Name: Los microelectrodos de dos cañones y concéntricos para la medición de extracelular Ion señales en el tejido cerebral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprende a fabricar microelectrodos ión-selectivos de doble cañón y concéntricos para medir dinámicas de sodio y potasio extracelular en tejido cerebral de ratón. Este método permite estudiar la regulación iónica neuronal.

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Los autores desean agradecer a C. Rodrigo para la asistencia técnica de expertos. Damos las gracias a S. Köhler (Centro de Advanced Imaging, Heinrich Heine Universidad Düsseldorf) para ayudar en la producción de vídeo. La investigación en el laboratorio del autor ha sido financiado por la Asociación Alemana de Investigación (DFG: Ro 2327 / 8-1 para CRR), la Universidad Heinrich Heine Düsseldorf (NH) y por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01NS032123 (MC).

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Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Base líquida portadora, electrodos selectivos de iones se han empleado con éxito durante décadas y para muchos iones, sensores altamente específicos están disponibles 22-26 de. Cuando se utiliza en el espacio extracelular (ECS) de preparaciones de cerebro de vertebrados, hay que tener en cuenta, sin embargo, que se trata de una técnica muy invasiva: mientras que el ancho de la ECS sólo alrededor de 20 a 50 nm, el diámetro de ion-selectivo microelectrodos es de aproximadamente 1 m (electrodos de dos cañones) o grandes (electrodos concéntricos). Las puntas de microelectrodos selectivos de iones por lo tanto no sólo dañar el tejido durante su empalamiento del tejido, sino también ampliar el ECS, favoreciendo una subestimación de los transitorios de iones. A pesar de estas dificultades, los transitorios de iones extracelulares en respuesta a la actividad neuronal son notablemente consistente entre diferentes laboratorios 7,8, lo que demuestra la fiabilidad de este método. El rendimiento y la idoneidad de los electrodos selectivos de ionesdepende de su sensibilidad y selectividad, que se define por el cóctel de sensor (&#39;ionóforo de membrana líquida&#39;) utilizado. Cócteles de sensores contienen una molécula transportadora especial, por ejemplo valinomicina para K + microelectrodos selectivos que presenta una alta selectividad para el potasio 27. No obstante, la reactividad cruzada con otros iones puede ocurrir y debe ser probado. Valinomicina exhibe una reactividad cruzada significativa para el amonio, que tiene que tenerse en cuenta al interpretar los resultados (por ejemplo, 11,12). Además, debido a la tensión de respuesta de los ionóforos sigue un comportamiento de Nernst (cf. ecuación 1), la relación señal-ruido y umbral de detección dependen de la concentración del ion a medir. Así, mientras que los pequeños [K +] o transitorios evocar grandes cambios de voltaje contra el bajo de línea de base [K +] o, pequeña [Na +] o transitorios son mucho más difíciles de detectar en contra de la hila línea de base gh [Na +] o (cf. Figura 5 y 6). El rendimiento de los electrodos selectivos de iones también está determinado por la resolución temporal, que se rige en gran medida por su constante de tiempo eléctrica. Esta última está determinada principalmente por la resistencia axial del sensor, y por la capacitancia distribuida a lo largo de la longitud de la pipeta, entre sus soluciones internas y el fluido externo. En la configuración de dos cañones, la resistencia es alta, debido a la larga columna de sensor de iones de rellenado. Para un dieléctrico aislante dado (en este caso de vidrio de borosilicato), la capacitancia se rige por el grosor dieléctrico. En electrodos de doble cañón, la anchura dieléctrica asciende a la pared de vidrio de la pipeta. A medida que el vidrio se adelgaza cerca de la punta, la anchura dieléctrica cae, y la capacitancia aumenta. Estos factores se combinan para producir electrodos con los tiempos de respuesta que van desde varios cientos de milisegundos a variossegundo, ya que estos factores son variados. Una ventaja importante del diseño concéntrico es que tanto la resistencia axial y la capacitancia para el baño están muy disminuido. Las derivaciones de pipeta concéntricos mayoría de la resistencia del intercambiador de iones rellenado, dejando sólo un remanente en los últimos pocos micrómetros antes de la punta. Además, la solución de llenado dentro de la pipeta concéntrico está distanciado físicamente de la bañera, separados por el grosor de dos paredes de cristal, reduciendo en gran medida la capacitancia. Como se muestra anteriormente 10, el efecto combinado de reducción de la resistencia y la capacitancia es una mejora en la resolución temporal de dos órdenes de magnitud. En el caso de concéntricos de Ca2 + y pH microelectrodos, el 90% los tiempos de respuesta fueron tan bajos como 10 a 20 ms 10. Una ventaja relacionada del diseño concéntrico es el nivel de ruido inferior (ver Figura 8). Debido a la resistencia reducido en gran medida, los transitorios de tensión de cualquier ambient el ruido se reduce al mínimo. Por otra parte, la recuperación de dichos transitorios es rápida, debido a la constante de tiempo rápida. Estos artefactos son, por tanto, pequeño y rápido, y tienen un efecto menos perjudicial en las grabaciones fisiológicas (cf. Figura 8). También hay desventajas de la técnica concéntrica. En primer lugar, su montaje es más compleja, y requiere mucho tiempo. Una