Name: Terapia fotodinámica con Blended polímero conductor / Fullerene nanopartículas fotosensibilizadores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende a fabricar nanopartículas fotosensibilizadoras de polímero conductor con fullereno para terapia fotodinámica del cáncer. Este método evalúa su efectividad in vitro en líneas celulares agresivas como el cáncer de ovario.

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Los autores agradecen a la National Science Foundation (NSF) por el apoyo financiero a este trabajo a través de un premio CAREER (CBET-0746210) y a través del premio CBET-1159500. Nos gustaría agradecer al Dr. Turkson (Univ. del Hawaii Cancer Center) y al Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) por su ayuda con el cultivo celular.

1. El cultivo de líneas celulares <ol><li> Descongele TE 71 (células epiteliales del timo mouse), MDA-MB-231 (células de cáncer de mama humano), A549 (células de cáncer de pulmón humano) y OVCAR3 (células tumorales de ovario humanos) por la celebración de los viales de criógeno en agua tibia durante menos de 2 min . Añadir 10 ml de medio DMEM suplementado con 10% FBS a cada línea celular y centrifugar durante 6 min a 106 x g. </li><li> Aspirar la suspensión y añadir medios de 3 ml al sedimento. Mezclar las células correctamente pipeteando varias veces. Añade esta solución de células pre-calentado 7 ml de medio DMEM suplementado con 10% FBS en matraces T75 y mantener los frascos en atmósfera húmeda de 95% de aire / 5% de CO 2 a 37 ° C. Etiquetar este frasco como Pasaje 0. </li><li> Cuando la confluencia de las células alcanza el 80%, recoger las células mediante su incubación con 0,05% de tripsina durante 10 min. Neutralizar la tripsina mediante la adición de la misma cantidad de medios de comunicación. Centrifugar esta solución durante 6 min a 106 x g. Retire la suspensión y añadir 3 ml de medio fresco a la misma. Mezclar well y transferir pequeña cantidad (100 l) a un matraz de cultivo que contiene 7 ml de medio. Incubar el frasco de cultivo en la incubadora. Etiquetar el frasco como Paso 1. </li><li> Cultura las líneas celulares hasta el paso 11 o 12. </li></ol> 2. Fabricación de nanopartículas <ol><li> Preparación de ~ 10 -6 M (ajustada) solución madre sin diluir MEH-PPV <ol><li> En un vial de añadir 1 mg de poli [2-metoxi-5- (2-etilhexiloxi) -1,4-fenilenvinileno] (MEH-PPV) con un peso molecular (promedio Mn) 150,000-250,000 g / mol y 3 ml de tetrahidrofurano (THF) . Se agita la mezcla durante 2 horas mientras se calienta a 80 ° C en un plato caliente. </li><li> Se filtra la solución anterior en un nuevo vial usando un filtro de jeringa de 0,2 micras. Etiquetar esta solución como &#39;MEH-PPV solución madre sin diluir. Esta solución estará involucrado en la preparación de nanopartículas después de puesta a punto de la concentración como se describe en los pasos 2.1.3 y 2.1.4. </li><li> Añadir 50 l de la solución sin diluir MEH-PPV Stock en 3 ml de THF. Etiquetar esta solución como &quot;solución madre diluida MEH-PPV &#39;. Transferencia a una cubeta de cuarzo de 1 cm y medir la absorbancia a 495 nm mediante espectroscopia UV-VIS. </li><li> Si la absorbancia de la solución madre MEH-PPV diluida es mayor que 0,17, se diluye la solución sin diluir MEH-PPV de stock mediante la adición de más THF 1 ml a la vez, y repetir el paso 2.1.3 hasta que la absorbancia medida a 495 nm está en el oscilar 0,13 a 0,17. </li><li> Calcular la molaridad de la solución madre MEH-PPV diluida utilizando la ley de Lambert-Beer, como se muestra a continuación. Aquí 0,15 absorbancia se utiliza como un ejemplo para el resto del protocolo (es decir., Ajustar todos los siguientes cálculos basados ​​en la absorbancia observado), el coeficiente de extinción MEH-PPV usado es 10 7 M -1 cm -1 y la longitud del camino es utilizado 1 cm. A = ε xbxc (Ecuación 1) (ε - el coeficiente de extinción molar, A - absorbancia, b - longitud de la trayectoria, c - concentración de la solución) 0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm xc (Ecuación 2) c = 1,5 x 10 -8 M (Ecuación 3) Utilice esta concentración para encontrar la concentración de la solución sin diluir MEH-PPV de la forma siguiente: M 1 V 1 = M 2 V 2 (Ecuación 4) 0,15 x 10 -7 M x 3050 l = M 2 x 50 l (Ecuación 5) M = 2 9,15 x 10 -7 M (Ecuación 6) Esta es la concentración de la &#39;MEH-PPV solución madre sin diluir ajustado&#39;. </li></ol></li><li> Cálculo de la masa de MEH-PPV en la solución no diluida ajustada Stock MEH-PPV <ol><li> Calcular la masa de MEH-PPV en 1 ml de la solución madre sin diluir ajustado como se muestra a continuación utilizando la molaridad obtenida en el apartado 2.1.4 y el peso molecular (M w) MEH-PPV de, que es 10 6 g / mol. M = n / V (n -. No de moles, V - volumen en L) (Ecuación 7) Por lo tanto, la masa de MEH-PPV en 1 ml de ajustado undsolución madre iluted es 9,15 x 10 -4 g. </li></ol></li><li> Combinando PCBM en MEH-PPV <ol><li> Calcular la masa de Fenil-C 61 butírico éster metílico del ácido (PCBM) que se añaden a la solución madre MEH-PPV para hacer dopado MEH-PPV solución de 50% en peso PCBM, donde el 50% en peso PCBM se define con respecto a la masa del MEH-PPV (es decir, la mitad de la masa del MEH-PPV). Al utilizar el peso del MEH-PPV obtenido en el apartado 2.2. Misa de PCBM / 9,15 x 10 -4 g de MEH-PPV x 100% = 50% en peso PCBM (ecuación 8) Misa de PCBM = 4,57 x 10 -4 g (ecuación 9) </li><li> Pesar 1 mg PCBM en un vial y añadir 500 l de THF. Calcular la concentración de PCBM en esta solución utilizando el peso molecular de PCBM como 910.88 g / mol Molaridad de la solución PCBM = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 l) (Ecuación 10) La molaridad de la solución de PCBM = 2,19 x 10 -9 mol / l (Ecuación 11) </li><li> Calcular el volumen de solución PCBM necesaria para agregar a la ajustada sin diluir MESolución