Enriquecimiento de la Matriz Extracelular Las proteínas de los tejidos y la digestión en péptidos para el análisis de espectrometría de masas

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar la composición de matrices extracelulares a partir de tejidos mediante espectrometría de masas. Esto se logra rompiendo primero el tejido seleccionado hasta que esté completamente homogeneizado. El segundo paso consiste en descelularizar el tejido para enriquecerlo y obtener proteínas de la matriz extracelular y, al mismo tiempo, agotar los componentes intracelulares.

A continuación, la muestra de proteína enriquecida con ECM se desnaturaliza en el paso final, la muestra de proteína enriquecida con ECM desnaturalizada se glicosila y se digiere en péptidos. El análisis de sangre occidental se utiliza para controlar la calidad de la descelularización y el enriquecimiento de la proteína ECM. En última instancia, el análisis por espectrometría de masas de los péptidos permite caracterizar la composición de la MEC para ese tejido en particular.

Este método puede proporcionar información sobre la composición de la matriz extracelular de los tejidos normales, pero también se puede aplicar a otros sistemas, como el tejido enfermo como el cáncer. Para comenzar, prepare todos los búferes como se indica en el protocolo de texto. Tabla uno, incluyendo la adición de inhibidores de la proteasa.

A continuación, interrumpa 100 miligramos de tejido en 500 microlitros de tampón C con un homogeneizador de tejidos hasta obtener una suspensión uniforme. Transfiera el homogeneizado a un rotador de tubos e incube durante 20 minutos. A cuatro grados centígrados, la tubería tenía de 10 a 20 microlitros de la muestra en un tubo etiquetado como extracto de tejido total o flash de material de partida. Congele la muestra en nitrógeno líquido y guárdela a menos 80 grados centígrados.

A continuación, centrifugar el homogeneizado a 16.000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante en un tubo limpio y etiquételo como fracción citosólica o C. Flash. Congele la fracción C y guárdela a menos 80 grados centígrados.

Pipetea allí. Suspenda el pellet en 400 microlitros de tampón doble y luego incube en un tubo rotador durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, centrifuga la muestra y desecha el sobrenadante para extraer primero las proteínas nucleares.

Vuelva a suspender el pellet en 150 microlitros de tampón N e incube en un rotador de tubos durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, centrifuga la muestra y recoge el sobrenadante en un tubo limpio. Repita la incubación en el tampón N después de la centrifusión.

Combine los sobrenadantes y etiquételos como la fracción nuclear o N. Flash. Congele la fracción N para almacenarla a menos 80 grados centígrados. Añadir 100 microlitros de tampón M y resus, suspender el pellet.

A continuación, incube la muestra en un tubo rotador durante 30 minutos a cuatro grados centígrados antes de centrifugarla. Recoja el sobrenadante en un tubo limpio y etiquételo como membrana o fracción M flash. Congele la fracción M y guárdela a menos 80 grados centígrados.

Vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de tampón CS pipeteando enérgicamente y, a continuación, incube la muestra en un rotador de tubos durante 30 minutos. A temperatura ambiente, centrifugue la muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente y recoja el sobrenadante en un tubo limpio y etiquételo como fracción del citoesqueleto o CS. El pellet ahora debería ser notablemente más pequeño.

Vuelva a suspender el pellet en 150 microlitros de tampón C. Transfiera la muestra a un rotador de tubos e incube durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Centrifugar durante 20 minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante. A continuación, combine el sobrenadante con el del tampón CS en el tubo ya marcado como fracción del citoesqueleto o CS. Flash.

Congele la fracción CS y guárdela a menos 80 grados centígrados. Para lavar el pellet resus. Suspenderlo en 500 microlitros de PBS y luego incubar en un tubo rotador durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Centrifugar el tubo y desechar el sobrenadante. Lavar un total de tres veces. Para obtener el pellet enriquecido con ECM, almacene una pequeña fracción de la fracción ECM para el análisis de control de calidad del bloque occidental del experimento.

Congele rápidamente las fracciones en nitrógeno líquido y almacene a menos 80 grados centígrados. Para comenzar la digestión. Primero, vuelva a suspender el pellet enriquecido con ECM en urea de ocho molares y agregue una solución de Dihi tres etol en agua para hacer una concentración final de 10 milimolares.

Transfiera el tubo a una incubadora y agítelo a 1400 RPM durante dos horas a 37 grados centígrados. A continuación, enfríe la muestra a temperatura ambiente y añada una solución de acetamida iota reconstituida en agua hasta una concentración final de 25 milimolares. Incuba la mezcla en la oscuridad durante 30 minutos.

A temperatura ambiente, diluir a una concentración de urea de dos molares con bicarbonato de amonio de 100 milimolares, y luego agregar P PGA F. Transfiera la muestra a una incubadora y agítela a 1400 RPM durante dos horas. A 37 grados centígrados, agregue endoproteasa, corte C a la mezcla y agite a 1400 RPM durante dos horas a 37 grados centígrados. A continuación, agregue tripsina y agite a 1400 RPM durante la noche a 37 grados centígrados.

La solución turbia debe aclararse después de la digestión durante la noche en un segundo cuádruple de tripsina y agitar durante dos horas adicionales para inactivar la pipeta de tripsina al 50% de ácido trifluoroacético en la mezcla en incrementos de un microlitro hasta que el pH sea inferior a dos. Controle el pH detectando un microlitro de la solución peptídica en papel de pH. Centrifugar la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Por último, recoja el sobrenadante en un tubo limpio y de baja retención. Almacene la solución de péptidos ECM a menos 20 grados centígrados. Los Western blots de la descelularización del tejido pulmonar espejo muestran la extracción de componentes intracelulares como ASIN, beta, uno, actina, GA, dh e histonas en las fracciones intermedias.

Estos componentes están casi completamente ausentes de la fracción de ECM, aunque queda cierta contaminación menor por histonas. Por el contrario, el colágeno uno está altamente enriquecido en la fracción de ECM, pero no se detecta en las otras fracciones, lo que sugiere que no se pierde colágeno durante los pasos intermedios de la extracción. Se obtuvieron resultados similares con un carcinoma de memoria humano.

El xenoinjerto de colágeno uno se enriqueció significativamente en la fracción de ECM con solo una pequeña pérdida en la fracción CS. Cierta contaminación residual de actina permaneció en la fracción de ECM después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que biólogos y clínicos exploraran la complejidad de la matriz extracelular de tejidos normales y enfermos.