segunda desventaja es la necesidad de colocar un microelectrodo de referencia independiente con su punta, lo que implica el uso de cualquiera de un micromanipulador separado o un doble manipulador especializada. Finalmente, microelectrodos de doble cañón se pueden extender a un diseño de triple cañón, lo que permite la detección de dos especies de iones diferentes al mismo tiempo 28, que no es posible para los electrodos concéntricos. Trampas más comunes Silanización ineficiente. El paso más importante, y el principal obstáculo en la fabricación de cualquier líquido-senso microelectrodos selectivo de iones a base es el procedimiento silanización. Cuando los electrodos no responden a cambios en la concentración de iones específico, o responder con una respuesta sub-Nernst (es decir, bien menos de 58 mV por diferencia de concentración de diez veces), pobre eficacia de silanización es típicamente la causa. En nuestra experiencia, esto puede ocurrir si la humedad del aire es demasiado alto o demasiado bajo, típico de las condiciones en la temporada de verano o invierno, respectivamente. Si es factible ejercer algún control sobre la humedad ambiente, estos problemas pueden ser superados. La resistencia del electrodo es demasiado alto. Si es necesario, la resistencia del barril sensible a iones puede ser reducido por el biselado. Con este fin, exponer su punta a un fuerte chorro de abrasivo en suspensión en el agua durante un par de segundos. Esto hará que su punta todo lo posible para romper y menor es la resistencia al valor deseado. Puentes de sal. Salpuentes entre los barriles de iones y de referencia como resultado electrodos mal o ninguno-respuesta y por lo tanto también pueden confundir enormemente su desempeño en la calibración. Como se ha mencionado anteriormente (véase el punto 1.6.), Esto es principalmente un problema cuando se elige de dos cañones de vidrio theta, pero es un hecho poco habitual cuando se utiliza la técnica de barril offset, trenzado se describe aquí. Con la facilidad de fabricación en mente, el diseño de doble cañón original de Lux 29 menudo se puede utilizar de forma rentable. Este método utiliza pre-llenado de los barriles de iones y de referencia con soluciones salinas, una exposición rápida a una solución de silano por su aspiración y expulsión de la punta, siguiendo por la incorporación de intercambiador de iones, también a través de la punta (ver 30,31) . Estos electrodos pueden ser fabricados en aproximadamente 10 minutos, pero su tamaño de la punta es típicamente 4 micras o más y son más propensos a fallar durante un experimento. Por el contrario, los métodos de silanización que implican la exposición a vapores de silano y el caloring puede producir electrodos con puntas más pequeñas que duran días, ya veces semanas. En conjunto, hay varios protocolos y enfoques sobre cómo preparar microelectrodos selectivos de iones. Aquí, hemos descrito dos procedimientos principales para la fabricación de microelectrodos de dos cañones, así como concéntricos retorcidas que funcionan bien y fiable en nuestros laboratorios, con una tasa global de éxito de cerca del 100%. Es importante destacar que estas técnicas serán transferibles a la medición de otras especies de iones, incluyendo el pH o calcio, y también será aplicable a otras preparaciones que el cerebro, incluyendo cavidades o fluidos llenos de fluido en general. Por último, pero no menos importante, microelectrodos selectivos de iones permiten la determinación de las concentraciones de iones dentro de las células. Debido a su tamaño relativamente grande de la punta (~ 1 m), esta voluntad, sin embargo, será posible sólo en las células con un cuerpo de células grandes, por ejemplo, tal como se encuentra en los preparativos de invertebrados 28,32.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

La señalización eléctrica en el cerebro se basa en el flujo de iones a través de las membranas plasmáticas. Los principales movimientos iónicos hacia y desde el espacio extracelular no solo están mediados por el paso a través de canales iónicos dependientes de voltaje, sino también por receptores ionotrópicos postsinápticos, así como por transportadores de iones. Por lo tanto, la actividad neuronal se acompaña de cambios complejos en la concentración extracelular de todos los iones principales. Por ejemplo, se ha demostrado que la afluencia de sodio a las neuronas durante la actividad excitatoria resulta en una disminución en la concentración extracelular de sodio ([Na+]o) 2. Lo mismo ocurre con la concentración de calcio extracelular, ya que los iones de calcio entran rápidamente en las estructuras presinápticas y postsinápticas 3. Al mismo tiempo, el potasio se mueve en sentido contrario y esto media un aumento en la concentración de potasio extracelular ([K+]o) en el rango bajo de mM 4,5. La actividad sináptica también causa cambios en el pH extracelular que son parcialmente mitigados por flujos concomitantes de la membrana glial que cambian el pH intraglial 6,7. Estos cambios relacionados con la actividad en las concentraciones de iones extracelulares tienen consecuencias funcionales significativas. Por ejemplo, incluso pequeños aumentos en [K+]o despolarizan las neuronas, así como las células gliales, alterando así la excitabilidad neuronal, y existen varios mecanismos para eliminar el exceso de potasio 8. El fracaso de estos puede resultar en la actividad epileptiforme de las neuronas o fenómenos como la propagación de la depresión 1. 
