo hepático lateral derecho y seccione la vena del espacio retroperitoneal. Siga el tronco celíaco para exponer la aorta. Luego, diseca el tejido adiposo retroperitoneal y circunscribe la aorta por encima del tronco celíaco.Ahora inyecte 1000 unidades de heparina en un mililitro de solución salina en la vena cava inferior. Cubra la incisión con una gasa y espere de uno a dos minutos para que la heparina haga efecto. Luego rodee la aorta con pinzas y seccione la aorta y la vena cava inferior distalmente al riñón.Para colocar la cánula venosa portal, realice una incisión en forma de boca de pez en la vena porta distal y abra la incisión con pinzas. Luego canule la vena porta y lave el hígado con 20 mililitros de solución de Ringer hasta que el hígado se desangre. Utilice ligaduras de seda seis cero para fijar la cánula en su lugar. Para colocar la cánula arterial, diseccione la aorta por encima del tronco celíaco hasta que el segmento de aorta pueda ser liberado del espacio retroperitoneal.Corte el segmento de aorta longitudinalmente para generar un parche aórtico e inserte la cánula autoconstruida en un soporte estático. Luego, utilice dos pinzas para colocar el parche aórtico sobre la cánula y ligue la arteria hepática con una sutura de seda seis cero sobre la cánula. Fije el parche en el punto de unión para realizar la descelularización. Conecte la llave de tres vías en la cánula de la vena porta al acceso correspondiente del reactor y conecte la cánula arterial al acceso arterial, teniendo cuidado de que no entre aire en el sistema.A continuación, conecte el respirador a la cámara de distribución de presión y conecte la cámara al reactor. Inicie la aplicación de presión. Luego, comience la descelularización.Fusione el hígado con 1% Triton X-100 a una velocidad de cinco mililitros por minuto. Permita que el efluente de desecho salga a través del flujo de salida del dispositivo de perfusión para mantener el nivel de líquido dentro de la cámara de perfusión constante y por encima del hígado perfundido. Después de 90 minutos, cambie el detergente a 1% SDS. Los hígados perfundidos a través de la vena de fuerza muestran una elucidación homogénea, indicando descelularización con células remanentes visibles macroscópicamente durante y después del proceso, mientras que los hígados perfundidos a través de la arteria hepática demuestran un curso de descelularización más homogéneo con menos células remanentes visibles.Si los hígados fueron perfundidos con la aplicación de condiciones de presión oscilante, no se observaron células residuales. Independientemente de la perfusión. La evaluación histológica del tejido residual en las matrices de hígado descelularizadas respalda, de hecho, los hallazgos macroscópicos en los hígados perfundidos a través de la arteria hepática.No se observan células residuales, ya sea que se perfundieran bajo condiciones de presión oscilante o no, en hígados perfundidos a través de la vena porta; sin embargo, se observan zonas de células residuales, incluso si se perfunden bajo condiciones de presión oscilante, aunque estas condiciones reducen la masa celular residual en estos hígados. Obsérvese la preservación de las matrices extracelulares de los hígados independientemente de las condiciones de descelularización. El contenido de ADN por peso seco de la matriz hepática también disminuyó en todos los grupos experimentales en comparación con los hígados nativos, aunque las diferencias solo fueron estadísticamente significativas en los grupos perfundidos bajo condiciones de presión oscilante.Además, la técnica de colada por corrosión de las matrices hepáticas descelularizadas confirmó la preservación de la microanatomía del hígado durante el proceso de perfusión. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cosechar, canular y perfundir hígados rojos para lograr una descelularización homogénea y reproducible. No olvide que trabajar con Triton X-100 y SDS puede ser extremadamente peligroso, y se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Descelularización perfusión es una técnica novedosa para producir andamios todo hepática que conserva la composición del órgano de la matriz extracelular y la microarquitectura. Aquí, el método de preparación de andamios todo órgano con descelularización perfusión y posterior repoblación con hepatocitos se describe. Los injertos de hígado funcionales y trasplantables se pueden generar con esta técnica.