de H-PPV de stock para obtener la solución MEH-PPV PCBM dopado 50% en peso en THF mediante el uso de la molaridad calculado en el paso 2.3.2 4,57 x 10 -4 g de PCBM x 1 mol / 910.88 gx 1 l / 2,19 x 10 -9 moles = 229 l (Ecuación 12) Añadir 229 l de la solución PCBM en 1 ml de solución madre MEH-PPV sin diluir y mezclar bien ajustado. </li></ol></li><li> Preparación de nanopartículas mediante el método de reprecipitación <ol><li> Transferir 1 ml de la solución de MEH-PPV / PCBM mezclado en la jeringa 1 ml con la aguja unida a ella. </li><li> Rápidamente inyectar 1 ml de la solución de MEH-PPV / PCBM mezclado en 4 ml de agua DI agitación a 1200 rpm. Deja de agitar inmediatamente después de la inyección. Utilice estas nanopartículas sin transformar. </li></ol></li></ol> 3. Incubación de líneas celulares con nanopartículas de Imagen NOTA: Todos los experimentos de imagen se completaron en placas de Petri de 35 mm <ol><li> La captación de nanoparticulos en líneas celulares <ol><li> Líneas celulares de Cultura hasta el 12 º paso. A las 12 células de cultivo pasaje th en 35 mm placas de Petri. Ajuste concentración de células añadidas a los 35 mm placas de Petri tal que después de 24 hr las células son 40% de confluencia. </li><li> En esta etapa eliminar los medios de comunicación DMEM suplementado con 10% FBS de las placas de Petri, se lavan las células con DPBS 1x dos veces, y añadir 100 l de la suspensión de nanopartículas en 2 ml de DMEM a las placas de Petri. </li><li> Después de 24 hr quitar el DMEM / nanopartículas suspensión de las placas de Petri y se lavan las células con DPBS 1x 3 veces. A continuación, fijar las células mediante incubación con paraformaldehído al 4% durante 10 min. Lavar dos veces con DPBS. Teñir las células con 300 nM DAPI mediante la incubación con el colorante durante 2 min. Lavar dos veces con DPBS. A continuación, mantener las células en DPBS para imágenes. </li></ol></li><li> La detección de ROS <ol><li> A549 cultura y líneas celulares OVCAR3 en placas de Petri, 6 por cada línea celular, tal como se explica en la sección 3.1.1. Etiquetar elPlacas de Petri como se muestra en la Tabla 1. </li><li> Añadir 100 l de la suspensión de nanopartículas en 2 ml de DMEM a tres de los platos de petri como se muestra en la Tabla 1 y se incuba durante 24 hr. Para las cajas de Petri que recibirán dosis de luz, lavar las células después de 24 horas y suspender las células en HBSS (solución salina equilibrada de Hank) Dye medios de comunicación libres. </li><li> Calentar la lámpara del simulador solar durante 15 min. Coloque el filtro UV en frente de la lámpara para filtrar la luz ultravioleta. Calibre la lámpara con una célula solar de referencia mediante el ajuste de la potencia de la lámpara para obtener 0,5 dom (50 mW / cm 2) la intensidad en la superficie de la placa de Petri. En esta configuración particular que la condición se logró con 218 W de potencia suministrada a la lámpara. </li><li> Colocar las placas de Petri bajo la lámpara (tapa abierta) durante 60 min, lo que se traduce en una dosis de luz de 180 J / cm 2 como se muestra en los cálculos siguientes: 50 mW / cm 2 x 3600 seg / 1000 = 180 J / cm 2 </li><li> Retirar HBSS y sin lavar añadir más 2 ml de medio DMEM suplementado con 10% de FBS a las placas de Petri. Se incuban las células durante otras 2 h. </li><li> Para el control positivo se incuban las células con 100 mM de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) durante 30 min. </li><li> Teñir las células en todas las placas de Petri con una concentración final de 5 mM del reactivo de detección de ROS mediante la incubación de las células con el colorante durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Fijar las células mediante incubación con paraformaldehído al 4% durante 10 min. Lavar dos veces con DPBS. Teñir las células con 300 nM DAPI mediante la incubación con el colorante durante 2 min. Lavar dos veces con DPBS. A continuación, mantener las células en DPBS para imágenes. </li></ol></li><li> La apoptosis y necrosis por PI y anexina V FITC <ol><li> Cultura cada línea celular en 5 placas de Petri. Tres de estas placas de Petri habrá para el experimento, mientras que los restantes 2 placas de Petri serán muestras de control. Incubar las 3 placas de Petri para experimentar con nanopartículas como el correoXplained en la sección 3.1.2. Las muestras de control no se incubaron con nanopartículas. </li><li> Después de 24 horas de incubación seguir el paso 3.2.3. </li><li> Colocar las 3 placas de Petri experimentales bajo la lámpara (tapa abierta) y extraer uno a 20 min, 40 min de uno en uno y uno en 60 min. Esto produce tres muestras que fueron expuestos a dosis de luz de 60, 120 y 180 J / cm2, respectivamente (de cálculo en la sección 3.2.4). A continuación, administrar un 180 J / cm 2 dosis de la luz a una de las placas de Petri de control. Este es el control con la dosis de luz aplicada en la ausencia de nanopartículas. No aplicar dosis de luz de la muestra de control restante (no hay nanopartículas y sin dosis de luz aplicada). </li><li> Sustituir el HBSS con los medios DMEM suplementado con 10% de FBS y mantener las placas de Petri en la incubadora durante 4 hr. </li><li> Teñir las células en el grupo experimental y de control de las placas de Petri con 20 l de anexina V FITC incubando las células con el colorante durante 15 min. Lavar dos veces con DPBS. Manchar la cells con 300 nM DAPI así como 300 nM PI (yoduro de propidio) mediante la incubación con los colorantes para 2 min. Lavar dos veces con DPBS. A continuación, mantener las células en DPBS para imágenes. </li></ol></li></ol> 4. intrínseca citotoxicidad de nanopartículas <ol><li> Contar las células y el cultivo en placas de 96 pocillos <ol><li> Recoger las células de los matraces de cultivo mediante la eliminación de los medios y lavado de las