Name: Photopatterning proteínas y células en el medio ambiente acuoso Usando TiO 2 Fotocatálisis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprende a modificar superficies de andamios celulares mediante fotocatálisis de dióxido de titanio para crear microdominios proteicos. Este método permite la adhesión selectiva de células en condiciones ex situ e in situ.

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Los autores agradecen al Sr. Kotaro Okubo por su amable ayuda con las imágenes SEM. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), y por becas de investigación de la Fundación de Ciencia y Tecnología Kurata Memorial Hitachi y la Fundación Nippon Sheet Glass para la Ciencia e Ingeniería de Materiales.

1. Preparación de TiO2 presenta el revestimiento de cristal Coverslip <ol><li> Número los cubreobjetos utilizando una punta de trazar diamante. Esto no sólo ayuda a mantener un registro de cada cubreobjetos, sino también para asegurar que el lado correcto de la muestra quede hacia arriba. Limpie los cubreobjetos, primero bajo el chorro de ddH2O, a continuación, sumergiéndolas en una solución de pirañas (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Después de 10 minutos, enjuague los cubreobjetos a fondo, 8 veces en ddH2O Seque el cubreobjetos bajo flujo de N2. </li><li> Conjunto TiO 2 de destino en el sistema de pulverización catódica de radiofrecuencia (RF). Coloque el cubreobjetos sobre un soporte de muestras del equipo de pulverización catódica con una cinta de poliamida. Colocar el soporte de muestra en la cámara de pulverización catódica. Evacuar la cámara hasta que la presión alcanza 2,0 × 10 -4 Pa. </li><li> Introducir gas Ar en la cámara y ajustar la presión de deposición a 4,0 mTorr. Mientras se mantiene el obturador cerrado, aumentar gradualmentela potencia de RF a 70 W. </li><li> Abra el obturador y pulverización catódica durante 15 min para obtener una película con un espesor de 120-150 nm de (Figura 1: Paso A). Tasa de crecimiento de la película tiene que ser derivado para cada máquina. </li></ol> 2. Recubrimiento de superficie con Film celular repelente <ol><li> Hidrofilizar la superficie de TiO 2 por tratamiento de la muestra con plasma de O2, siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante del reactor de plasma. Tratamos a la muestra durante 5 min a 200 W con O 2 flujo de 100 sccm. Sumergir la muestra en ddH2O y confirme que la superficie es superhidrófila. Seque la superficie a fondo en corriente de N2. </li><li> Preparar octadecyltrichlorosilane 1 mM solución (OTS) mediante la adición de 39,6 OTS mu l a 100 ml de tolueno. Sumergir la muestra en la solución durante 1 hora a RT. Llevar a cabo este paso dentro de una bolsa de N 2 guante -filled (Figura 1: Paso B). </li><li> Para eliminar las moléculas adsorbidas, sonicate la muestra en tolueno, acetona, etanol, y ddH 2 O durante 5 min cada uno, en ese orden. Enjuagar la muestra en cuatro ocasiones en fresco ddH2O y seque la superficie bajo flujo de N2. La superficie debe ser hidrófobo con un ángulo de contacto de 100-110ºC. </li></ol> 3. Ex-Situ Patrones de superficie <ol><li> Trabajando en una campana de flujo laminar, dibujar varias marcas de arañazos con una punta de trazar diamante en la superficie. Las marcas ayudan a mantener un registro de las regiones procesados ​​y también con lo que los microscopios en el foco. Esterilizar el TiO recubierto-OTS 2 mediante la inmersión de la muestra en etanol 70% durante 5 min. Luego enjuague la muestra dos veces en esterilizada ddH2O </li><li> Colocar la muestra en una placa de 35 mm, y añadir 2 ml de medio de crecimiento PC12 (ver Paso 4.2). Incubar durante más de 3 horas en una incubadora de CO 2 (37 ° C). Este procedimiento está destinado a dejar albúminas de suero absorben sobre la superficie. Albúminas adsorbidos inhiben la posterior adsorción de otra proteins y células (Figura 1: la etapa c). </li><li> Mientras espera, configurar el microscopio de fluorescencia invertida. <ol><li> Encienda la lámpara de arco, inserte el cubo de filtro UV, y establecer la lente objetivo de 20X. </li><li> Medir la intensidad de la luz I (W cm -2) utilizando un medidor de UV de intensidad, y calcular el tiempo de irradiación t (en segundos) para una dosis de d (en J cm -2) como: t = d / I. Por ejemplo, para irradiar a una dosis de 200 J cm -2 usando una fuente de luz de 600 mW cm -2, se requiere 333 seg de la irradiación. </li><li> Use un micrómetro y cerrar el diafragma de campo para establecer el tamaño de la región a ser irradiada, por ejemplo, 200 micras. </li></ol></li><li> Después de la incubación de 3 horas, suplementar el medio con 200 l de 3,0 mg ml -1 de colágeno tipo IV (Col-IV; finales de concentración de 300 mg ml -1). </li><li> Transferir el plato de 35 mm a la platina del microscopio. Encuentra el arañazo marca, foco del microscopio sobre la superficie de la