Name: Preparación y Caracterización de Individual y Multi-fármaco cargado físicamente atrapado poliméricos micelas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a preparar y caracterizar micelas poliméricas cargadas con fármacos mediante el método de evaporación de disolvente. Esta técnica permite evaluar la estabilidad, tamaño y liberación in vitro para aplicaciones en sistemas de liberación controlada.

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Este estudio fue financiado por la subvención del Programa de Premios de Investigación de la Facultad de Nueva Farmacia de la AACP, la Subvención para Nuevos Investigadores de la Fundación de Investigación Médica de Oregón, el fondo de inicio de la Universidad Estatal de Oregón y el fondo de inicio de la Facultad de Farmacia de la Universidad del Pacífico.

1. Preparación de individuales y de múltiples drogas micelas cargadas por medio de fusión solvente <ol><li> Pesar DTX 1 mg o EVR 1 mg o ambos fármacos a 1 mg cada una de las micelas duales de drogas (DDM). </li><li> Pesar 15 mg de PEG 2000 - b PLA 1800 o PEG 4000 - b PLA 2200, ya sea individual o de DDM. </li><li> Disolver los fármacos / drogas y el polímero en 0,5 ml de acetonitrilo y el lugar en un matraz de fondo redondo de 5 ml. </li><li> Formar una película de polímero de drogas distribuido delgada por evaporación de la (s) solución de acetonitrilo -polymer droga bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio. Ajuste el evaporador rotatorio a 100 rpm, la temperatura del baño de agua de 40 ° C y una presión de vacío de 260 mbar durante 5 min seguido de una reducción a 100 mbar durante 3 min más. </li><li> Rehidratar la película de polímero de droga con 0,5 ml de agua desionizada a 50 ° C y agitar suavemente el frasco para formar las micelas. </li><li> Filtrar el resultadoing solución micelar a través de un filtro de nylon de 0,2 micras para eliminar cualquier fármaco o contaminantes no-disuelto en un tubo de 1,5 ml de centrífuga. </li></ol> 2. Evaluación de la carga de fármaco y la estabilidad en micelas Usando inversa fase cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) <ol><li> Realizar análisis de RP-HPLC con una columna C8 equilibriated a 40 ° C en un modo isocrático con una fase móvil de acetonitrilo / agua (62/38) que contiene ácido fosfórico 0,1% y 1% de metanol a una velocidad de flujo de 1 ml / min y un volumen de inyección de 10 microlitros. </li><li> Diluir micelas recién preparados (sección 1) 1: 100 en fase móvil antes de analizar por RP-HPLC para determinar la carga inicial de drogas. Tienda micelas individuales sin diluir y DDM a temperatura ambiente (25 ° C) durante 48 horas y se preparan frescas 1: 100 muestras diluidas en fase móvil para volver a evaluar por RP-HPLC y determinar fármaco (s) la estabilidad de las micelas de más de 24 horas. </li><li> Monitorear DTX y EVR picos a 227 y 279 nm, respectivamentecon tiempos de retención de 1,7 y 5,7 min, respectivamente. Realizar todas las mediciones por triplicado. Los datos actuales como la carga media ± SD de drogas. </li></ol> 3. Evaluación de las partículas de micelas Tamaño por Dynamic Light Scattering (DLS) <ol><li> Diluir micelas recién preparado (como se describe en la sección 1) en agua desionizada en una proporción de 1:20 para dar una concentración final de polímero de 1,5 mg / ml. </li><li> Medir la intensidad de láser de He-Ne (633 nm) a 173 ° para determinar la dispersión. Llevar a cabo todas las mediciones a 25 ° C después de pre-equilibrado durante 2 min. </li><li> Realizar todas las mediciones por triplicado. Los datos se presentan como el tamaño medio Z de la media ± SD junto con el índice de polidispersidad (PDI) de la distribución. </li></ol> 4. Evaluación de In Vitro Drogas lanzamiento de micelas individuales y DDM <ol><li> Preparar micelas individuales y DDM, como se describe en el apartado 1. Cargue 2,5 ml de las micelas en un casete de 3 ml de diálisis conuna línea de corte de peso molecular (MWCO) de 7.000 g / mol. NOTA: Este MWCO fue elegido para permitir que el fármaco libre (s), junto con las moléculas de polímero no asociados a difundirse libremente fuera de la casete y con ello garantizar condiciones de inmersión. </li><li> Coloque los cassettes en 2.5 L de 10 mM pH 7,4 tampón de fosfato (preparada por dilución de solución madre 200 mM) y cambiar el tampón cada 3 horas para asegurar condiciones de inmersión. Mantener la temperatura del tampón a 37 ° C durante toda la duración del experimento. </li><li> A 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, y 48 hr, retirar 150 ml de la solución en los cassettes y reemplazar con 150 l de tampón fresco. </li><li> Analizar las muestras usando RP-HPLC según lo establecido en el apartado 2 para determinar la concentración del fármaco. Curva-ajusta a los datos de liberación del fármaco (s) sobre la base de un modelo de difusión simple con una fase de asociación exponencial el uso de software stastitical. </li><li> Calcule el tiempo necesario para alcanzar el 50% de la liberación del fármaco (t 1/2) de la edrogas ada en micelas o DDM individuales en base a la curva de ajuste. Realizar todas las mediciones de cuatrillizos. </li></ol>