células dos veces con DPBS seguido de incubación de las células con 0,05% de tripsina durante 10 min. Añadir 2 ml de medio DMEM suplementado con 10% FBS a la solución de células resultante. Mezclar la solución adecuada para separar grupos de células en interiores. </li><li> Tomar 100 l de la suspensión celular y añadir a 900 mu l de medios DMEM suplementado con 10% FBS. Mezclar bien. Coloque 10 l de esta suspensión en un hemocitómetro. Contar las células utilizando el hemocitómetro y ajustar la concentración de la suspensión celular en 4.1.1 a 5 x 10 4 células / ml. </li><li> Tome 5 placas de 96 pocillos etiquetados como 0 h, 24 hr, 48 h, 72 hy 96 h. Añadir 50 l de las 5 x 10 4 células / ml de células soluciones (TE 71 y A549) en los pocillos como se muestra en la Tabla 2, la siembra de este modo 2.500 células / pocillo. Realice el mismo procedimiento para las líneas celulares OVCAR3 y MDA-MB-231. </li><li> Después de 24 hr lavar los pocillos con 1x DPBS y añadir 50 l de concentraciones crecientes de nanopartículas en los pocillos como se muestra en la Tabla 2. Preparar diferentes concentraciones de nanopartículas mediante la adición de 20, 100, y 180 l de suspensión de nanopartículas a partir de 2.4.2 a DMEM a obtener un volumen final de 2 ml, que produce concentraciones de nanopartículas de 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / ml, y 3,6 x 10 -4 mg / ml, respectivamente. Cada línea celular tiene por triplicado para cada concentración de nanopartículas. </li></ol></li><li> La medición de la viabilidad celular en la oscuridad <ol><li> Añadir 10 l de MTT a la placa 0 horas inmediatamente después de la adición de nanopartículas. Incubar la placa durante 4 horas para cri formazánALS a la forma. Añadir solución de solubilización 50 l en los pocillos. Incubar la placa durante 6 horas para disolver los cristales de formazán. </li><li> Medir la viabilidad de las células de la placa de 0 hr mediante el registro de la absorbancia a 570 nm con un lector de microplacas. </li><li> Por 24 horas la placa, se lavan las células con 1x DPBS y añadir 50 l medios de comunicación en cada incubación bien después de 24 horas con nanopartículas. Añadir MTT y leer la placa como se explica en 4.2.1 y 4.2.2. </li><li> Por 48 horas, 72 horas y 96 placas hr, se lavan las células con 1x DPBS y añadir 50 l de medios en los pocillos después de 24 horas de incubación con nanopartículas. Se incuban las células durante los períodos restantes. </li><li> 4.2.5) Medir la viabilidad celular en los puntos de tiempo particulares como se explica en 4.2.1 y 4.2.2. </li><li> Repite el experimento completo para 3 veces (n = 3) </li></ol></li></ol> 5. medir la viabilidad celular después de PDT <ol><li> Contar las células y cultivando en placas de 96 pocillos. <ol><li> Etiquetar un conjunto de 9Placas de 6 pocillos como se muestra en la Tabla 3, tanto para los TE 71 placas + A549 y OVCAR3 + MDA-MB-231 placas. La disposición de las placas será la misma como se muestra en 4.1.3. </li><li> Semilla las placas de 96 pocillos como se explica en la sección 4.1 con el mismo diseño que se muestra en la Tabla 2 en la sección 4.1.2. </li><li> Después de 24 horas añadir nanopartículas a las placas como se explica en 4.1.4. </li><li> 24 hr después de la adición de nanopartículas de lavar las células con 1x DPBS y añadir 50 l de HBSS a cada pocillo. </li><li> Irradiar las placas con las respectivas dosis de luz como se explica en 3.2.3. </li><li> Vuelva a colocar la HBSS con 50 l medio DMEM suplementado con 10% de SFB y se incuban las placas durante los períodos de tiempo respectivos después de la TFD. </li><li> Después de cada período de tiempo medir la viabilidad celular como se explica en 4.2.1 y 4.2.2. </li></ol></li></ol> 6. microscopía de fluorescencia <ol><li> La adopción de las nanopartículas <ol><li> Encienda las luces de un microscopiond el láser 30 minutos antes de la proyección de imagen. Coloque la placa de Petri que contiene las células fijas (como se explica en la sección 3.1) en la platina del microscopio. </li><li> Recoger la fluorescencia de nanopartículas y DAPI por el uso de filtros como se muestra en la Tabla 4. Superposición de la fase de contraste, nanopartículas y las imágenes DAPI en software ImageJ. </li></ol></li><li> La detección de ROS <ol><li> Encienda las luces del microscopio 30 minutos antes de la proyección de imagen. Coloque la placa de Petri que contiene las células (como se explica en la sección 3.2) en la platina del microscopio. </li><li> Recoger la fluorescencia de nanopartículas, DAPI, y el reactivo de detección de ROS mediante el uso de filtros como se muestra en la Tabla 4. Superponer la de contraste de fase, nanopartícula, DAPI y la detección de ROS imágenes de reactivos en el software ImageJ. </li></ol></li><li> La apoptosis y necrosis por PI y anexina V FITC <ol><li> Encienda las luces del microscopio 30 minutos antes de la proyección de imagen. Poner la placa de Petri que contiene las células (como se explica ensección 3.3) en la platina del microscopio. </li><li> Recoger la fluorescencia de nanopartículas, DAPI, PI y Anexina V FITC mediante el uso de filtros como se muestra en la Tabla 4. Superponer la de contraste de fase, nanopartícula, DAPI, PI y Anexina V FITC imágenes en el software ImageJ. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para lograr la captación de nanopartículas que era necesario mantener algunas medidas críticas, mientras que la fabricación de las nanopartículas. Una solución MEH-PPV M 10 -6 (mezclado con 50% en peso PCBM) en THF estaba preparado para inyectar en agua DI, ya que se observó que la concentración de esta solución juega un papel importante en la determinación del tamaño de las nanopartículas se está formando. Concentración se comprobó mediante espectroscopía de UV-vis. Tenga en cuenta que en el paso 2.1.3 proto...