Debido a su importancia crítica, la determinación cuantitativa de las concentraciones de iones extracelulares es a menudo necesaria y requerida para comprender la función y disfunción de las redes neuronales en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Durante décadas, los microelectrodos selectivos de iones de doble cañón han demostrado ser excelentes herramientas para este tipo de mediciones en el tejido cerebral. Para muchos iones, se dispone de sensores altamente específicos con baja reactividad cruzada para otros iones. Además de los clásicos electrodos de doble cañón, recientemente se han introducido los llamados electrodos concéntricos. Estos últimos proporcionan una resolución de tiempo superior, pero requieren un poco más de tiempo y esfuerzo para construir 10. 
A continuación, describiremos la preparación y calibración de estos dos tipos de microelectrodos selectivos de iones. A continuación, mostramos cómo estos electrodos pueden emplearse en preparaciones de cortes de cerebro para la medición de cambios en [K+]o o [Na+]o inducidos por la actividad excitatoria siguiendo diferentes paradigmas de estimulación, incluyendo el baño y la aplicación de fármacos a presión.

<table><tbody><tr><td>Abrasivo&nbsp; &nbsp;</td><td>Micropulido &nbsp;</td><td>Buehler GmbH</td><td>Disuelto en capilares</td></tr> de <tr><td>vidrio de borosilicato</td><td>1405059</td><td>Hilgenberg</td><td>Pipeta de aplicación; 75 mm x 2 mm, espesor de pared 0,3 mm</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato con filamento</td><td>GC 150 F-15&nbsp;</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>Para el sensor de microelectrodos de doble cañón&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato con filamento</td><td>GC100-F-15</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>Para la referencia de microelectrodos de doble cañón&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato con filamento</td><td>GB-200TF-15&nbsp;</td><td>Ciencia Productos</td><td>Concéntrico, canal exterior. D.E. 2.0 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato con filamento</td><td>GB-120TF-10</td><td>Productos Científicos</td><td>Concéntrico, canal interno. Diámetro exterior 1,2 mm</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de electrómetro con cabecera</td><td></td><td>Hecho a medida</td><td>Rin = 10 T&Omega; e Ibias = 50 fA-1pA (alternativas disponibles en el mercado: e.g. Dagan IX2-700, con cabezal (resistencia de retroalimentación de 10 Gig) o EPMS-07, NPI, Tamm, Alemania)</td></tr><tr><td>Cámara experimental</td><td></td><td>Hecho a medida</td><td>Disponible comercialmente desde p. ej. &nbsp; Warner Instruments, Estados Unidos; &nbsp; Scientifica, Reino Unido</td></tr><tr><td>Horno</td><td></td><td>Heraeus</td><td>Debe permanecer constante a 200 &deg; C</td></tr><tr><td>Cera dura y pegajosa / cera dental &nbsp;</td><td>Deiberit 502&nbsp;</td><td>Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH</td><td></td></tr><tr>Placa <td></td><td>calefactora</td><td>hecha a medida</td><td>Debe permanecer constante a 40 °C; C</td></tr><tr><td>Soporte de microelectrodos de plexiglás</td><td></td><td>Hecho a medida</td><td>Doble cañón: O.D. &nbsp; capilares de 1,5 mm, concéntricos: D.E. capilares 2 mm</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td></td><td>Leitz</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>MD4R</td><td>Microscopio estereoscópico Leica</td><td></td></tr><tr><td></td><td>M205C</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Plan 0.8xLWD</td><td>Extractor</td> de pipetas Leica <td></td></tr><tr><td></td><td>Modelo PP-830</td><td>Narishige</td><td>Microelectrodos concéntricos&nbsp;</td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>Modelo P-97</td><td>Sutter Instruments&nbsp;</td><td>Sensor de microelectrodos concéntricos&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema neumático de expulsión de medicamentos</td><td>Picospritzter Tipo II</td><td>General Valve TM Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Etapa de cola de milano de viaje</td><td>DT 25/M</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de dos componentes</td><td>&nbsp; Araldite</td><td>Huntsman advanced materials GmbH</td><td>También se puede utilizar una pequeña tira de papel de aluminio para pegar los capilares...