Photopatterning proteínas y células en el medio ambiente acuoso Usando TiO

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar una modificación superficial de un andamio para cultivo celular utilizando la actividad fotocatalítica del dióxido de titanio. Esto se logra depositando una capa delgada de dióxido de titanio sobre un cubreobjetos de vidrio y luego recubriéndolo con un octadeciltriclorosilano para hacer que toda la superficie sea hidrofóbica. Como segundo paso, el sustrato se bloquea sumergiéndolo en medio de cultivo celular que contiene albúmina sérica.

La albúmina se adhiere a la superficie y la hace no permisiva para la adhesión celular. A continuación, la muestra se transfiere a una solución acuosa que contiene colágeno y luego se utiliza una luz UV enfocada para irradiar la superficie. Esto permite que las moléculas de colágeno se adhieran selectivamente a la región fotoirradiada y hace que dicha región sea permisiva para la adhesión celular.

Este proceso puede repetirse con el fin de trazar múltiples proteínas o tipos celulares. En este video mostramos cómo la región adhesiva de las células PC12 puede modificarse selectivamente mediante irradiación UV. Tuvimos la idea original de este método cuando nos dimos cuenta de que la fotocatálisis con dióxido de titanio se aplica comercialmente en ventanas de vidrio autolimpiantes que eliminan contaminantes orgánicos de la superficie mediante radiación luminosa, demostrando que el procedimiento será codirigido por un estudiante de posgrado de mi laboratorio.

Comience numerando los cubreobjetos con un punzón de diamante de manera que ayude a asegurar que el lado correcto de la muestra quede hacia arriba. Luego limpie los cubreobjetos primero bajo agua doblemente destilada corriente y después sumergiéndolos en solución piraña durante 10 minutos. Pasados los 10 minutos, enjuague los cubreobjetos ocho veces con agua doblemente destilada y séquelos con flujo de nitrógeno.

A continuación, coloque un blanco de óxido de titanio en un sistema de pulverización catódica de radiofrecuencia y luego sujete las laminillas limpias al portamuestras utilizando cinta de poliamida. Coloque el portamuestras en la cámara de pulverización y evacúe la cámara hasta que la presión alcance 2,0 × 10⁻⁴ pascales. A continuación, introduzca gas argón en la cámara y ajuste la presión de deposición a 4,0 mTorr, manteniendo la compuerta cerrada. Aumente gradualmente la potencia de RF hasta 70 vatios.

Luego abra el obturador y realice la pulverización durante 15 minutos para obtener una película con un espesor de 120 a 150 nanómetros. Comience secando un vaso de precipitados y pinzas en un horno a 120 grados Celsius durante 30 minutos. A continuación, coloque los cubreobjetos en un reactor de plasma y trate la superficie de dióxido de titanio con plasma de oxígeno durante cinco minutos a 200 vatios con un flujo de oxígeno de 100 centímetros cúbicos estándar por minuto para crear una superficie más hidrofílica.

Luego retire las muestras y sumérjalas en agua doblemente destilada para confirmar que la superficie es superhidrofílica y seque completamente la superficie con flujo de nitrógeno. A continuación, transfiera las muestras, el vaso seco y la pinza a una bolsa de guantes llenada con nitrógeno y prepare una solución de un milimolar de octodesiltricloroetileno disuelta en tolueno. Sumerja la muestra en la solución durante una hora a temperatura ambiente para formar una monocapa autoensamblada sobre el óxido de titanio.

Luego elimine cualquier molécula de fasor lavando la muestra con tolueno, acetona y etanol, y finalmente con agua doblemente destilada durante cinco minutos cada uno. A continuación, enjuague la muestra cuatro veces con agua doblemente destilada fresca y seque la superficie con flujo de nitrógeno.

Sterilice los cubreobjetos recubiertos sumergiendo las muestras en etanol al 70 % durante cinco minutos. Luego enjuague las muestras dos veces con agua doblemente destilada estéril. A continuación, coloque la muestra en una placa de 35 milímetros y agregue dos mililitros de medio de crecimiento PC12.