muestra, y de irradiar luz UV a una dosis de 200 J cm -2 (Figura 1: Paso D). El área de la irradiación UV puede ser alterado ya sea ajustando la abertura del diafragma de campo o mediante la sustitución del diafragma de campo con una máscara de metal de la geometría arbitral. </li><li> Sustituya el medio con un medio de crecimiento fresco (sin Col-IV) y luego colocar la muestra de nuevo en la incubadora. </li></ol> 4. Cultivo Celular <ol><li> Cultivo de rutina de las células PC12 se lleva a cabo en un plato de plástico recubierta con colágeno. <ol><li> Para cubrir una de 60 mm placa de cultivo de tejidos con Col-IV, mojar primero la superficie con ddH2O y aspirar todo ddH 2 O. </li><li> Preparar 300 mg ml -1 Col-IV diluyendo la solución original (3 mg ml -1) 10x con ddH 2 O. </li><li> Añadir 200 l de 300 mg ml -1 Col-IV por 60-mm plato. Deje que la solución se extendió a través de la superficie. </li><li> T secoque plato en una campana de flujo laminar durante aproximadamente 1 hora. </li><li> Enjuague la superficie dos veces con 4 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS). Cuando no utilice el plato recubierto de inmediato, enjuague el plato una vez con 4 ml de ddH 2 O. Después de aspirar ddH2O, almacenar el plato en la incubadora. Trate de no mantenerla almacenada durante más de dos semanas. </li></ol></li><li> Las células PC12 se cultivan en un medio de crecimiento que consiste en: Medio (bajo nivel de glucosa) de Eagle modificado por Dulbecco suero solución de penicilina-estreptomicina + 10% de suero bovino fetal al 5% + caballo + 1%. Se incuban las células en una incubadora de CO 2 (37 ° C, 5% de CO 2), y reemplazar la mitad del medio cada dos días. Células Passage antes de llegar a la confluencia. <ol><li> Aspirar el medio de crecimiento, y añadir 2 ml de PBS + (D-PBS + 10 mg ml -1 albúmina de suero bovino (BSA) + EDTA 10 mM) precalentado a 37 ° C. Incubar durante 5 minutos a 37 ° C. Golpee suavemente el plato de separar todo ceLLS. </li><li> Recoger las células en un tubo cónico de 15 ml. Enjuague el plato con 3 ml de fresco D-PBS, precalentada a 37 ° C. </li><li> Centrifugar el tubo a 150 × g durante 4 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante, y se añade 1 ml de medio de crecimiento. </li><li> Para el cultivo de rutina, dividir las células 1: 3 a 1: 5. </li></ol></li><li> Para placa células en la OTS / TiO2 muestra modificada UV, cuente densidad celular y añadir 3,0 × 10 5 células en una placa de 35 mm (Figura 1: Paso E). Incubar el plato en el incubador humidificado (37 ° C, 5% de CO 2) durante 1-2 días. Tanto el factor de crecimiento ingenua y el nervio (NGF), las células PC12 -differentiated se pueden utilizar para los experimentos de modelado. Para NGF diferenciación, 100 ng ml -1 de 7S-NGF se añade a la de crecimiento medio varios días antes en placas las células en la muestra. NGF-diferenciación parece aumentar la adhesividad de las células PC12 y hace que el manejo más fácil, especialmente en el in-situ e patronesxperimentos. </li></ol> 5. In-Situ Patrones de superficie <ol><li> Después de 1-2 días de cultivo en la superficie ex-situ modificado, confirman que las células se adhieran y crezcan sólo en la región UV-irradiado. Configure el microscopio, como se describe en el Paso 3.4. </li><li> Transferir la muestra a un nuevo 35-mm placa de cultivo tisular que contiene el medio de crecimiento, 100 ng ml -1 NGF (en el caso de la utilización de células diferenciadas-NGF), y 100 mg ml -1 Col-IV. </li><li> Coloque el plato en la platina del microscopio. Encontrar la posición adecuada, e irradiar la luz UV a una dosis de 200 J cm -2 (Figura 1: Paso F, G). La región permisiva recién creado se indica con un asterisco en la Figura 1: Paso G. </li><li> Trata de completar el procesamiento de una sola muestra dentro de los 30 min. Después de la irradiación, la transferencia de la muestra de nuevo en el medio sin Col-IV. </li><li> Tenga mucho cuidado al realizar el plato con cucélulas ltured y la transferencia de la muestra de plato a plato para evitar desprendimiento de las células estampadas. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53045/53045fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1. Esquema del proceso general. Véase el texto para más detalles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53045/53045fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En nuestro protocolo actual, TiO2 película fue formada por pulverización catódica RF-magnetrón. Estamos a favor de este método de deposición, ya que nos permite preparar de manera reproducible una fotocatalítica de TiO2 película con una rugosidad sub-nm. Aunque los procesos de deposición por pulverización catódica son familiares para los científicos de materiales e ingenieros electrónicos, puede que no sea bastante accesible para los biólogos. En ese caso, TiO 2 película spin-revestido s...