</td></tr><tr><td>Silverwire</td><td>99.9%&nbsp;</td><td>Wieland Edelmetalle</td><td></td></tr><tr><td>Slicer / Vibratome</td><td>Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>AxoScope 8.1&nbsp;</td><td>Extractor vertical de Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Tipo PE-2</td><td>Narishige Scientific Instruments</td><td>Con un mandril giratorio para microelectrodos de doble cañón</td></tr><tr><td>x/y etapa de traslación</td><td></td><td>Hecho</td><td></td>a medida</tr><tr><td>1 (S), 9 (R) - (&menos;)-Bicucullina metiodiuro Sigma</td><td>aldrich</td><td>14343</td><td>Antagonista competitivo de los receptores GABAA (sensible a la luz); PRECAUCIÓN</td></tr>: <tr><td>tóxico CNQX</td><td>Sigma aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA/kainato antagonista del receptor; PRECAUCIÓN: tóxico</td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetilo (DMSO)</td><td>Sigma aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>Antagonista del receptor NMDA; PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>tóxico Hexametildisilazano (HMDS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td>PRECAUCIÓN: Inflamable, toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación) y corrosivo para los metales y la piel</td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Sigma aldrich</td><td>A9256</td><td>Activa NMDA y no NMDA y EAATs</td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico sal monosódica hidrato</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1626</td><td>Activa NMDA-R, AMPA-R, QA-R y KA-R),&nbsp; mGluRs y EAATs</td></tr><tr><td>Ionóforo de potasio I - cóctel B</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>60403</td><td>A base de valinomicina; PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>tóxico Ionóforo de sodio II - cóctel A</td><td>Fluka&nbsp; &nbsp;</td><td>71178</td><td>Basado en ETH 157</td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibidor de canales de Na+ dependientes de voltaje; PRECAUCIÓN agua tóxica</td></tr><tr><td>, ultra pura</td><td>Sigma aldrich</td><td>W3500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

los microelectrodos de dos cañones y concéntricos para la medición de extracelular ion señales en el tejido cerebral

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

La actividad eléctrica en el cerebro va acompañada de importantes flujos iónicos a través de las membranas, lo que resulta en cambios complejos en la concentración extracelular de todos los iones principales. Dado que estos desplazamientos iónicos tienen consecuencias funcionales significativas, a menudo se requiere su determinación cuantitativa para comprender la función y la disfunción de las redes neuronales en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. En el presente estudio, demostramos la fabricación y calibración de microelectrodos selectivos de iones de doble cañón, que han demostrado ser excelentes herramientas para tales mediciones en el tejido cerebral. Además, también se describen los llamados microelectrodos selectivos de iones "concéntricos" que, en función de su diseño diferente, ofrecen una resolución temporal mucho mejor de los cambios iónicos rápidos. A continuación, mostramos cómo estos electrodos pueden emplearse en preparaciones agudas de cortes cerebrales del hipocampo del ratón. Utilizando microelectrodos selectivos de potasio de doble barril, se demuestran cambios en la concentración extracelular de potasio ([K+]o) en respuesta a la aplicación exógena de agonistas del receptor de glutamato o durante la actividad epileptiforme. Además, ilustramos las características de respuesta de los electrodos sensibles al sodio, de doble cañón y concéntricos y comparamos su detección de cambios en la concentración de sodio extracelular ([Na+]o) provocados por el baño o la aplicación a presión de fármacos. Estas mediciones muestran que, si bien las amplitudes de respuesta son similares, los microelectrodos de sodio concéntricos muestran una relación señal-ruido y un tiempo de respuesta superiores en comparación con el diseño de doble cañón. En general, los procedimientos demostrados serán fácilmente transferibles a la medición de otras especies de iones, incluidos el pH o el calcio, y también serán aplicables a otras preparaciones.