En la terapia fotodinámica (PDT) fotosensibilizadores se administran a un tejido diana, y tras la exposición a la luz el fotosensibilizador genera especies reactivas del oxígeno (ROS). Especies ROS como el oxígeno singlete y superóxido pueden inducir estrés oxidativo y el daño estructural posterior a las células y tejidos 1.4. Debido a su facilidad de aplicación de este método se ha investigado activamente y los ensayos clínicos se han producido 5,6. Sin embargo, las cuestiones importantes, tales como toxicidad en la oscuridad de los sensibilizadores, la sensibilidad del paciente a la luz (debido a la distribución no selectiva del sensibilizador), y la hidrofobicidad de los sensibilizadores (que conduce a la reducción de la biodisponibilidad y el potencial de toxicidad aguda) permanecen. Aquí se presenta un método para la fabricación e in vitro de evaluación de la realización de las nanopartículas de polímeros mezclados con fullereno como los fotosensibilizadores de próxima generación para PDT. Las nanopartículas se forman por agregación de auto-el polímero semiconductor MEH-PPV (poli [2-metoxi-5- (2-etilhexiloxi) -1,4-fenilenvinileno]) con el PCBM fullereno (fenil-C 61 butírico metil éster de ácido), cuando estos materiales se disolvieron en una compatible disolvente se inyectan rápidamente en un solvente no compatible (Figura 1A). La elección del MEH-PPV como el polímero anfitrión está motivada por su alto coeficiente de extinción que conduce a altas tasas de formación de trío, y tanto la carga y transferencia de energía eficiente y ultrarrápido a la PCBM fullereno 7. Estas propiedades son ideales para la sensibilización de oxígeno singlete y la formación de superóxido en PDT. Fullerene de hecho se ha aplicado en PDT, tanto en forma molecular y nanopartículas 08.13. Sin embargo, la citotoxicidad severa ha dificultado aún más el desarrollo 12. Aquí mostramos que encapsula el fullereno en una matriz anfitrión MEH-PPV de rendimiento compuesto de nanopartículas MEH-PPV / PCBM resultados en un material de sensibilización de PDT que iNo es citotóxico intrínsecamente, muestra especificidad hacia las células cancerosas debido al tamaño de nanopartículas y la carga superficial, y los rendimientos de tratamiento altamente eficaz PDT a dosis bajas de luz debido a las propiedades fotofísicas antes mencionados.

