Los microelectrodos de dos cañones y concéntricos para la medición de extracelular Ion señales en el tejido cerebral

El objetivo general de este procedimiento es detectar y analizar la dinámica iónica en el espacio extracelular del tejido cerebral. La medición del transitorio iónico se realiza mediante microelectrodos selectivos para iones, que pueden prepararse según un diseño de doble barril o concéntrico. Como primer paso, los microelectrodos se calibran en la solución experimental.

Luego, los electrodos se insertan en cortes agudos del hipocampo de ratón para realizar la grabación y provocar desplazamientos iónicos extracelulares; se suministra el neurotransmisor glutamato o un agonista del glutamato. El glutamato se une y abre los receptores iónicos en las espinas postsinápticas, lo que permite la entrada de sodio y la salida de potasio desde las células. En última instancia, esto provoca una disminución del sodio extracelular y un aumento del potasio extracelular, que son detectados por los microelectrodos selectivos de iones.

Este método se utiliza para estudiar la regulación de iones extracelulares y los transitorios de hierro inducidos por la actividad en el cerebro. Aquí describimos la preparación y calibración de dos tipos de microelectrodos selectivos de iones. Mostramos cómo pueden emplearse en cortes agudos de tejido cerebral para medir cambios en el potasio o sodio extracelular en respuesta a la aplicación de neurotransmisores.

El procedimiento será demostrado por Nicole Hark y Simon para mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare una micropipeta de vidrio borosilicatado con filamento que se utilizará para el barril sensible a iones y otra para el barril de referencia posterior. A continuación, utilice un adhesivo de dos componentes o una tira pequeña de aluminio para fijar la micropipeta larga y la corta juntas en ambos extremos.

Caliente la doble pipeta en un horno a 60 grados Celsius durante una hora para eliminar la humedad residual. Posteriormente, almacene los electrodos en un desecador hasta su uso. Centre la doble pipeta en un extractor vertical con una tiza de revólver. Utilice una tiza para evitar la elongación de la pipeta.

Mantenga suavemente la bobina hasta que el vidrio esté lo suficientemente blando como para permitir una rotación horizontal del revólver. Gire 180 grados después de enfriar y retire el rompimiento mecánico. Aplique un segundo protocolo de calentamiento para estirar el capilar, obteniendo así dos capilares dobles afilados.

El diámetro de la punta de la doble pipeta capilar debe estar cerca de un micrón. Ahora llene el barril de referencia hasta su punta con agua destilada para prevenir la colonización. En el procedimiento siguiente, coloque una pipeta capilar de doble barril con su punta hacia arriba en un soporte hecho a medida.

Luego, coloque este soporte en el frasco de boca ancha que contiene el HMDS previamente calentado e incube durante 70 minutos. Después de eso, transfiera la capilaridad a un soporte metálico. Posteriormente, colóquela en el horno precalentado durante dos horas para secar ambas cámaras tras la colonización; mantenga la capilaridad seca en el desecador hasta su uso.

En el día del experimento, prepare el electrodo selectivo de iones llenando la punta del cilindro silanizado con dos o tres microlitros del sensor selectivo de iones. Luego, rellene el cilindro con cloruro de sodio 100 milimolar para un microelectrodo sensible al sodio o con solución salina de cloruro de potasio 100 milimolar para un microelectrodo sensible al potasio. Tenga cuidado de no introducir burbujas adicionales de aire durante este procedimiento.

Si la ización tiene éxito y el sensor se llena adecuadamente, la superficie del sensor debe aparecer como una superficie cóncava claramente visible frente al relleno posterior. A continuación, llene el canal de referencia, luego inserte los alambres de plata clorurada en ambos cilindros y selle cada cilindro con cera dental. En este procedimiento, tire de un capilar de dos milímetros en el tirador horizontal para obtener una pendiente corta y un diámetro de punta de cuatro micrones.

Inmediatamente antes de usarlo, llene la capilar de silicona con 0,2 microlitros de sensor. Para preparar la capilar interna, estire una capilar de pequeño diámetro hasta obtener dos capilares con conos largos y puntas afiladas. Luego, llénelas con solución salina de cloruro de sodio 100 milimolar o cloruro de potasio 100 milimolar.