<html> Para supervisar [K +] o y los cambios en el mismo en respuesta a la actividad excitatoria, un microelectrodo de dos cañones en potasio selectiva se insertó en el estrato radiado de la zona CA1. Unos pocos minutos después de empalamiento, el barril selectiva de iones del electrodo alcanzó una línea de base estable (Figura 7A), que corresponde a una [K +] o de alrededor de 2,8 mM, un valor cercano a la [K +] de la ACSF utilizado ( 2,5 mM). Bath aplicación de glutamato 0,5 mM durante 10 seg indujo un aumento reversible en [K +] o en aproximadamente 4 mM, seguido de un undershoot debajo del nivel basal que asciende a ~ 0,7 mM (Figura 7A). La reducción de la concentración de glutamato a 0,4, 0,3, y 0,2 mM causado una reducción correspondiente en la amplitud de tanto el aumento transitorio y la undershoot en O (Figura 7A) [K +]. oad / 53058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. transitorios de potasio extracelular en respuesta a la actividad excitatoria. (A) [K +] o transitorios, que consiste en un aumento seguido por una undershoot debajo del nivel basal, inducida por la aplicación de baño de diferentes concentraciones de glutamato durante 10 s como se indica. (B) influencia de una perfusión con bloqueadores de los receptores de glutamato (CNQX, 100 mM; APV, 100 mM) y la tetrodotoxina (TTX; 0,5 M) en [K +] o transitorios inducidos por la aplicación de baño de glutamato 0,5 mM durante 10 seg. (C) espontánea [K +] o transitorios en presencia de 0mg 2+ / BIC. Los experimentos mostrados en la AC se realizaron con electrodos de dos cañones. Para fines de ilustración, los rastros fueron suavizadas con un filtro de Sawitzky-Golay (ancho 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">Por favor cl</a>ick aquí para ver una versión más grande de esta figura. Experimentos anteriores han demostrado que este tipo de [K +] o señales inducidas por glutamato no se modifican significativamente durante la aplicación de TTX, por lo que son en gran medida independiente de la apertura de los canales de sodio dependientes de voltaje y la acción neuronal generación potencial de 15,16. Para estudiar los mecanismos subyacentes a los observados [K +] o cambios en respuesta al glutamato, se aplicó bloqueadores de los receptores de glutamato, a saber, CNQX (100 mM; bloqueador de los receptores AMPA) y APV (100 mM; bloqueador de los receptores NMDA) en presencia de TTX (0,5 M). Tras la perfusión baño con estos bloqueadores, inducida por glutamato [K +] o cambios eran prácticamente abolida, lo que confirma su dependencia de la apertura de los canales de los receptores de glutamato ionotrópicos como se informó anteriormente (por ejemplo, 17; Figura 7B). Para demostrar aún más tél relevancia de excitación glutamatérgica para la generación de extracelular [K +] señales, rebanadas fueron perfundidos con solución salina nominalmente Mg 2+ exento que contiene 10 mM metyoduro bicuculina (0 mg 2+ / BIC). Esto alivia la tensión dependiente de Mg 2+ -bloque de los receptores NMDA y amortigua la inhibición por bloqueo de los receptores GABA A, causando actividad epileptiforme recurrente espontánea en la red (por ejemplo, 18,19). Como era de esperar 20, espontáneo, recurrente [K +] o transitorios, que asciende a aproximadamente 1,5 mM fueron detectados en 0mg 2+ / BIC solución salina (Figura 7C). Entre estas respuestas, más pequeño [K +] o transitorios con una amplitud media de aproximadamente 0,2 mM ocurrió (Figura 7C). En una segunda serie de experimentos, se utilizó [Na +] microelectrodos -sensibles para determinar [Na +] o cambios provocados por la aplicación deagonistas de glutamato. Aquí, también comparó las características de respuesta de microelectrodos de dos cañones y concéntricas que emplean dos paradigmas de aplicación diferentes. [Na +] microelectrodos -sensibles se posiciona en el estrato radiatum a una profundidad de alrededor de 50 mM. Después se alcanzó una línea de base estable, el agonista de glutamato L-aspartato se aplicó por perfusión baño (10 mM, 120 seg, la perfusión del baño a 2,5 ml / min). Como se observó anteriormente 21, la aplicación de aspartato provocó una disminución lenta en [Na +] o en aproximadamente 15 mM, que duró unos 5 minutos y luego comenzó a recuperarse de nuevo a la línea de base (Figura 8A). Cabe destacar que, mientras que las amplitudes de pico y la cinética de los [Na +] o señales determinadas por ambos electrodos eran prácticamente idénticas en estas condiciones, los electrodos concéntricos exhibieron una línea de base más estable y un nivel de ruido inferior (Figura 8A). Para probar la r<html> ESPUESTA