<ol><li>Yokoyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+as+a+new+drug+carrier+system+and+their+required+considerations+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials.</a> Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).</li>
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<li>Shin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3-in-1+polymeric+micelle+nanocontainer+for+poorly+water-soluble+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs.</a> Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).</li>
<li>Hasenstein, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+Triolimus%3A+a+novel+multidrug-loaded+micelle+containing+Paclitaxel+Rapamycin%2C+and+17-AAG%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG.</a> Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).</li>
<li>Mazzaferro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bivalent+sequential+binding+of+docetaxel+to+methyl-beta-cyclodextrin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin.</a> Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).</li>
<li>Iwase, Y., Maitani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+in+vivo+evaluation+of+liposomal+everolimus+for+lung+carcinoma+and+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma.</a> Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).</li>
<li>Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+effect+of+docetaxel+and+everolimus+as+individual+and+dual-drug-loaded+micellar+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers.</a> Pharm Res. 31, 660-669 (2014).</li>
<li>Xu, W., Ling, P., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles%2C+a+promising+drug+delivery+system+to+enhance+bioavailability+of+poorly+water-soluble+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs.</a> J Drug Deliv. 2013, 340315(2013).</li>
<li>Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29-block-poly%28L-amino+acid%29+micelles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de micelas poliméricas para la administración de fármacos continúa expandiéndose debido a su versatilidad y capacidad para administrar medicamentos hidrofóbicos para diversos estados de enfermedad. Por lo tanto, las técnicas necesarias para preparar y caracterizar estas formulaciones antes de su uso en cultivos celulares o animales son un primer paso crítico para determinar el mejor emparejamiento entre el fármaco y el polímero. Los PEG-b-PLA son excelentes copolímeros de bloque anfifílico para la admin...