Procesos de litografía de semiconductores y sus derivados - tales como 1,2 fotolitografía, la litografía por haz de electrones 3-6, y microcontacto impresión 7.10 - se han convertido en una herramienta establecida en la biología celular a crecer las células vivas en una posición y geometría definida. El método del patrón se basa en el uso de sustratos microfabricados, que consta de micro-isla de recubrimiento permisiva celular en un fondo no permisiva. Tal sustrato sirve como una plantilla para patrón de las células. Estas tecnologías nos han proporcionado los nuevos métodos para diseñar las células y su función en un nivel de una o varias celular, para extraer las propiedades intrínsecas de las células, y para aumentar el rendimiento de cribado de fármacos basado en células 11. El grado de libertad en la morfogénesis celular aumentaría enormemente si la geometría patrón de plantilla podría ser alterado in situ, es decir, mientras que las células se cultivan sobre los sTu cara. Los métodos convencionales para la formación de patrones no pueden aplicarse directamente aquí, ya que procesan muestras en la atmósfera o en el vacío. Por lo tanto se han propuesto diversas técnicas nuevas modificación de la superficie, que se basan, por ejemplo, en compuestos fotorreactivos 12,13 5,14 o ablación con láser, sólo para nombrar unos pocos. Los métodos propuestos han sido muy bien revisado por Robertus et al. 15, y más recientemente por Choi et al. 16 y 17 por Nakanishi. Aquí en este artículo, se describe un nuevo protocolo de modificación in situ de la superficie, que se aprovecha de la descomposición fotocatalítica de moléculas orgánicas en un dióxido de titanio (TiO2) Superficie 18,19. En este método, se inserta una película de TiO 2 entre el sustrato de vidrio y la película orgánica que interconecta las células, y la película orgánica se descompone in situ por localmente irradiar luz ultravioleta (UV)luz para una región de interés (λ &lt;388 nm). Se demuestra que el nuevo protocolo se puede utilizar para crear micropatrones de proteínas de matriz extracelular y células vivas tanto ex situ como in situ. TiO2 es biocompatible, químicamente estable y ópticamente transparente, características de lo que lo hace amigable para introducir en los experimentos de cultivo celular. Este protocolo proporciona una alternativa de ciencia de los materiales de base para la modificación de los andamios de cultivo celular en medio de cultivo celular.

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-15R15</td><td>15 mm de diámetro, #1.5 de espesor</td></tr><tr><td>Trazador de diamantes</td><td>Ogura Jewel</td><td>Industry D-Point Pen</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de pulverización catódica</td><td>RF ANELVA</td><td>SPC350</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 objetivo de pulverización catódica</td><td>Kojundo Chemical Lab</td><td>Óxido de titanio (IV), objetivo</td><td>Pureza, 99,9%</td></tr><tr><td>Reactor de plasma</td><td>Yamato</td><td>PR301</td><td></td></tr><tr><td>n-octadeciltriclorosilano (OTS)</td><td>Aldrich</td><td>104817</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Wako</td><td>204-01866</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos (35&#160; mm)</td><td>Greiner</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos (60&#160; mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo IV</td><td>Nitta</td><td>Gelatina Cellmatrix Tipo IV</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td>Inactivo por calor y pasa a través de un 0.22&#160; &#956; m filtro antes de usar</td></tr><tr><td>suero de caballo</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td>Pasar a través de un 0.22&#160; &#956; m filtro antes de usar</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (100x)</td><td>Nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>7S factor de crecimiento nervioso (NGF)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-130</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo</td><td>N001</td><td>Solución madre en 0,5 M</td></tr><tr><td>TiO2 nanopartícula</td><td>Tayca</td><td>TKD-701</td><td></td></tr></tbody></table>

photopatterning proteínas y células en el medio ambiente acuoso usando tio<sub&gt; 2</sub&gt; fotocatálisis