<table><tbody><tr><td>Poli[2-metoxi-5-(2-etilhexiloxi)-1,4-fenilenvinilonico] (MEH-PPV)</td><td>Sigma Aidrich</td><td>536512-1G</td><td>promedio Mn&nbsp; 150,000-250,000</td></tr><tr><td>[6,6]-Fenil C61&nbsp; éster metílico de ácido butírico (PCBM)</td><td>Sigma Aidrich</td><td>684449-500MG</td>><td>99.5%</td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano (THF)</td><td>EMD</td><td>TX0284-6</td><td>Drisolv</td></tr><tr><td>jeringa de 1 ml</td><td>National Scientific Company</td><td>37510-1</td><td>Para la filtración de solución MEH-PPV</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>VWR</td><td>28145-495</td><td>25 mm, 0,2 y micro; m, PTFE</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>Hamilton Company</td><td>81320</td><td>Para inyección de solución MEH-PPV en agua para hacer nanopartículas</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-350</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution sin rojo de fenol (HBSS)</td><td>Calidad Biológica (VWR)</td><td>10128-740</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1x sin calcio y magnesio (DPBS)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-436</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, regular (inactivado por calor) (FBS)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-736</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1x 0.25%</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-664</td><td>tripsina/2.21 mM EDTA en HBSS sin bicarbonato de sodio, calcio y magnesio Parvovirus porcino probado 16</td></tr><tr><td>% Paraformaldehído</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica&nbsp;</td><td>15710</td><td>El paraformaldehído al 16% se diluye al 4% mediante la adición de PBS</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>&nbsp; Biotium VWR</td><td>89139-054</td><td>Tinción nuclear</td></tr><tr><td>pipetas de 5 ml</td><td>VWR</td><td>82050-478</td><td></td></tr><tr><td>matraz de cultivo de 75 cm2</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td>para células de cultivo</td>placas de</tr><tr><td>96 pocillos</td><td>VWR</td><td>82050-771</td><td>para ensayos MTT</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos con respiraderos</td><td>Greiner Bio-One (VWR)</td><td>82050-538</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sondas moleculares</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A13199</td><td>colorante para la apoptosis</td></tr><tr><td>Celltiter 96 ensayos no R 1000</td><td>Promega (VWR)</td><td><a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=PAG4000">PAG4000</a></td><td>MTT</td></tr><tr><td>CellROX Green Reactivo, para la detección del estrés oxidativo</td><td>Invitrogen</td><td>C10444</td><td>para ROS </td></tr><tr><td>espectrómetro UV-vis</td><td>de detección Agilent 8453</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de fluorescencia</td><td>NanoLog HoribaJobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PD2000DLS de dispersión de luz dinámica</td><td>, Detector</td><td></td><td></td>de precisión</tr><tr><td>Incubadora</td><td>NuAir DH Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss Axioskop2</td><td></td><td>63X lente objetivo de inmersión en aceite</td></tr><tr><td>Microscopio de epiluminiscencia</td><td>Olympus IX71</td><td></td><td>60X lente de objetivo de inmersión en agua, cámara Andor Zyla sCMOS</td></tr><tr><td>Simulador solar</td><td>Newport 67005 Oriel Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Referencia célula solar</td><td>Oriel&nbsp;</td><td></td><td>Estándares VLSI incorporados Lector</td></tr> de <tr><td>microplacas</td><td>BioTek Ex808</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Hausser Scientific Partnership</td><td>3200</td><td>Para el recuento de células</td></tr></tbody></table>

