Los microelectrodos de dos cañones y concéntricos para la medición de extracelular Ion señales en el tejido cerebral

El objetivo general de este procedimiento es detectar y analizar la dinámica iónica en el espacio extracelular del cerebro. Tejido. La medición de la transitoria iónica se realiza mediante el uso de microelectrodos selectivos de iones, que se pueden preparar en base a un diseño concéntrico o de doble cañón. Como primer paso, los microelectrodos se calibran en el baño experimental.

A continuación, los electrodos se insertan en las rodajas agudas del hipocampo del ratón para su registro y para evocar cambios de iones extracelulares en el transmisor glutamato, o se suministra un agonista del glutamato. El glutamato se une y abre los receptores ionotrópicos en las espinas postsinápticas, lo que permite la entrada de sodio y la entrada de potasio fuera de las células. En última instancia, esto da como resultado una disminución del sodio extracelular, así como un aumento del potasio extracelular que son detectados por los microelectrodos selectivos de iones.

Este método se emplea para estudiar la regulación iónica extracelular y los transitorios de hierro inducidos por la actividad en el cerebro. Aquí describimos la preparación y calibración de dos tipos de microelectrodos selectivos de iones. Mostramos cómo se pueden emplear en cortes agudos de tejido cerebral para medir los cambios en el potasio o el sodio extracelular en respuesta a la aplicación de neurotransmisores.

El procedimiento será demostrado por Nicole Hark y Simon para mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare un capilar de vidrio de silicato con filamento que se utilizará para el cañón sensible a iones y otro para el cañón de referencia posterior. A continuación, use pegamento de dos componentes o una pequeña tira de papel de aluminio para fijar el capilar largo y corto juntos en ambos extremos.

Calentar el doble capilar en un horno a 60 grados centígrados durante una hora para eliminar la humedad residual. Posteriormente, guarde los electrodos en un desecado hasta que se use en el centro del doble capilar en un extractor vertical con una tiza revólver. Utilice una tiza para evitar el alargamiento del capilar.

Mantenga la bobina suavemente hasta que el vidrio esté lo suficientemente suave como para permitir una rotación horizontal del revólver. Tire 180 grados después de enfriar, retire la rotura mecánica. Aplique un segundo protocolo de calentamiento para tirar del capilar, lo que da como resultado dos capilares afilados de doble barril.

El diámetro de la punta del capilar doble debe estar cerca de una micra. Ahora llene el barril de referencia hasta la punta con agua destilada para evitar la colonización. En el siguiente procedimiento, coloque un capilar de doble barril con la punta hacia arriba en un soporte hecho a medida.

A continuación, coloque este soporte en el frasco de boca ancha que contiene el HMDS preadvertido e incube durante 70 minutos. Después de eso, transfiera el capilar a un soporte de metal. Posteriormente, colóquelo en el horno precalentado durante dos horas para secar ambos barriles después de la colonización, mantenga el capilar seco en el desecado hasta su uso.

El día del experimento, prepare el electrodo selectivo de iones llenando la punta del barril siliconado con dos o tres microlitros del sensor selectivo de iones. A continuación, rellene el barril con cloruro de sodio de 100 milimolares para un microelectrodo sensible al sodio o solución salina de cloruro de potasio de 100 milimolares para un microelectrodo sensible al potasio. Tenga cuidado de no insertar burbujas de aire adicionales durante este procedimiento.

Si la ización es exitosa y el sensor se llena correctamente, la superficie del sensor debe aparecer como una superficie cóncava claramente visible contra el relleno. A continuación, llene el canal de referencia, luego inserte los alambres de plata clorada en ambos barriles y selle cada barril con cera dental. En este procedimiento, tire de un capilar de dos milímetros en el extractor horizontal para dar como resultado un cono corto y un diámetro de punta de cuatro micras.

Justo antes de usar, llene el capilar siliconado con 0,2 microlitros de sensor. Para preparar el capilar interno, tire de un capilar de pequeño diámetro para dar como resultado dos capilares con conos largos y puntas afiladas. Luego llénelos con cloruro de sodio 100 milimolares o cloruro de potasio salino 100 milimolares.