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Los contaminantes orgánicos adsorbidos en la superficie de dióxido de titanio (TiO 2) se pueden descomponer mediante fotocatálisis bajo radiación ultravioleta (UV). Aquí se describe un nuevo protocolo que emplea la fotocatálisis TiO2 para alterar localmente afinidad de células de la superficie del sustrato. Para este experimento, una delgada película de TiO 2 fue revestido por bombardeo iónico sobre un cubreobjetos de vidrio, y la superficie de TiO 2 fue posteriormente modificado con una monocapa de organosilano derivado de octadecyltrichlorosilane (OTS), que inhibe la adhesión celular. La muestra se sumerge en un medio de cultivo celular, y se centró la luz UV se irradió a una región octogonal. Cuando un neuronales células PC12 línea celular se sembraron en la muestra, células adheridas sólo en la zona UV-irradiado. Además, muestran que esta modificación de la superficie también se puede realizar in situ, es decir, incluso cuando las células están creciendo en el sustrato. Modificación adecuada de la superficie requiere una matriz extracelular protein colágeno para estar presente en el medio en el momento de la irradiación UV. La técnica que aquí se presenta potencialmente se puede emplear en múltiples tipos de células de modelado para la construcción de sistemas de cocultivo o manipular arbitrariamente células en cultivo.

La Figura 2A muestra una imagen de microscopía electrónica de barrido de la sección transversal (SEM) de la película de TiO 2 bombardeo iónico depositado. De la observación, el espesor de la película se estimó en aproximadamente 150 nm. Notable aquí es la planitud del depositada TiO2 película. Un análisis posterior mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) reveló que la rugosidad de la raíz cuadrada media (RMS) de la superficie era de 0,2 nm (Figura 2B). <p ...

Describimos un protocolo para modificar la afinidad celular de la superficie de un andamio en un entorno acuoso. El método aprovecha la fotocatálisis de dióxido de titanio para descomponer la película orgánica en la región fotoirradiada. Demostramos que se puede utilizar para crear microdominios de proteínas de andamiaje, tanto ex situ como in situ.

Photopatterning proteínas y células en el medio ambiente acuoso Usando TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Fotocatálisis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar una modificación superficial de un andamio para cultivo celular utilizando la actividad fotocatalítica del dióxido de titanio. Esto se logra depositando una capa delgada de dióxido de titanio sobre un cubreobjetos de vidrio y luego recubriéndolo con un octadeciltriclorosilano para hacer que toda la superficie sea hidrofóbica. Como segundo paso, el sustrato se bloquea sumergiéndolo en medio de cultivo celular que contiene albúmina sérica.La albúmina se adhiere a la superficie y la hace no permisiva para la adhesión celular. A continuación, la muestra se transfiere a una solución acuosa que contiene colágeno y luego se utiliza una luz UV enfocada para irradiar la superficie. Esto permite que las moléculas de colágeno se adhieran selectivamente a la región fotoirradiada y hace que dicha región sea permisiva para la adhesión celular.Este proceso puede repetirse con el fin de trazar múltiples proteínas o tipos celulares. En este video mostramos cómo la región adhesiva de las células PC12 puede modificarse selectivamente mediante irradiación UV. Tuvimos la idea original de este método cuando nos dimos cuenta de que la fot

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

No ensuciar monocapa PEG silano se desorbe de electrodos de ITO dirigidos individualmente en el vidrio mediante la aplicación de un potencial de reducción. Redisolución electroquímica de PEG-silano capa de micro-electrodos de ITO permitido para la adhesión celular que tenga lugar de manera espacialmente definidas, con patrones celulares corresponden estrechamente con los patrones de los electrodos.