terapia fotodinámica con blended polímero conductor / fullerene nanopartículas fotosensibilizadores

Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

En este artículo se presenta un método para la fabricación y evaluación in vitro reproducible de nanopartículas poliméricas conductoras mezcladas con fullereno como fotosensibilizadores de próxima generación para la Terapia Fotodinámica (PDT). Las nanopartículas se forman por la interacción hidrofóbica del polímero semiconductor MEH-PPV (poli[2-metoxi-5-(2-etilhexiloxi)-1,4-fenilenvinileno]) con el fullereno PCBM (fenil-C61-éster metílico del ácido butírico) en presencia de un disolvente no compatible. MEH-PPV tiene un alto coeficiente de extinción que conduce a altas tasas de formación de tripletes y una transferencia eficiente de carga y energía al PCBM fullereno. Estos últimos procesos mejoran la eficiencia del sistema PDT a través de la formación de radicales y tripletes asistidos por fullereno, y la desactivación ultrarrápida de MEH-PPV excitado. Los resultados reportados aquí muestran que este sistema de sensibilización de PDT de nanopartículas es altamente efectivo y muestra una especificidad inesperada para las líneas celulares cancerosas.

La captación y la citotoxicidad intrínseca de nanopartículas Los 50% en peso de nanopartículas mezclados MEH-PPV / PCBM se incubaron con TE 71, MDA-MB-231, A549 y líneas de células OVCAR3. El nivel de mezcla PCBM fue elegido como 50% en peso de PCBM, que se ha demostrado para proporcionar propiedades de carga y de transferencia de energía ideales entre polímeros conjugados y fullerenos 14. Las imágenes de fluorescencia de la captación de nanopartículas se muestran en la Fi...

Este protocolo describe un método para la fabricación de nanopartículas poliméricas conductoras mezcladas con fullereno. Estas nanopartículas fueron investigadas por su uso potencial como fotosensibilizadores de próxima generación para la Terapia Fotodinámica (PDT).

Terapia fotodinámica con Blended polímero conductor / Fullerene nanopartículas fotosensibilizadores