características de los diferentes electrodos bajo un paradigma aplicación más rápida, glutamato-nos aplica presión a través de una pipeta de vidrio fino colocado en el estrato radiatum a una distancia de un 20-40 micras desde la punta de la microelectrodo selectivo de iones. Como era de esperar 21, la aplicación de glutamato (10 mM) durante 200 ms provocó una caída en el O (Figura 8B) [Na +]. Las amplitudes máximas de la [Na +] o disminución estaban en el mismo rango para ambos tipos de electrodos (dos cañones: 4.5 - 13.5 mM, n = 14; concéntrica: 2,0 - 19,1 mM, n = 15). Sin embargo, en contraste con los resultados obtenidos con baño de perfusión lenta (véase más arriba), no sólo la relación señal-ruido, sino también el curso temporal de los [Na +] o señales detectadas por los dos tipos de electrodos diferían significativamente. El tiempo promedio a pico fue de 3,5 segundos para el sólo el 1,3 seg de dos cañones y de los microelectrodos concéntricos. homólogos ve_content &quot;&gt; Por lo tanto, estos resultados demuestran y confirman la cinética de respuesta más rápidos de Na + concéntricos vs. microelectrodos selectivos de dos cañones, (cf. Figura 6C y 8B), como también se observó para Ca2 + y pH selectivos 10 . En contraste con el estudio anterior, en el que se realizó la estimulación sináptica de corta ráfaga de evocar los transitorios de iones rápidos inducidos sinápticamente-, sólo había una tendencia, pero no hubo diferencias significativas en las amplitudes medias de los picos entre electrodos concéntricos y de dos cañones con nuestra aplicación paradigma. Esto era probablemente debido al hecho de que la distancia de la pipeta aplicación desde la punta del microelectrodo selectiva de iones varió por un factor de dos (20-40 micras), y, en consecuencia, que la concentración de glutamato máxima a la región diana no era el mismo en diferentes experimentos, obstruyendo cualquier diferencia existente en amplitudes de pico. (A) Top traza: Cambio en la voltage de los barriles de referencia (V ref) de un electrodo de dos cañones (trazo punteado negro) y un electrodo concéntrico (traza gris) en respuesta a los cambios en el baño de Na + de concentración ([Na +] b) como se indica. Tenga en cuenta que las respuestas de tensión de ambos electrodos son prácticamente idénticos. Trazas inferiores: Los cambios en el voltaje de la Na +: posible (V Na +) de un electrodo de dos cañones (trazo negro) y un electrodo concéntrico (traza gris) en respuesta a los cambios en [Na +] b. (B) parcelas de media logarítmica de la [Na +] b frente al V Na + de ambos electrodos. Parcelas lineal de los datos revelan una pendiente de aproximadamente 48 mV para ambos electrodos. (C) Respuesta de la V Na + de un (trazo negro) de dos cañones y un electrodo concéntrico (trazo gris) a un cambio rápido en el [Na +] b desde 152 mM a 70 mM. Tenga en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo concéntrico es significativamente faster. Para fines de ilustración, los rastros fueron suavizadas con un filtro de Sawitzky-Golay (ancho 20). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> Figura 8: transitorios sodio extracelular detectada por los electrodos de dos cañones y concéntricos. (A) los cambios transitorios en V ref y [Na +] o inducida por perfusión baño con aspartato 10 mM durante 120 segundos, como se indica en el bar. Las huellas superiores muestran una grabación realizada con un electrodo de dos cañones, las huellas más bajos se registraron usando un electrodo concéntrico. (B) los cambios transitorios en V ref y [Na +] o inducida por la aplicación de presión local con glutamato 10 mM durante 0,2 segundos según lo indicado por la punta de flecha. Las huellas superiores muestran una grabación realizada con un electrodo de dos cañones, las huellas más bajos se registraron usando un electrodo concéntrico.Líneas rojas punteadas representan ajustes lineales del periodo comprendido entre el inicio de la señal a su máximo. Tenga en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo concéntrico es significativamente más rápido bajo esta condición. Con fines ilustrativos, las huellas fueron suavizadas con un filtro Sawitzky-Golay (ancho 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Demostramos la fabricación, calibración y propiedades de dos tipos de microelectrodos selectivos de iones (de doble cañón y concéntricos) para la medición de concentraciones de iones en el tejido cerebral. A continuación, se utilizan en la preparación del corte del hipocampo del ratón para demostrar que la actividad excitatoria cambia las concentraciones extracelulares de potasio y sodio.