Descelularización y recelularización de hígados enteros

Una técnica para aislar fibroblastos portales de hígado de rata se ha descrito. Los hígados se perfundieron y...

El aislamiento de fibroblastos portales rata por<em&gt; In situ</em&gt; Hígado de perfusión

Hepatocitos primarios proporcionará una herramienta valiosa para evaluar las funciones bioquímicas, moleculares y metabólicos en un sistema experimental fisiológicamente relevantes. Se describe un protocolo fiable para la rata en la perfusión del hígado in situ, que constantemente genera hepatocitos viables hasta to1.0 ×...

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Injertos marginales, tales como hígados grasos, los injertos procedentes de donantes de edad avanzada, o hígados recuperados después de la muerte cardíaca (DCD) toleran el almacenamiento estático convencional, fría solamente mal. Hemos desarrollado un novedoso modelo de subnormothermic vivo de perfusión ex hígado para su conservación, evaluación y reparación de los injertos hepáticos marginales antes del trasplante.

Técnica de Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión hepática para el Almacenamiento, Evaluación y Reparación de marginales injertos hepáticos

Hay una escasez de donantes de hígado significativa, y se han ampliado los criterios de los donantes de hígado. Perfusión normotérmica ex vivo hígado (NEVLP) ha sido desarrollada para evaluar y modificar la función del órgano. Este estudio muestra un modelo de rata de NEVLP y pone a prueba la capacidad de pegilado-catalasa, para mitigar la lesión hepática de preservación.

Un pequeño modelo de la perfusión hepática normotérmica Ex Vivo

Establecemos una novedosa técnica quirúrgica para un modelo de perfusión en vivo solo lóbulo hepático de rata como requisito previo para el estudio adicional en vivo hígado parcial en el futuro de la ingeniería.

Una novedosa técnica quirúrgica como base para In Vivo parcial ingeniería hígado de rata

Este protocolo detalla el uso de un catéter intravenoso especial, tubos desechables estériles estandarizados, control de temperatura complementado con monitoreo en tiempo real y un sistema de alarma para el procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos para mejorar la consistencia en la viabilidad, el rendimiento y la funcionalidad de los hepatocitos primarios aislados de ratas.

Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

El protocolo describe la obtención quirúrgica y la posterior descelularización de colgajos porcinos vascularizados mediante la perfusión de detergente dodecil sulfato de sodio a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado.

Obtención y perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor de perfusión personalizado

Describimos la técnica quirúrgica y el proceso de descelularización para extremidades posteriores de ratas compuestas. La descelularización se lleva a cabo utilizando dodecil sulfato de sodio de baja concentración a través de un sistema de perfusión de máquina ex vivo .

Obtención y descelularización de extremidades posteriores de ratas utilizando un biorreactor basado en perfusión ex vivo para alotrasplante compuesto vascularizado

Se creó un sistema normotérmico de perfusión hepática ex vivo (NEVLP) para hígados de ratón. Este sistema requiere experiencia en microcirugía, pero permite resultados de perfusión reproducibles. La capacidad de utilizar hígados de ratón facilita la investigación de vías moleculares para identificar nuevos aditivos de perfusión y permite la ejecución de experimentos centrados en la reparación de órganos.

Normothermic ex vivo liver machine perfusión en ratón

Este protocolo presenta una técnica optimizada de perfusión hepática de colagenasa en dos pasos en un modelo de rata y muestra el uso de hepatocitos aislados para el cultivo in vitro a largo plazo de organoides 3D.

Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación

Aprende a descelularizar hígados de rata mediante perfusión arterial con presión oscilante en un dispositivo especializado. Este método optimiza la homogeneidad del proceso para aplicaciones en ingeniería de tejidos y trasplantes.

Procedimiento para Descelularización de rata hígados en un dispositivo de perfusión oscilante presión

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