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un fotosensibilizador de próxima generación para la terapia fotodinámica o aplicación de PDT en el tratamiento del cáncer. Esto se logra adaptando un método de precipitación para la fabricación de nanopartículas de polímeros conductores dispersables en agua. Como segundo paso, las nanopartículas se incuban con células cancerosas in vitro, seguido de un tratamiento con luz para generar especies reactivas de oxígeno o ROS, que son los radicales activos que participan en la PDT.A continuación, la eficacia del tratamiento se evalúa mediante ensayos cuantitativos e imágenes cualitativas para determinar las fracciones de células viables frente a las de muerte celular inducida por el tratamiento (TED) en la población celular. Los resultados muestran que cánceres agresivos, como el cáncer de ovario, modelados aquí por OAR tres, incorporan abundantemente el fotosensibilizador en forma de nanopartículas descrito en este trabajo, y que el tratamiento con terapia fotodinámica (PDT) es altamente eficaz in vitro. En ese caso, la eficacia de la PDT se correlaciona directamente con la cantidad de nanopartículas incorporadas por las diferentes líneas celulares.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la quimioterapia, la radioterapia y la cirugía, es que el tratamiento puede dirigirse específicamente al sitio de la enfermedad para reducir los efectos secundarios. El material activo utilizado no muestra citotoxicidad in vitro y un desarrollo adicional hará que el sistema de nanomateriales sea más específico hacia el sitio de estimulación transcraneal de corriente directa (tDCS). Inicie este procedimiento con el cultivo de líneas celulares y la preparación de la solución stock de M-E-H-P-P-V según se describe en el protocolo del texto. Añada 50 microlitros de la solución stock de M-E-H-P-P-V sin diluir a tres mililitros de TETRAHEDRAN o THF.Etiquete esta solución como solución stock diluida de M-E-H-P-P-V, transfiérala a una celda de cuarzo de un centímetro de Q y mida la absorbancia a 495 nanómetros mediante espectroscopía ultravioleta visible. Si la absorbancia de la solución stock diluida de M-E-H-P-P-V es mayor que 0.17, diluya la solución stock no diluida de M-E-H-P-P-V agregando más TH F1 mililitro a la vez hasta que la absorbancia medida a 495 nanómetros esté en el rango de 0.13 a 0.17. A continuación, prepare las nanopartículas mediante el método de precipitación transfiriendo un mililitro de una solución mezclada de M-E-H-P-P-V-P-C-B-M a una jeringa de un mililitro con una aguja acoplada. Rápidamente.Injecte un mililitro de la solución M-E-H-P-P-V-P-C-V-M mezclada en cuatro mililitros de agua desionizada agitando a 1200 RPM, deteniendo inmediatamente después de la inyección. Utilice estas nanopartículas sin procesamiento adicional para realizar la PDT en células incubadas con nanopartículas. Primero, etiquete un conjunto de placas de 96 pocillos como se muestra en el protocolo escrito.Llame entonces a las células de los frascos de cultivo eliminando el medio y lavando las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato de docosano o DPBS, seguido de la incubación de las células con tripsina al 0,05 % durante 10 minutos a dos mililitros de medio Eagle modificado por Delcos suplementado con 10 % de suero bovino fetal al solución celular resultante. Mezcle adecuadamente la solución para separar los grupos celulares en células individuales. Tome 100 microlitros de la suspensión celular y añádalos a 900 microlitros de DMEM suplementado con 10 % de SBF, mezcle bien y coloque 10 microlitros de esta suspensión en un hemocitómetro.Cuente las células utilizando el hemocitómetro y ajuste la concentración de la suspensión celular a 50.000 células por mililitro. A continuación, siembre la placa de 96 pocillos añadiendo 50 microlitros de la solución celular en los pocillos, sembrando así 2.500 células por pocillo. Después, prepare diferentes concentraciones de nanopartículas añadiendo 2100 y 180 microlitros de la suspensión de nanopartículas preparada al DMEM para obtener un volumen final de dos mililitros.Después de 24 horas, lave los pocillos con un X-D-P-B-S y añada 50 microlitros de concentraciones crecientes de nanopartículas en los pocillos. Cada línea celular tiene tres réplicas para cada concentración de nanopartículas. 24 horas después de la adición de las nanopartículas.Lave las células con un X-D-P-B-S y agregue 50 microlitros de solución salina equilibrada de Hank o HBSS a cada pocillo, para irradiar las células caliente la lámpara del simulador solar durante 15 minutos. Coloque un filtro UV delante de la lámpara para eliminar la luz UV. Calibre la lámpara con una celda solar de referencia ajustando la potencia de la lámpara para obtener una intensidad de 0,5 soles en la superficie de la placa de 96 pocillos aquí.Esa condición se logró con 218 vatios de potencia suministrada a la lámpara. Coloque la placa de 96 pocillos bajo la lámpara con la tapa abierta e irradie las células durante 60 minutos, lo que resulta en una dosis de luz de 180 julios por centímetro cuadrado tras la radiación. Reemplace el HBSS con 50 microlitros de DMEM, suplementado con 10% de FBS, e incube las placas durante los períodos de tiempo respectivos tras la terapia fotodinámica.Después de cada período de tiempo, mida la viabilidad celular añadiendo 10 microlitros de MTT al pocillo. Incube la placa durante cuatro horas para permitir la formación de cristales. A continuación, añada 50 microlitros de la solución de solubilización a los pocillos e incube la placa durante seis horas.Para disolver los cristales de formazan. Mida la viabilidad celular registrando la absorbancia a 570 nanómetros con un lector de microplacas para evaluar la citotoxicidad intrínseca de las nanopartículas. Lea la placa de 96 pocillos sin aplicar PDT para medir la incorporación de las nanopartículas.Detección de ERO formadas tras la PDT y detección de apoptosis y necrosis tras la PDT. Primero encienda las lámparas del microscopio y el láser, 30 minutos antes de la adquisición de imágenes. Coloque la placa de Petri que contiene las células fijadas sobre la platina del microscopio.Recopile la fluorescencia proveniente de las nanopartículas. El reactivo de detección RROS propidio yoduro. Una superposición de XIN cinco fitsi y DPI en las imágenes de contraste de fase y las imágenes de fluorescencia en ImageJ. Se muestran aquí resultados representativos después de la incubación de nanopartículas con diferentes líneas celulares.La línea celular Ocar muestra la mayor captación, seguida de 5 49 y MDA MB 2 31. TE 71 no muestra ninguna fluorescencia de nanopartículas. Las mediciones de viabilidad celular en estas líneas celulares cuando se mantienen en la oscuridad se muestran mediante los gráficos de barras aquí.Prácticamente no hay muerte celular hasta las 96 horas en ninguna de las líneas celulares. La formación de ERO detectada mediante el reactivo revelador de ERO se muestra aquí para la línea celular car tres. En esta muestra control.No hay fluorescencia verde, ya que no contiene nanopartículas ni dosis de luz. Sin embargo, cuando se administran simultáneamente la nanopartícula y la dosis de luz a las células inmediatamente después de la PDT, puede observarse la intensa fluorescencia verde del reactivo revelador de R os. La viabilidad celular después de la DT se muestra aquí mediante el gráfico de barras para diversas dosis de nanopartículas.Los resultados del experimento de tinción doble de células vivas y muertas se muestran aquí, en el que la línea celular car tres sufre necrosis a dosis alta de luz, mientras que a dosis bajas de luz, las células experimentan muerte apoptótica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar nanopartículas compuestas de polímeros conductores para la aplicación en tratamientos de enfermedades basados en terapia fotodinámica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

La terapia fotodinámica (TFD) es un método no invasivo y no quirúrgico para el tratamiento del cáncer de pulmón. Los fotosensibilizadores se acumulan selectivamente en el tejido tumoral y provocan la muerte de las células tumorales en presencia de oxígeno y la longitud de onda adecuada de la luz. En este video de protocolo, se utiliza el método basado en PDT para evaluar el potencial fototóxico de un potencial fotosensibilizador en células de cáncer de pulmón.