Los microelectrodos de dos cañones y concéntricos para la medición de extracelular Ion señales en el tejido cerebral

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar y analizar la dinámica iónica en el espacio extracelular del tejido cerebral. La medición del transitorio iónico se realiza mediante microelectrodos selectivos para iones, que pueden prepararse según un diseño de doble barril o concéntrico. Como primer paso, los microelectrodos se calibran en la solución experimental.Luego, los electrodos se insertan en cortes agudos del hipocampo de ratón para realizar la grabación y provocar desplazamientos iónicos extracelulares; se suministra el neurotransmisor glutamato o un agonista del glutamato. El glutamato se une y abre los receptores iónicos en las espinas postsinápticas, lo que permite la entrada de sodio y la salida de potasio desde las células. En última instancia, esto provoca una disminución del sodio extracelular y un aumento del potasio extracelular, que son detectados por los microelectrodos selectivos de iones.Este método se utiliza para estudiar la regulación de iones extracelulares y los transitorios de hierro inducidos por la actividad en el cerebro. Aquí describimos la preparación y calibración de dos tipos de microelectrodos selectivos de iones. Mostramos cómo pueden emplearse en cortes agudos de tejido cerebral para medir cambios en el potasio o sodio extracelular en respuesta a la aplicación de neurotransmisores.El procedimiento será demostrado por Nicole Hark y Simon para mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare una micropipeta de vidrio borosilicatado con filamento que se utilizará para el barril sensible a iones y otra para el barril de referencia posterior. A continuación, utilice un adhesivo de dos componentes o una tira pequeña de aluminio para fijar la micropipeta larga y la corta juntas en ambos extremos.Caliente la doble pipeta en un horno a 60 grados Celsius durante una hora para eliminar la humedad residual. Posteriormente, almacene los electrodos en un desecador hasta su uso. Centre la doble pipeta en un extractor vertical con una tiza de revólver. Utilice una tiza para evitar la elongación de la pipeta.Mantenga suavemente la bobina hasta que el vidrio esté lo suficientemente blando como para permitir una rotación horizontal del revólver. Gire 180 grados después de enfriar y retire el rompimiento mecánico. Aplique un segundo protocolo de calentamiento para estirar el capilar, obteniendo así dos capilares dobles afilados.El diámetro de la punta de la doble pipeta capilar debe estar cerca de un micrón. Ahora llene el barril de referencia hasta su punta con agua destilada para prevenir la colonización. En el procedimiento siguiente, coloque una pipeta capilar de doble barril con su punta hacia arriba en un soporte hecho a medida.Luego, coloque este soporte en el frasco de boca ancha que contiene el HMDS previamente calentado e incube durante 70 minutos. Después de eso, transfiera la capilaridad a un soporte metálico. Posteriormente, colóquela en el horno precalentado durante dos horas para secar ambas cámaras tras la colonización; mantenga la capilaridad seca en el desecador hasta su uso.En el día del experimento, prepare el electrodo selectivo de iones llenando la punta del cilindro silanizado con dos o tres microlitros del sensor selectivo de iones. Luego, rellene el cilindro con cloruro de sodio 100 milimolar para un microelectrodo sensible al sodio o con solución salina de cloruro de potasio 100 milimolar para un microelectrodo sensible al potasio. Tenga cuidado de no introducir burbujas adicionales de aire durante este procedimiento.Si la ización tiene éxito y el sensor se llena adecuadamente, la superficie del sensor debe aparecer como una superficie cóncava claramente visible frente al relleno posterior. A continuación, llene el canal de referencia, luego inserte los alambres de plata clorurada en ambos cilindros y selle cada cilindro con cera dental. En este procedimiento, tire de un capilar de dos milímetros en el tirador horizontal para obtener una pendiente corta y un diámetro de punta de cuatro micrones.Inmediatamente antes de usarlo, llene la capilar de silicona con 0,2 microlitros de sensor. Para preparar la capilar interna, estire una capilar de pequeño diámetro hasta obtener dos capilares con conos largos y puntas afiladas. Luego, llénelas con solución salina de cloruro de sodio 100 milimolar o cloruro de potasio 100 milimolar.Coloque las capilares llenas de sensor y las capilares llenas de solución salina directamente alineadas entre sí sobre un tapón personalizado hecho de laminillas. Introduzca