Coloque las capilares llenas de sensor y las capilares llenas de solución salina directamente alineadas entre sí sobre un tapón personalizado hecho de laminillas. Introduzca parcialmente la capilar más pequeña dentro de la capilar más grande. A continuación, fije las capilares sobre otra laminilla.

Utilizando arcilla de modelar, transfiera los capilares a la platina de un microscopio y visualícelos con una magnificación de 100x. Con la ayuda de una varilla de vidrio montada en un micromanipulador, avance lentamente el capilar externo sobre el capilar interno hasta que la distancia entre sus puntas sea aproximadamente de cinco micrones. Fije el extremo abierto del capilar externo al capilar interno utilizando cera dental e inserte un alambre de plata.

Para preparar el electrodo de referencia, tire de un capilar con filamento en un micropipeteador vertical, deseche la pipeta superior, luego abra la mordaza inferior y levante la pipeta inferior aproximadamente cinco milímetros. Cierre nuevamente la mordaza y levántela hasta que la punta del electrodo inferior quede posicionada aproximadamente a cinco milímetros por encima de la bobina calefactora. Posteriormente, caliente la bobina y use pinzas para doblar la punta aproximadamente 45 grados hacia un lado.

Dóblelo nuevamente aproximadamente 45 grados negativos para dirigir la punta de vuelta en paralelo al eje principal. Luego, llene el cilindro de referencia con salina tamponada en montones. Inserte un alambre de plata clorurada y selle el cilindro con cera dental.

En este paso, sujete tanto el electrodo sensible a iones como el electrodo de referencia a micromanipuladores y colóquelos en una cámara experimental perfundida con LCR A. Bajo el microscopio estereoscópico, conecte los hilos de plata clorurada a las entradas respectivas del cabezal amplificador diferencial. Luego, determine las resistencias de los electrodos.

A continuación, ajuste las señales de voltaje a cero e inicie la grabación para la calibración. Tras obtener una línea base estable, cambie a la solución salina que contiene concentraciones definidas del ion que se va a medir. Ahora, transfiera una sección de hipocampo de 250 micrones de grosor a la cámara experimental y fíjela con una rejilla.

Baje el microelectrodo selectivo de iones calibrado hasta la superficie del corte. Luego, baje aún más el electrodo aproximadamente 50 micrómetros dentro de la capa radiada de la región CA1. Para aplicar el agonista del transmisor, llene la pipeta de aplicación con glutamato 0,5 milimolar.

Conecte la pipeta a un micromanipulador y acóplela a un dispositivo de aplicación de presión. A continuación, baje la pipeta de aplicación en el tejido y colóquela cuidadosamente cerca de la punta del microelectrodo selectivo de iones. Inicie la aplicación de presión a 40 milibares.

Se muestra aquí el cambio en el voltaje de los barriles de referencia de un electrodo de doble barril y de un electrodo concéntrico en respuesta a cambios en la concentración de sodio en el baño. Y estos son los cambios en el voltaje del potencial de sodio de un electrodo de doble barril y de un electrodo concéntrico en respuesta a cambios en la concentración de sodio en el baño. Esta figura muestra la gráfica semilogarítmica de la concentración de sodio en el baño frente al voltaje del potencial de sodio de ambos electrodos.

Los gráficos lineales revelan una pendiente de aproximadamente 48 milivoltios para ambos electrodos. Aquí se muestra la respuesta de un electrodo doble y de un electrodo concéntrico a un cambio rápido en el baño. Concentración de sodio de 152 milimolar a 70 milimolar.

Téngase en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo concéntrico es significativamente más rápido. Esta figura muestra el transitorio de sodio extracelular detectado mediante electrodos dobles y electrodos concéntricos; los cambios transitorios en el voltaje de los compartimentos de referencia y la concentración extracelular de sodio fueron inducidos por perfusión del baño con 10 milimolares de aspartato durante 120 segundos, como indica la barra. Y en esta figura, los cambios transitorios en el voltaje de los compartimentos de referencia y en la concentración extracelular de sodio fueron inducidos mediante aplicación local de presión con 10 milimolares de glutamato durante 0,2 segundos.

Tenga en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo conal es significativamente más rápido bajo esta condición. Al intentar este procedimiento, es importante tener en mente que el silencio adecuado es el paso clave para la producción exitosa de microelectrodos electivos de hierro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y utilizar estos electrodos para la detección de hierro extracelular, transitorio en tejido cerebral.