Ensayo de fototoxicidad in vitro: un método basado en PDT para evaluar el potencial fototóxico de un fotosensibilizador en células de cáncer de pulmón

Las moléculas de colorante orgánico y las nanopartículas de conversión ascendente recubiertas de ácido oleico no son solubles en agua. Este protocolo describe un método "plug and play" que permite la transferencia de moléculas de colorante orgánico y la conversión ascendente de partículas de su solvente hidrofóbico inicial a agua.

Un método &#39;Plug and Play&#39; para crear nanoconjuntos dispersables en agua que contiene un polímero anfífilo, colorantes orgánicos y conversión ascendente Nanopartículas

Se describe un método para la estimulación de la actividad eléctrica de cultivos celulares in vitro con luz visible, basado en el uso de polímeros semiconductores orgánicos.

Control óptico de células vivas Actividad Eléctrica por conjugadas Polímeros

Se presenta un protocolo para la síntesis y preparación de nanopartículas compuestas por polímeros electroactivos.

Propiedades Electroactivos Polymer Nanopartículas Exponer fototérmica

La terapia fotodinámica (TFD) es una opción alternativa para el tratamiento del cáncer de pulmón. Para aumentar el efecto terapéutico de la TFD, se desarrollaron nanopartículas dirigidas al cáncer de pulmón combinadas con quimioterapia. Se evaluaron las eficacias anticancerígenas tanto in vitro como in vivo de la TFD con nanopartículas preparadas.

Contra el cáncer eficacia de la terapia fotodinámica con nanopartículas orientada por cáncer de pulmón

Terapia fotodinámica (TFD) es un procedimiento médico que involucra la incubación de un fotosensibilizador exógeno aplicado (PS) seguido por fotoactivación luz visible para inducir apoptosis. Presentamos un protocolo en vitro PDT diseñado para simular el PDT que puede utilizarse para estudiar las diferencias en incubación de PS y parámetros de tratamiento de la luz.

Un enfoque In Vitro de la terapia fotodinámica

La creciente incidencia de Candida albicans resistente a los medicamentos es un grave problema de salud en todo el mundo. La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) puede ofrecer una estrategia para luchar contra las infecciones fúngicas resistentes a los medicamentos. El presente protocolo describe la eficacia de la aPDT mediada por Rose bengal en una cepa de C. albicans multirresistente in vitro.

Terapia fotodinámica mediada por rosa de Bengala para inhibir Candida albicans

Aquí, describimos un dispositivo novedoso, simple y de bajo costo para realizar con éxito ensayos de terapia fotodinámica in vitro (TFD) utilizando cultivo de células HeLa bidimensionales y verteporfina como fotosensibilizador.

Un dispositivo de terapia fotodinámica construido internamente y basado en diodos emisores de luz para mejorar la citotoxicidad de la verteporina en un modelo de cultivo celular 2D

Este protocolo describe la fabricación y caracterización de un nanoensamblaje fotosensible profármaco-colorante. Se describe explícitamente la metodología para la liberación del fármaco de las nanopartículas mediante el desmontaje activado por la luz, incluida la configuración de irradiación de la luz. Los fármacos liberados de las nanopartículas después de la irradiación de luz exhibieron excelentes efectos antiproliferación en las células tumorales colorrectales humanas.

Fácil preparación y fotoactivación de nanoensamblajes profármaco-colorante

En este artículo se presenta el protocolo para la preparación de maniquíes de tejido tumoral que replican propiedades ópticas para la terapia fototérmica plasmónica. En él se detalla la preparación de maniquíes, las evaluaciones fototérmicas y la validación del modelo numérico desarrollado basado en mediciones de temperatura fototérmica para evaluar parámetros terapéuticos, ofreciendo una alternativa ética y rentable a los estudios in vivo para las pruebas preliminares.

Terapia fototérmica plasmónica contra el cáncer: fantasmas que imitan el tejido tumoral incrustados en nanopartículas para visualizar la distribución de la temperatura fototérmica

Aprende a fabricar nanopartículas fotosensibilizadoras de polímero conductor con fullereno para terapia fotodinámica del cáncer. Este método evalúa su efectividad in vitro en líneas celulares agresivas como el cáncer de ovario.

Terapia fotodinámica con Blended polímero conductor / Fullerene nanopartículas fotosensibilizadores

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