parcialmente la capilar más pequeña dentro de la capilar más grande. A continuación, fije las capilares sobre otra laminilla.Utilizando arcilla de modelar, transfiera los capilares a la platina de un microscopio y visualícelos con una magnificación de 100x. Con la ayuda de una varilla de vidrio montada en un micromanipulador, avance lentamente el capilar externo sobre el capilar interno hasta que la distancia entre sus puntas sea aproximadamente de cinco micrones. Fije el extremo abierto del capilar externo al capilar interno utilizando cera dental e inserte un alambre de plata.Para preparar el electrodo de referencia, tire de un capilar con filamento en un micropipeteador vertical, deseche la pipeta superior, luego abra la mordaza inferior y levante la pipeta inferior aproximadamente cinco milímetros. Cierre nuevamente la mordaza y levántela hasta que la punta del electrodo inferior quede posicionada aproximadamente a cinco milímetros por encima de la bobina calefactora. Posteriormente, caliente la bobina y use pinzas para doblar la punta aproximadamente 45 grados hacia un lado.Dóblelo nuevamente aproximadamente 45 grados negativos para dirigir la punta de vuelta en paralelo al eje principal. Luego, llene el cilindro de referencia con salina tamponada en montones. Inserte un alambre de plata clorurada y selle el cilindro con cera dental.En este paso, sujete tanto el electrodo sensible a iones como el electrodo de referencia a micromanipuladores y colóquelos en una cámara experimental perfundida con LCR A. Bajo el microscopio estereoscópico, conecte los hilos de plata clorurada a las entradas respectivas del cabezal amplificador diferencial. Luego, determine las resistencias de los electrodos.A continuación, ajuste las señales de voltaje a cero e inicie la grabación para la calibración. Tras obtener una línea base estable, cambie a la solución salina que contiene concentraciones definidas del ion que se va a medir. Ahora, transfiera una sección de hipocampo de 250 micrones de grosor a la cámara experimental y fíjela con una rejilla.Baje el microelectrodo selectivo de iones calibrado hasta la superficie del corte. Luego, baje aún más el electrodo aproximadamente 50 micrómetros dentro de la capa radiada de la región CA1. Para aplicar el agonista del transmisor, llene la pipeta de aplicación con glutamato 0,5 milimolar.Conecte la pipeta a un micromanipulador y acóplela a un dispositivo de aplicación de presión. A continuación, baje la pipeta de aplicación en el tejido y colóquela cuidadosamente cerca de la punta del microelectrodo selectivo de iones. Inicie la aplicación de presión a 40 milibares.Se muestra aquí el cambio en el voltaje de los barriles de referencia de un electrodo de doble barril y de un electrodo concéntrico en respuesta a cambios en la concentración de sodio en el baño. Y estos son los cambios en el voltaje del potencial de sodio de un electrodo de doble barril y de un electrodo concéntrico en respuesta a cambios en la concentración de sodio en el baño. Esta figura muestra la gráfica semilogarítmica de la concentración de sodio en el baño frente al voltaje del potencial de sodio de ambos electrodos.Los gráficos lineales revelan una pendiente de aproximadamente 48 milivoltios para ambos electrodos. Aquí se muestra la respuesta de un electrodo doble y de un electrodo concéntrico a un cambio rápido en el baño. Concentración de sodio de 152 milimolar a 70 milimolar.Téngase en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo concéntrico es significativamente más rápido. Esta figura muestra el transitorio de sodio extracelular detectado mediante electrodos dobles y electrodos concéntricos; los cambios transitorios en el voltaje de los compartimentos de referencia y la concentración extracelular de sodio fueron inducidos por perfusión del baño con 10 milimolares de aspartato durante 120 segundos, como indica la barra. Y en esta figura, los cambios transitorios en el voltaje de los compartimentos de referencia y en la concentración extracelular de sodio fueron inducidos mediante aplicación local de presión con 10 milimolares de glutamato durante 0,2 segundos.Tenga en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo conal es significativamente más rápido bajo esta condición. Al intentar este procedimiento, es importante tener en mente que el silencio adecuado es el paso clave para la producción exitosa de microelectrodos electivos de hierro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y utilizar estos electrodos para la detección de hierro extracelular, transitorio en tejido cerebral.

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