Las células de patrón indio electrodos ópticamente transparente de óxido de estaño

Este protocolo describe un método compatible con la microfabricación de patrón de células en SiO2. Un diseño parileno-C predefinido se fotolitográficamente impreso en SiO 2 obleas. Después de la incubación las células con suero (u otra solución de activación) se adhieren específicamente a (y crecen de acuerdo con la conformidad de) subyacente de parileno-C, mientras que siendo repelido por SiO 2 regiones.

Patrones celular en fotolitográficamente Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Sustratos

Se describen los procedimientos para preparar nanohilos segmentados y coaxiales mediante electrodeposición en nanoporos. Como ejemplos, se fabricaron nanocables segmentados que consisten en segmentos de Ag y ZnO, y nanocables coaxiales que consisten en una capa de TiO2 y un núcleo de Ag. Los nanocables se utilizaron en experimentos fotocatalíticos de formación de hidrógeno.

Preparación y uso de fotocatalíticamente activo segmentado Ag | ZnO y coaxial de TiO<sub&gt; 2</sub&gt; AG-nanocables hechos por electrodeposición con plantilla

Se presenta un protocolo para el crecimiento oxidativo fotoquímico de pequeñas nanopartículas cristalinas de óxido de iridio en la superficie de nanopartículas de varillas CdSe@CdS sembradas.

Fotoquímico oxidativo Crecimiento de iridio nanopartículas de óxido de CdSe @ CdS Nanorods

Este artículo investiga la idoneidad de la impresión de inyección de tinta para la fabricación de células solares sensibilizadas con colorante. Se formuló una tinta de nanopartículas de TiO2 sin aglutinante y se imprimió sobre un sustrato de vidrio FTO. La capa impresa se fabricó en una celda con un área activa de 0,25cm2 y una eficiencia del 3,5%.

Impresión digital de dióxido de titanio para células solares sensibilizadas Tinte

Un método para células completamente imprimibles, libre de fullereno, altamente aire-estable, a granel heterounión solares basadas en alcóxidos de Ti como el aceptor de electrones y la fabricación de polímero donador de electrones se describe aquí. Por otra parte, se informa de un procedimiento para controlar la morfología de la capa fotoactiva a través del volumen molecular de las unidades de Ti-alcóxido.

Control de la morfología de las células solares a granel-heterounión orgánica-inorgánica completamente para imprimir Sobre la base de un Ti-alcóxido y semiconductores de polímero

El objetivo general de este proyecto fue el uso de electrospinning para fabricar un fotoanodo con un rendimiento mejorado para las células solares sensibilizadas por colorantes.

Electrospinning de electrodos fotocatalíticos para células solares sensibilizadas por tinte

Aquí, presentamos un protocolo para preparar cromóforos de transferencia de carga basados en una membrana compuesta de Polioxometalato y polímeros.

Preparación de membranas foto-sensible Polioxometalato-basado para la foto activación de catalizadores de óxido de manganeso

Adjunto, presentamos protocolos detallados para procesado en solución yodo-bismuto-plata (Ag-Bi-I) ternario semiconductor películas delgadas fabricadas en TiO2-recubrimiento de electrodos transparentes y su aplicación potencial como aire-estable y libre de plomo dispositivos optoelectrónicos.

Solución procesada "Plata, bismuto, yodo" ternario películas delgadas para absorbedores fotovoltaicas sin plomo

Hemos incorporado directamente un tinte orgánico a base de estilbeno en un núcleo de cobaloxime para generar un diadido de catalizador fotosensibilizador para la producción fotocatalítica h2. También hemos desarrollado una configuración experimental sencilla para evaluar la producción de H2 impulsada por la luz mediante conjuntos fotocatalíticos.

Desarrollo de híbridos Fotosensibilizadores-Cobaloxime para la producción de H2 impulsada por energía solar en condiciones aeróbicas acuosas

Aquí se presenta un protocolo para explorar un conjunto universal de procedimientos experimentales para la evaluación exhaustiva de laboratorio de fotocatalizadores en el campo de la purificación ambiental, utilizando el ejemplo de la eliminación fotocatalítica de moléculas contaminantes orgánicas antibióticas del agua por compuestos de fosfato de plata sensibilizados con ftalocianina.

Un método completo para evaluar el rendimiento de fotocatalizadores para la degradación de antibióticos en la remediación ambiental

Aprende a modificar superficies de andamios celulares mediante fotocatálisis de dióxido de titanio para crear microdominios proteicos. Este método permite la adhesión selectiva de células en condiciones ex situ e in situ.

Photopatterning proteínas y células en el medio ambiente acuoso Usando TiO

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