Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas
30 de marzo de 2016
Se describe una técnica para aislar hepatocitos humanos y células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante. Los diferentes tipos de células hepáticas constituyen la base para los modelos funcionales de hígado y la ingeniería de tejidos. Este nuevo método tiene como objetivo aislar células hepáticas en un alto rendimiento y viabilidad.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la hepatología y la toxicología y ofrecernos la oportunidad de desarrollar nuevos modelos de cocultivo in vitro y de ingeniería tisular. La ventaja de esta nueva técnica es aislar todas las poblaciones de células hepáticas del mismo donante y de la misma pequeña pieza de tejido hepático. Para comenzar este procedimiento, pese el tejido hepático recién diseccionado en condiciones de estilo y coloque la muestra de tejido hepático en la campana de flujo de aire laminar.
A continuación, limpie la sangre de la superficie de la muestra de tejido. A continuación, enjuague las cánulas con 1X perfusion solution one. Use el pegamento de tejido para fijar las aceitunas de las cánulas en los vasos sanguíneos más grandes.
A continuación, pruebe la perfusión y compruebe si hay fugas en las cánulas. Posteriormente, cierre todos los vasos sanguíneos que gotean una solución de perfusión clara 1X con pegamento para tejidos. Después de eso, coloque la muestra de tejido hepático canulado en el embudo de Buchner.
A continuación, ajuste el caudal de la bomba peristáltica entre 7,5 y 14,6 milímetros por minuto, dependiendo del número de cánulas utilizadas y de la resistencia del tejido hepático. Perfundir el tejido hasta que toda la sangre se enjuague durante al menos 20 minutos y durante un máximo de 30 minutos. En algunos casos, puede ser necesario sujetar una de las cánulas con pinzas de plástico o aumentar la presión interna de una zona presionando suavemente contra la cápsula hepática con una espátula para optimizar la perfusión.
Un cambio completo de color de rojo parduzco a marrón claro o amarillo claro indica una buena perfusión. Luego, cambie el líquido de perfusión a una solución de digestión que contenga colagenasa P. Luego, reorganice la configuración para el paso de digestión. Posteriormente, realice un flujo circular de solución de digestión durante un máximo de 15 minutos.
Detener periódicamente la perfusión y comprobar el grado de digestión. Es esencial que la perfusión con solución de digestión se detenga inmediatamente cuando la muestra de tejido hepático se haya digerido lo suficiente. Saque el hígado del dispositivo cuando esté listo y colóquelo en un plato de vidrio.
Enjuague el exterior de la muestra de tejido con una solución Stop fría como hielo. Retire las cánulas de la muestra de tejido hepático. Luego, use un bisturí para abrir la muestra de tejido hepático haciendo una incisión en el centro del área donde se unieron las cánulas y asegúrese de que la cápsula de Glisson permanezca intacta.
Enjuague el interior de la muestra de tejido y luego cubra toda la muestra de tejido con Stop Solution. A continuación, agite el tejido suavemente para liberar las células de él. Luego, recoja la suspensión celular y fíltrela a través de un embudo de gasa en 10 tubos de plástico de 50 mililitros.
Agregue más solución de parada a la muestra de tejido hepático hasta que se consuma un volumen final de 500 mililitros. Luego, centrifuga la suspensión de la celda, recoge el sobrenadante para el aislamiento de NPC más tarde y agrupa los gránulos de la celda en tubos de plástico de 250 mililitros. Posteriormente, lavar los pellets de celda con PBS.
Para ello, centrifuga la suspensión celular. Recoja el sobrenadante, agrupe los gránulos y vuelva a suspender el gránulo en el medio de incubación de hepatocitos. A continuación, determine el número de células y la viabilidad de la suspensión celular resultante mediante la tinción con azul de tripano.
Para aislar las células hepáticas no parenquimatosas, centrifugar el sobrenadante recolectado para eliminar los eritrocitos y hepatocitos restantes. Recoja los sobrenadantes y centrifugue dos veces para obtener los gránulos celulares para la sedimentación de HCS, LEC, parcialmente KC y el KC restante. A continuación, vuelva a suspender los gránulos en HBSS. A continuación, prepare un gradiente de densidad del 25% y del 50% mezclando la solución de gradiente de densidad y PBS para la centrifugación en gradiente de densidad.
