El estudio de la función de proteínas y el Papel de la expresión de la proteína alterada por la interferencia de anticuerpos y reconstrucciones tridimensionales

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar las funciones de las proteínas y el papel de la expresión alterada de proteínas de una manera eficiente y estrictamente controlada. Esto se logra mediante la aplicación de anticuerpos para reducir la cantidad de proteína funcional disponible para la célula. Para lograr esto, los anticuerpos se acoplan a un péptido llamado Chariot, que media el paso a través de las membranas celulares.

A continuación, se obtienen imágenes de las estructuras celulares de interés y se reconstruyen en 3D para evaluar los efectos del tratamiento. Los resultados revelan que los péptidos Chariot son particularmente adecuados para dirigirse a las proteínas nucleares mediante la interferencia de anticuerpos. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como la interferencia de ARN, son que los anticuerpos transportados a la célula son efectivos de inmediato, y que el investigador puede controlar estrictamente el grado de interferencia ajustando las dosis de anticuerpos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las funciones de las proteínas en muchos tipos de células, es particularmente interesante para dirigirse a las proteínas en cultivos neuronales primarios, que son muy sensibles a los tratamientos pero toleran Chariot muy bien. En preparación, vuelva a suspender el polvo de péptido Chariot liofilizado en agua estéril a dos microgramos por microlitro. Golpee el tubo con cuidado para mezclar el polvo con la solución.

Luego prepare pequeñas alícuotas de trabajo, solo se necesitan dos microlitros para cada reacción, y almacene las alícuotas a 20 grados centígrados. A continuación, prepare las células de mamíferos para la transfección sembrándolas en una placa de 24 pocillos con medio mililitro de medio que contenga antibióticos. Cuando use neuronas, siembre las células solo en las dos filas centrales y a una densidad baja.

Los pozos vacíos son útiles más adelante. Sé rápido. Las neuronas cultivadas no deben estar fuera de la incubadora durante más de unos minutos.

Hasta que las neuronas estén en la etapa de desarrollo deseada, intercambian alrededor de un cuarto a la mitad de su medio dos veces por semana. Los cultivos no neuronales deben utilizarse cuando las células están al 50% de confluencia. El siguiente procedimiento se muestra para seis pruebas y seis muestras de control.

Para cada carga, prepare una dilución de 0,1 a 2 microgramos en 50 microlitros de 1X PBS por muestra. Los complejos macromoleculares de anticuerpos primarios y secundarios preunidos también se pueden utilizar como carga. Mezcle la solución con un vórtice suave, seguido de una breve centrifugación.

A continuación, diluya dos microlitros de solución madre de Chariot en 50 microlitros de PBS para cada reacción. Utilice tubos separados para cada muestra con el fin de evitar la autoasociación de Chariot. Ahora, combine las proteínas preparadas en las diluciones de Chariot.

Mezclar y girar las proteínas combinadas. Incubar la muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de carga de Chariot. La cantidad óptima de péptido proteico depende de la carga y del tipo de célula utilizada.

Por lo tanto, esta cantidad debe determinarse empíricamente. Con anticipación, precaliente algún medio de crecimiento sin aditivos, así como 1X PBS que contenga cloruro de magnesio y cloruro de calcio de 0,5 milimolares a 37 grados centígrados. Ahora, para comenzar, diluya los complejos de Chariot preparados con 100 microlitros de medio.

Retire el medio de las celdas enchapadas y transfiéralo a los pocillos vacíos para su reutilización. A continuación, lave las células suavemente con 500 microlitros de solución precalentada de PBS, calcio y cloruro de magnesio. Aplique el medio que transporta los complejos de Chariot a las células y balancee la placa suavemente para asegurar una distribución uniforme de la solución.

Regrese rápidamente las celdas a la incubadora y espere una hora antes de preceder. En el caso de las neuronas, después de una hora de incubación, transfiera los medios guardados a los pocillos. Para todas las demás células, agregue suero hasta una concentración final del 10%Las neuronas cultivadas son muy sensibles, por ejemplo, a los cambios en la temperatura del medio y el pH.

Por lo tanto, estas células deben lavarse y transfectarse suavemente con soluciones precalentadas y devolverse a la incubadora lo antes posible. Continúe la incubación durante el tiempo que sea necesario, dependiendo de la carga transfectada y del tipo de célula. Después de la incubación, procese las células para los análisis posteriores como de costumbre.