Copolímeros en bloque anfifílicos con estructura repitiendo compuestas de dominios hidrófilos e hidrófobos pueden espontáneamente auto-ensamblan para formar tres asambleas macromoleculares tridimensionales conocidos como micelas poliméricas. Estas estructuras tienen un núcleo hidrófobo interior rodeado por una envoltura hidrofílica. El núcleo hidrófobo tiene la capacidad de incorporar fármacos hidrofóbicos, ya sea por atrapamiento físico a través de interacciones hidrófobas o por conjugación química a la cadena principal del polímero. 1 existir muchas ventajas de utilizar estos copolímeros de bloques para formar micelas para la administración de fármacos. Estos incluyen la incorporación de fármacos poco solubles, mejorando farmacocinética de los fármacos incorporados, y la biocompatibilidad y / o de biodegradabilidad de los polímeros los hace una alternativa segura a solubilizantes convencionales. 2 Otra ventaja de usar micelas poliméricas es su tamaño de partícula coloidal, entre 15- 150 nm 3, que las hace atractivas para los paentrega renteral. Por lo tanto, en los últimos 20 años micelas poliméricas han surgido como sistemas de administración de fármacos viables para fármacos poco solubles en agua, especialmente para la terapia del cáncer. 3,4 Actualmente hay cinco formulaciones micelares poliméricos para la terapia del cáncer sometidos a ensayos clínicos. 4 Cuatro de las micelas en los ensayos clínicos son copolímeros de dos bloques a base de PEG, mientras que el último es un copolímero de tres bloques que contiene óxido de polietileno. El tamaño de estas micelas varió de 20 nm a 85 nm. La ventaja de usar polímeros basados ​​en PEG es su biocompatibilidad y dependiendo de la segunda bloque también puede ser biodegradable. Nuevos sistemas de administración de fármacos recientemente basados ​​en bloque polyethyleneglycol- ácido -polylactic (PEG- b PLA) micelas poliméricas se han desarrollado para la entrega simultánea de varios medicamentos contra el cáncer. Las micelas de PEG-b-PLA son tanto biocompatible y biodegradable. Estos múltiples fármacos micelas cargadas han mostrado comoynergistic inhibición de diferentes modelos de cáncer en vitro e in vivo 2,5,6 y encajar en el paradigma actual de la utilización de múltiples fármacos en la quimioterapia para prevenir la resistencia y la reducción de la toxicidad. Por lo tanto, hay una gran cantidad de interés en preparar y caracterizar estos sistemas de administración de fármacos micelares para su uso en el cáncer y otros estados de enfermedad. En el trabajo a continuación hemos esbozado un proceso paso a paso por el cual dichas micelas pueden ser preparados y caracterizados antes de evaluar en estados patológicos de interés. Para el propósito de este trabajo dos agentes contra el cáncer poco solubles, docetaxel (DTX) y everolimus (EVR) se han elegido. Tanto DTX y EVR son compuestos poco solubles en agua con solubilidades intrínsecas de agua en el 1,9 y 9,6 mg / ml, respectivamente. 7,8 Dos PEG-polímeros b -pla con diferentes pesos moleculares se utilizaron en este protocolo como los bloques de construcción para la polimérico formulado micelas,estos polímeros son PEG 2000 - b PLA 1800 (3800 Da) y PEG 4000 - b PLA 2200 (6200 Da). Por lo tanto, PEG-micelas b -pla pueden proporcionar una plataforma única como nanotransportador para DTX y EVR individualmente y en combinación. Los Reactivos / Materiales y equipos requeridos necesarios para preparar y caracterizar estas micelas se enumeran en la Tabla 1.

<table><tbody><tr><td>PEG2000-b-PLA1800</td><td>Advanced Polymer Materials, Inc</td><td>6-01- PLA/2000</td><td>PLA MW se puede especificar al realizar el pedido</td></tr><tr><td>PEG4000-b-PLA2200</td><td>Advanced Polymer Materials, Inc</td><td>6-01- PLA/4000</td><td>PLA MW se puede especificar al realizar el pedido</td></tr><tr><td>Docetaxel</td><td>LC Laboratories</td><td>D-1000</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Everolimus</td><td>LC Laboratories</td><td>E-4040</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-AX0145-1</td><td>Grado de HPLC; 4 L</td></tr><tr><td>Matraz de fondo redondo&nbsp;</td><td>Glassco/VWR</td><td>89426-496</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>RV 10 Evaporadores rotativos de control</td><td>IKA Works</td><td>8025001</td><td>Rotoevaporador</td></tr><tr><td>Shimadzhu HPLC con detector DAD</td><td>Shimadzhu</td><td></td><td>RP-HPLC</td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer casete de diálisis MWCO 7000</td><td>Thermo Scientific, Inc</td><td>66370</td><td>3 ml</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato pH 7,4, 200 mM</td><td>VWR</td><td>100190-870</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Malvern NanoZS</td><td>Malvern Instruments, Reino Unido</td><td></td><td>DLS</td></tr><tr><td>Filtro de nylon</td><td>Acrodisc/VWR</td><td>28143-242</td><td>13 mm; 0,2 y micro; M</td></tr><tr><td>Ácido fosfórico, NF</td><td>Spectrum Chemical/VWR</td><td>700000-626</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td><a href="http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com</a></td><td></td><td>Software de análisis</td></tr><tr><td>Cartucho Zorbax SB-C8 Rapid Resolution&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>866953-906</td><td>4.6 y veces; 75 mm, 3,5 &#956; m</td></tr></tbody></table>

preparación y caracterización de individual y multi-fármaco cargado físicamente atrapado poliméricos micelas