Incube las muestras durante al menos tres horas en un incubador tamponado con CO₂ a 37 grados Celsius mientras la albúmina sérica en el medio se adhiere a la superficie de las laminillas durante la espera. Configure el microscopio de fluorescencia invertido encendiendo primero la lámpara de arco. Luego inserte el cubo de filtro UV y gire el objetivo hasta uno con aumento de 20 x.

Mida la intensidad de la luz con un medidor de intensidad UV y calcule el tiempo de irradiación para una dosis de 200 joules por centímetro cuadrado. A continuación, utilice un micrómetro de portaobjetos y ajuste el diámetro de la región que se irradiará a 200 micrones mediante el ajuste del diafragma de campo. Después de la incubación de tres horas, suplemente el medio que cubre las laminillas con 200 microlitros de colágeno tipo cuatro a 3,0 miligramos por mililitro.

Luego, transfiera el platillo de 35 milímetros al portaobjetos del microscopio y enfoque el microscopio sobre la superficie de la muestra utilizando las marcas de rayado. Irradie un área del cubreobjetos con luz UV a una dosis de 200 joules por centímetro cuadrado. A continuación, reemplace el medio con dos mililitros de medio de crecimiento fresco, con NGF y sin colágeno tipo cuatro, y coloque la muestra nuevamente en el incubador.

Recolecte las células PC 12 diferenciadas con NGF cultivadas en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue el tubo a 150 ×g durante cuatro minutos. Luego aspire el sobrenadante y agregue un mililitro del medio de crecimiento. Resuspenda las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo usando un hemocitómetro.

Contar la densidad celular y agregar 3,0 × 10⁵ células a una placa de 35 mm que contenga los cubreobjetos modificados. Incubar la placa durante uno o dos días en un incubador con 5% CO₂ a 37 °C, tras uno o dos días de cultivo sobre la superficie modificada XC dos. Utilizar un microscopio para confirmar que las células se están adhiriendo y creciendo únicamente en la región irradiada con UV de los cubreobjetos.

Luego, agregue 67 microlitros de colágeno tipo IV al cultivo celular de modo que la concentración final de colágeno sea de 100 microgramos por mililitro con el microscopio configurado para el modelado de superficies. Coloque el cultivo sobre la platina del microscopio y posicione la región de irradiación adyacente a la ubicación actual de las células. Irradiar el portaobjetos con luz ultravioleta a una dosis de 200 julios por centímetro cuadrado.

Después de la irradiación, reemplace el medio por uno sin colágeno y coloque la muestra nuevamente en el incubador, intentando completar el procesamiento de una sola muestra dentro de los 30 minutos. Esta es una imagen de microscopía electrónica de barrido de sección transversal de la película de dióxido de titanio depositada por pulverización catódica. A partir de la observación, se estimó que el espesor de la película era aproximadamente 150 nanómetros.

También es notable aquí la planicidad de la película de dióxido de titanio depositada. Un análisis adicional mediante microscopía de fuerza atómica reveló que la rugosidad cuadrática media de la superficie era de solo 0,2 nanómetros. El colágeno tipo IV y la solución se absorben preferentemente en la región irradiada con UV, donde el láser desplaza la albúmina.

Para demostrar la versatilidad de este enfoque, otras proteínas como la fibrina también han sido impresas utilizando la misma técnica. Aquí, las células están creciendo en la región de dos patrones XC del cubreobjetos y justo al lado de ellas, en el área definida por la línea punteada. El cubreobjetos fue recientemente irradiado con UV in situ dos veces y recubierto con colágeno tipo cuatro.

En los próximos cinco días, las células proliferan y migran para cubrir la región recién codificada. El procedimiento aquí presentado puede utilizarse para manipular arbitrariamente células en cultivo y, potencialmente, para configurar múltiples tipos de células con el fin de construir sistemas de co-cultivo complejos.