Coloque los capilares llenos de sensor y los capilares llenos de solución salina directamente en línea entre sí en un tapón de construcción personalizado hecho de cubreobjetos. Inserte el capilar más pequeño parcialmente en el capilar más grande. A continuación, fije los capilares en otro cubreobjetos.

Usando arcilla para modelar, transfiera los capilares a la platina de un microscopio y visualícelos con un aumento de 100x. Con la ayuda de una varilla de vidrio que está montada en un micro manipulador, avance lentamente el capilar externo sobre el capilar interno hasta que la distancia entre sus puntas sea de aproximadamente cinco micras. Fije el extremo abierto del capilar externo en el capilar interno con cera dental e inserte alambre de plata.

Para preparar el electrodo de referencia, tire de un capilar con filamento en un extractor vertical, deseche la pipeta superior, luego abra el mandril inferior y levante la pipeta inferior unos cinco milímetros. Vuelva a cerrar el mandril y levántelo hasta que la punta del electrodo inferior se coloque a unos cinco milímetros por encima de la bobina de calentamiento. Posteriormente, caliente la bobina y use pinzas para doblar la punta unos 45 grados hacia un lado.

Dóblelo nuevamente unos menos 45 grados para dirigir la punta hacia atrás en paralelo al eje principal. A continuación, llene el barril de referencia con montones de solución salina tamponada. Inserte un alambre de plata clorada en él y selle el barril con cera dental.

En este paso, conecte tanto el electrodo sensible a iones como el electrodo de referencia a los micromanipuladores y bájelos en una cámara experimental perfundida con LCR A. Bajo el microscopio estereoscópico, conecte los hilos de plata clorada a las entradas respectivas de la etapa principal del amplificador diferencial. A continuación, determine las resistencias de los electrodos.

Después de eso, ajuste las señales de voltaje a cero y comience a grabar para la calibración. Después de obtener una línea de base estable, cambie a la solución salina que contenga concentraciones definidas del ion que se va a medir. Ahora, transfiera una rebanada de hipocampo de 250 micras de grosor a la cámara experimental y fíjela con una rejilla.

Baje el microelectrodo selectivo de iones calibrado sobre la superficie de la rebanada. A continuación, baje aún más el electrodo unas 50 micras en el radiador del estrato de la región CA uno. Para aplicar el agonista del transmisor, llene la pipeta de aplicación con 0,5 milimolares de glutamato.

Conecte la pipeta a un micromanipulador y conéctela a un dispositivo de aplicación de presión. A continuación, baje la pipeta de aplicación en el pañuelo y colóquela con cuidado cerca de la punta del microelectrodo selectivo de iones. Inicie la aplicación de presión a 40 milibares.

Aquí se muestra el cambio en el voltaje de los barriles de referencia de un electrodo de doble barril y un electrodo concéntrico en respuesta a cambios en la concentración de sodio del baño. Y estos son los cambios en el voltaje del potencial de sodio de un electrodo de doble cañón y un electrodo concéntrico en respuesta a cambios en la concentración de sodio del baño. Esta figura muestra el gráfico semilogarítmico de la concentración de sodio del baño frente al voltaje del potencial de sodio de ambos electrodos.

Los gráficos lineales revelan una pendiente de aproximadamente 48 milivoltios para ambos electrodos. Aquí está la respuesta de un electrodo de doble cañón y un electrodo concéntrico a un cambio rápido en el baño. Concentración de sodio de 152 milimolar a 70 milimolar.

Tenga en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo concéntrico es significativamente más rápido. Esta figura muestra el transitorio de sodio extracelular detectado por electrodos concéntricos y de doble cañón, los cambios transitorios en el voltaje de los barriles de referencia y la concentración de sodio extracelular fueron inducidos por perfusión en baño con 10 milimolares de aspartato durante 120 segundos según lo indicado por la barra. Y en esta figura, los cambios transitorios en el voltaje de los barriles de referencia y la concentración de sodio extracelular fueron inducidos por la aplicación de presión local con glutamato 10 milimolar durante 0,2 segundos.

Tenga en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo cónico es significativamente más rápido en esta condición. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que el silencio adecuado es el paso clave para la producción exitosa de microelectrodos electivos de hierro. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar y usar estos electrodos para la detección de hierro extracelular, transitorio en el tejido cerebral.