Los protocolos de fijación, así como las imágenes en vivo, son compatibles con esta técnica. Utilizando un microscopio de escaneo láser con una lente 63X, tome imágenes a una distancia de aproximadamente 0,25 a 0,5 micras para obtener pilas Z de suficiente detalle y evitar el blanqueamiento. La distancia precisa de la capa depende del tamaño de la estructura a reconstruir y debe determinarse individualmente.

Para la reconstrucción de imágenes, abra los archivos LSM en Imaris. Con este software, el botón Escape se utiliza para cambiar entre Seleccionar y Navegar. Además, se pueden seleccionar varios objetos manteniendo pulsada la tecla Control.

Usando el Ajuste de pantalla, entra en cada canal y ajusta el contraste hasta que las estructuras más brillantes alcancen la saturación. Este ajuste no influye en la construcción de la superficie, pero ayuda a umbralizar la imagen. Si el objeto que se va a reconstruir está contenido en archivos diferentes, utilice la función Editar y agregar sectores para combinar los archivos correspondientes.

A continuación, haga clic en el icono Agregar nuevas superficies y seleccione Segmentar solo una región de interés. Ahora, ajuste los márgenes del cuadro de selección para que se ajusten al objeto de interés. Ajuste la forma y la inclinación de la forma rectangular hasta que todas las estructuras requeridas estén dentro de la caja.

La selección debe ajustarse en cada imagen a través del plano Z. Los objetos no deseados pueden eliminarse más adelante. A continuación, seleccione un canal adecuado.

Para continuar, utilice la herramienta de umbrales para reconstruir la estructura de interés. El nivel de detalle del área de superficie, o diámetro de la esfera, debe establecerse para que coincida con las estructuras que se están reconstruyendo. Dependiendo de las características de la señal, se puede utilizar la intensidad absoluta o el contraste local.

Por lo general, el contraste local funciona mejor para las señales difusas. Debido a las características de esta señal, se utiliza el contraste local para reconstruir la proteína dentro del núcleo. En cualquier caso, la configuración debe ajustarse por separado para cada señal o estructura de interés.

Completa la reconstrucción haciendo clic en la flecha verde en la parte inferior de la pantalla. A continuación, ajusta aún más el objeto con la herramienta Lápiz. Compare cuidadosamente las reconstrucciones con la señal original y corte y elimine superficies inclinando las imágenes según sea necesario para que la herramienta Corte pueda cumplir su propósito con precisión.

Ahora, mida el volumen, el área y las intensidades de cada superficie seleccionando Estadísticas, Estadísticas detalladas y Valores promedio. Si se desea, se pueden generar estadísticas codificadas por colores seleccionando la pestaña Color de la superficie correspondiente y cambiando la opción seleccionada de Base a Codificación de estadísticas. Empleando la herramienta Tomar instantánea, se pueden tomar fotografías para su publicación.

Si se van a reconstruir varios objetos dentro de la misma región, se puede utilizar la función Almacenar parámetros para guardar la información. El simiato expresado en las células HEK293 fue detectado específicamente por los anticuerpos simiato transportados a las células por los péptidos Chariot. Los ensamblajes de anticuerpos simiato entran en el soma y en el núcleo, después de la aplicación, donde se colocalizan específicamente con FLAG-Simiato como lo marcan las flechas amarillas.

De manera dependiente de la dosis, los anticuerpos Simiato indujeron una apoptosis masiva en las células HEK293, mientras que los anticuerpos de control no tuvieron ningún efecto. Dado que las células neuronales son muy sensibles a los efectos tóxicos, la técnica se aplicó a cultivos primarios de hipocampo donde no hubo ningún efecto sobre la viabilidad de las neuronas al comparar células simuladas o no tratadas con Chariot. Siguiendo el mismo esquema de aplicación, se observaron ensamblajes de anticuerpos anti-conejillo de indias Alexa568 en aproximadamente el 83% de las células donde ocurrieron en somata, así como en núcleos en diversos grados.

Estas observaciones fueron respaldadas por un análisis 3D, que fue consistente con los resultados de las células HEK293. Por lo tanto, la técnica de Chariot se puede utilizar con éxito para transfectar neuronas primarias disociadas del hipocampo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres a seis horas si se realiza correctamente.

La compleja formación de Chariot y la proteína de interés tarda unos 40 minutos. Para transfectar las celdas con estos complejos, se necesitarán 70 minutos y de una a cuatro horas adicionales, dependiendo del tamaño y las propiedades de la carga. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para analizar la función de una proteína con más detalle, como imágenes en vivo y ensayos de motilidad, análisis y registros electrofisiológicos.