Coloque la solución de gradiente de 25% de densidad con cuidado encima de la capa de solución de gradiente de 50% de densidad. Posteriormente, coloque la suspensión NPC con cuidado y lentamente sobre la capa de solución de gradiente de 25% de densidad para lograr una separación clara de ambas capas. Centrifugar la suspensión celular en el gradiente de densidad sin interrupción.
Los NPC se encuentran en la interfase entre las capas de gradiente de densidad del 25% y del 50%. Aspire las células muertas y los restos celulares de la capa superior y recoja la interfase con cuidado. Después de la centrifugación dual, realice un recuento de células para la fracción KC y MPC.
A continuación, centrifugar la fracción de NPC con el paso de centrifugación dual descrito anteriormente y resuspender el NPC en el medio de siembra Kupffer Cell. Siembre la fracción que contiene KC en los recipientes de cultivo celular de plástico a una densidad de cinco veces 10 por el 5º KC por centímetro cuadrado. Incubar los cultivos de KC durante 20 minutos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono.
El KC primario debe adherirse a los plásticos del cultivo celular en un corto período de tiempo. Luego, recoja el sobrenadante que contiene el NPC no adherido que consiste principalmente en LEC y HSC. Para separar LEC de HSC, comience con una centrifugación del sobrenadante.
A continuación, lave el pellet con PBS. Después de la segunda centrifugación, vuelva a suspender las células en un medio de separación de células endoteliales estrelladas y realice un recuento de células para todas las células restantes. A continuación, vuelva a suspender 10 millones de células en un mililitro de medio de separación de células endoteliales estrelladas.
A continuación, añada 20 microlitros de solución bloqueante del kit MAX y 20 microlitros de microperlas CD31 para el inmunomarcaje e incube la suspensión resultante durante 15 minutos a cuatro grados centígrados de temperatura. A continuación, separe el LEC del HSC como se describe en el protocolo del fabricante para el sistema de clasificación de células activado magnéticamente max y recoja la fracción HSC. Eluir la LEC positiva para CD31 retenida magnéticamente y suspenderla en un medio de cultivo de células endoteliales estrelladas.
Aquí, estas imágenes muestran las diferentes poblaciones de células hepáticas aisladas directamente después del proceso de aislamiento en una vista de microscopía de contraste de fase. Este conjunto de imágenes presenta las células aisladas y cultivadas después de 24 horas de cultivo. Aquí se muestra la caracterización basada en inmunofluorescencia de diferentes fracciones celulares.
La PHH mostró señales positivas para el marcador de hepatocitos CK18 24 horas después del aislamiento, las KC fueron positivas para el marcador CD68 24 horas después del aislamiento, las LEC mostraron señales positivas para vimentina 72 horas después del aislamiento y las HSC fueron positivas para GFAP 72 horas después del aislamiento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que un aislamiento exitoso depende de la digestión óptima de la muestra de tejido hepático. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo controlar la digestión y cómo realizar la separación del gradiente de densidad, que son los pasos críticos de este procedimiento.
Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación médica exploraran las funciones y enfermedades hepáticas en cultivos celulares in vitro y modelos hepáticos de ingeniería tisular de nueva creación.
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Visión general
Este artículo describe una técnica para aislar hepatocitos humanos y células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante. El método tiene como objetivo lograr un alto rendimiento y viabilidad de las células hepáticas, que son esenciales para modelos hepáticos funcionales e ingeniería de tejidos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Hepatología
- Toxicología
- Ingeniería de tejidos
Fundamentos
- El aislamiento de células hepáticas es crítico para la investigación y aplicaciones terapéuticas.
- Los métodos actuales pueden no producir todas las poblaciones de células hepáticas de un solo donante.
- Mejorar la viabilidad y el rendimiento celular puede mejorar los modelos in vitro.