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Copolímeros en bloque anfifílicos como bloque polyethyleneglycol- ácido -polylactic (PEG-b-PLA) se auto-ensamblan en micelas por encima de su concentración micelar crítica forman núcleos hidrofóbicos rodeadas de conchas hidrófilas en medios acuosos. El núcleo de estas micelas puede ser utilizado para cargar fármacos hidrófobos, mal solubles en agua como docetaxel (DTX) y everolimus (EVR). Caracterización sistemática de las capacidades de la estructura micelar y carga de drogas son importantes antes de in vitro e in vivo puede ser llevado a cabo. El objetivo del protocolo descrito en este documento es proporcionar los pasos de caracterización necesarias para lograr productos micelares estandarizados. DTX y EVR tienen solubilidades intrínsecas de 1,9 y 9,6 g / ml, respectivamente Preparación de estas micelas puede lograrse mediante colada en disolvente que aumenta la solubilidad acuosa de DTX y EVR a 1,86 y 1,85 mg / ml, respectivamente. Estabilidad del fármaco en micelas evaluated a temperatura ambiente durante 48 hr indica que el 97% o más de los fármacos se mantienen en solución. Tamaño de micelas se evaluó mediante dispersión de luz dinámica e indicó que el tamaño de estas micelas estaba por debajo de 50 nm y dependía del peso molecular del polímero. La liberación del fármaco a partir de las micelas se evaluó mediante diálisis en condiciones de inmersión a pH 7,4 a 37 ° C durante 48 hr. Resultados de ajuste de curvas indican que la liberación del fármaco es impulsado por un proceso de primer orden que indica que está impulsado difusión.

DTX individual o micelas EVR y DTX y EVR DDM en PEG-b PLA micelas se formulan con éxito en cualquiera de PEG 4000 - b PLA 2200 o PEG 2000 - b PLA 1800 (Figura 1). DTX, EVR, y el DDM mostraron una estabilidad similar en PEG 4000 - b PLA 2200 o PEG 2000 - b PLA 1800 más de 48 horas (Figura 2). Carga de fármaco inicial ...

El objetivo de este protocolo es describir la preparación y caracterización de fármacos físicamente atrapados y poco solubles en agua en sistemas micelares de administración de fármacos compuestos por copolímeros de bloques anfifílicos.

Preparación y Caracterización de Individual y Multi-fármaco cargado físicamente atrapado poliméricos micelas

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

El objetivo general del siguiente experimento es describir un proceso paso a paso para preparar y caracterizar células My cargadas con fármacos antes de evaluarlas en estados patológicos de interés. Esto se logra preparando las células My mediante el método de colado en disolvente para generar células My reproducibles para el estudio. Como segundo paso, se evalúa la estabilidad del cargado y el tamaño de las células My, lo cual determina la capacidad de estas células para cargar y retener concentraciones clínicamente relevantes.A continuación, se determina la velocidad de liberación del fármaco a partir de las células My para asegurar que dichas células presenten características adecuadas de liberación in vitro antes de evaluar su estabilidad in vivo. Los resultados muestran que las células My estables generadas de manera reproducible pueden proporcionar una plataforma para desarrollar sistemas de administración de fármacos en diversos estados patológicos, basándose en las técnicas de evaluación aquí presentadas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la carga en equilibrio o los métodos de diálisis es que las miosinas pueden prepararse mucho más rápi

preparation-characterization-individual-multi-drug-loaded-physically

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Química

En este artículo se describe un método para sintetizar nanoprecipitation a base de polímeros con nanopartículas de copolímeros de bloque doble. Vamos a discutir la síntesis de copolímeros de bloque doble, la técnica nanoprecipitation, y sus posibles aplicaciones.

Formulación de nanopartículas poliméricas mediante la técnica de dibloque Nanoprecipitation

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Preparación y caracterización de lipofílico Doxorrubicina micelas profármaco

Se describen los pasos clave de polimerización aniónica viviente de fenilglicidiléter (PheGE) de metoxi-polietilenglicol (mPEG b -PPheGE). Las micelas de copolímero de bloque resultante (BCMS) fueron cargados con doxorrubicina 14% (% en peso) y la liberación sostenida de fármaco durante 4 días bajo fisiológicamente se obtuvieron condiciones pertinentes.

La polimerización aniónica de un copolímero anfífilo para la Preparación de micelas de copolímeros de bloques estabilizados por interacciones de apilamiento π-pi

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