- Esta técnica aborda las limitaciones de los métodos de aislamiento existentes.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método para aislar todas las poblaciones de células hepáticas de un solo pedazo de tejido hepático.
- Mejorar la viabilidad y el rendimiento de las células hepáticas aisladas.
- Facilitar el desarrollo de nuevos sistemas de co-cultivo in vitro.
Métodos utilizados
- Pesar el tejido hepático recién diseccionado.
- Limpiar la sangre de la superficie del tejido.
- Fluvializar las cánulas con solución de perfusión.
- Usar pegamento de tejido para asegurar las cánulas en los vasos sanguíneos.
Principales resultados
- La técnica aísla con éxito múltiples tipos de células hepáticas.
- Se logró un alto rendimiento y viabilidad de las células.
- Se demostró el potencial para mejorar los modelos hepáticos in vitro.
- El método permite el estudio de la función y toxicidad hepática.
Conclusiones
- Este método proporciona una forma confiable de obtener células hepáticas para la investigación.
- Abre nuevas vías para la ingeniería de tejidos y las pruebas de medicamentos.
- Los estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para varias aplicaciones.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Access to purified primary human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from a single donor enables the reconstruction of physiologically relevant human liver models for drug metabolism and toxicity testing. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by providing a disease-relevant system that maintains hepatocyte function through paracrine signaling from Kupffer cells, liver endothelial cells, and hepatic stellate cells. The method enhances predictive confidence in lead identification by reducing the biological variability associated with dedifferentiated monocultures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a multicellular liver microenvironment that reflects in vivo patho-physiology.
- Operational Value: Provides a renewable source of phenotypically stable hepatocytes and NPCs for consistent target engagement assays.
- Scientific Value: Supports functional validation of targets involved in drug-induced liver injury through co-culture models that capture cell-cell communication.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers qualified biological systems with defined cellular composition for assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Generates quantitative outputs such as albumin secretion, urea production, and CYP450 activity for reliable compound evaluation.
- Scientific Value: Facilitates phenotypic screening in 3D or co-culture formats that better predict clinical hepatotoxicity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a disease-relevant system for studying liver pathophysiology and evaluating therapeutic candidates in a human context.
- Operational Value: Enables translational biomarker discovery by correlating in vitro readouts with clinical outcomes.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating the contribution of individual cell populations to liver injury pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The isolated cell populations integrate into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical safety assessment, providing a continuous source of human liver biology for iterative model refinement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling functional readouts in co-cultures that mimic the liver sinusoid.
- Screening: Delivers assay-ready cells with high viability and standardized isolation for reproducible compound screening campaigns.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements such as metabolite formation, reactive oxygen species, and cytokine release for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through a scalable source of primary human liver cells that maintain key functional markers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform that reduces dependency on variable tissue sources and supports cross-project consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in hepatotoxicity assessment by maintaining hepatocyte differentiation and function through NPC co-culture.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability of liver cell production from single donor samples, reducing batch-to-batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, human-relevant safety data that reduces late-stage attrition due to liver toxicity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mechanistic liver liability profiles derived from physiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in perfusion techniques, density gradient centrifugation, and cell sorting procedures.
- Dependent on access to fresh human liver tissue and specialized equipment such as peristaltic pumps and magnetic cell separators.
- Necessitates cross-team standardization of isolation protocols to ensure consistent cell quality and viability across sites.
- Involves adaptation considerations when scaling from small tissue samples to larger-scale production for multi-well screening formats.
- Practical limitations include tissue donor variability and the time-sensitive nature of cell isolation post-resection, which must be managed through standardized SOPs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:33
Perfusion and Digestion of Liver Tissue Sample
2:36
Isolation of Hepatocytes
3:56
Isolation of Non-parenchymal Liver Cells
5:16
Separation of Kupffer Cells, Endothelial Cells, and Stellate Cells
7:07
Results: Morphology of Human Parenchymal and Non-parenchymal Liver Cells in Suspension and After Adherence
7:57
Conclusion
