Name: Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprende a aislar hepatocitos primarios humanos y poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante mediante perfusión y gradiente de densidad. Este método optimiza la viabilidad celular para modelos hepáticos in vitro.

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Nos gustaría dar las gracias a Liu Jia Li por su apoyo en la creación de la figura 1. Este estudio fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación y Proyecto de investigación (BMBF) de hígado virtual: 0.315.741.

Nota: se aislaron Todas las células de tejido hepático resecado no tumoral humana, que se mantuvo después de la resección parcial del hígado con tumores hepáticos primarios o secundarios. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes de acuerdo con las directrices éticas de la Charité - Universidad de Berlín. 1. Preparación de materiales y soluciones <ol><li> Esterilizar todos los instrumentos y los materiales por adelantado para evitar la contaminación bacteriana durante el proceso de aislamiento. </li><li> Preparar las soluciones necesarias para la perfusión de la muestra de tejido del hígado, el proceso de aislamiento de los hepatocitos y las células hepáticas no parenquimatosas y el cultivo de células hepáticas humanas primarias de acuerdo con las Tablas 1 y 2, con excepción de la digestión-Solution que se prepara recién antes de su uso. Todas las soluciones se pueden almacenar a 4 ° C y se recomienda para usarlos dentro de las 4 semanas después de la preparación. </li><li> Esterilizartodas las soluciones utilizando un filtro de 0,22 micras superior botella. </li></ol> 2. Preparación de los equipos de perfusión <ol><li> Configurar el equipo para la perfusión y la digestión de la muestra de tejido del hígado como se muestra en la Figura 1A. </li><li> Ajustar la temperatura del baño de agua a 39 ° C para garantizar una actividad óptima P colagenasa durante la perfusión y la digestión. </li></ol> 3. perfusión y digestión de la muestra de tejido del hígado (1,5 hr) <ol><li> Seleccionar una muestra de tejido con la cápsula de Glisson una intacto del tejido hepático resecado. Al cortar la muestra de tejido, tratar de obtener una superficie de corte pequeña con buenos vasos visibles. Evitar los tiempos de isquemia caliente por el transporte y manipulación de la muestra de tejido hepático en hielo hasta que la perfusión. </li><li> Tome el peso del tejido en condiciones estériles y colocar la muestra de tejido hepático en una placa de Petri en el flujo de aire laminar. Limpiar la superficie de la muestra de tejido con una compresa estéril de rerestante sangre y eliminar el conjunto de cánula de perfusión utilizando 1x-Solución I para garantizar que toda la cánula eran permeables. </li><li> Utilice pegamento de tejido para fijar las aceitunas de las cánulas en algunos vasos sanguíneos más grandes. Dependiendo del tamaño de la muestra de tejido del hígado y el número de los vasos en la superficie, el uso de una cánula fijada con 3 a 8 cánulas. Prueba de la perfusión y comprobar si hay fugas. Cerrar todos los vasos sanguíneos, los cuales sale clara 1x-perfusión Solución I, con adhesivo tisular. </li><li> Colocar la muestra de tejido del hígado canulado en el embudo Büchner en su disco de filtro perforada (Figura 1A). </li><li> Ajuste el caudal de la bomba peristáltica entre 7,5 ml / min y 14,6 ml / min en función del número de cánulas usadas y en la resistencia del tejido hepático. Ajustar la velocidad de flujo cada vez para asegurar que hay una perfusión actual pero lento. Perfundir el tejido hasta que toda la sangre se vacía pero al menos 20 min. Observar el tejido vuelve más brillante en áreas con buenas perfusien. Nota: En algunos casos, puede ser necesario para sujetar una de las cánulas con abrazaderas de plástico o para aumentar la presión interna de un área empujando suavemente con una espátula en contra de la cápsula hepática, para optimizar la perfusión. Un cambio completo de color a un amarillo claro al color marrón claro indica una buena perfusión. </li><li> Cambiar el fluido de perfusión a la digestión-Solution que contiene colagenasa P (Tabla 1). </li><li> Reorganizar la configuración (Figura 1A) para la etapa de digestión. Por lo tanto realizar un flujo circular de digestión-solución de acuerdo con la Figura 1B para un máximo de 15 min. Nota: Es fundamental para detener la perfusión inmediatamente cuando la muestra de tejido del hígado se digiere lo suficiente. Una buena digestión se puede observar, cuando el tejido no muestra signos de elasticidad según la evaluación de mantenimiento de las deformaciones de la cápsula, cuando se empuja con una espátula. </li></ol> 4. Aislamiento de los hepatocitos (1 hr) <ol><li> Turna la bomba peristáltica fuera y colocar la muestra de tejido hepático en un plato de cristal. Enjuague el exterior de la muestra de tejido con hielo frío Stop-Solution (Tabla 1). Retire las cánulas de la muestra de tejido del hígado. Utilice un bisturí para abrir la muestra de tejido del hígado, mediante la incisión en el medio de la zona donde se unen las cánulas. Mantener la atención que la cápsula Glisson&#39;s se mantiene intacta. </li><li> Enjuague el interior de la muestra de tejido y luego cubrir toda la muestra de tejido con hielo frío Stop-Solution. Agitar el tejido suavemente para liberar las células de los tejidos. </li><li> Recoger la suspensión celular y se filtra a través de una mirada embudo (embudo de plástico forrada con compresas de gasa) en tubos de 50 ml de plástico. Añadir más Stop-Solución para la muestra de tejido hepático hasta que se consume un volumen final de 500 ml. </li><li> Centrifugar la suspensión celular a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recoger el sobrenadante para su posterior aislamiento de células no parenquimatosas. Lavar el sedimento celular con PBS (Figura 2A). </li><li> Centrifugar la suspensión celular de nuevo a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recoger el sobrenadante y resuspender el sedimento en medio de hepatocitos de incubación (Tabla 2, Figura 2B). </li><li> Determinar el número de células y la viabilidad en la suspensión de células resultante usando tinción con azul de tripano. Contar las células vivas y muertas en una cámara de recuento Neubauer. Calcular el número de células, la viabilidad y el rendimiento de PHH utilizando las fórmulas de abajo. Rendimiento (células contadas) = ​​células contadas x factor de dilución x volumen de suspensión celular (ml) x 10.000 rendimiento (hepatocitos / (g de hígado muestra de tejido)) = (rendimiento (hepatocitos / (medios ml)) x volumen de suspensión de células (ml)) / (peso de la muestra de tejido del hígado (g)) viabilidad (%) = 100% x (número de células vivas) / (número total de células) </li></ol> 5. Purificación de los hepatocitos (1 hr) Nota: Se recomienda esta etapa de purificación, si la viabilidades inferior a 70%. <ol><li> Realizar todos los pasos en el hielo. Preparar un gradiente de densidad 25% mediante la mezcla de solución de gradiente de densidad de 5 ml y 15 ml de PBS para centrifugación en gradiente de densidad. </li><li> Poner un máximo de 50 células Mio en total de la suspensión celular de los hepatocitos ricos lentamente y con cuidado en la parte superior de la capa de gradiente de densidad de 25% para asegurar que una clara separación de las dos capas se consigue (Figura 2C). Poner los tubos con cuidado en la centrífuga y se centrifuga a 1250 xg, 20 min, 4 ° C sin freno (Figura 2D). </li><li> Aspirar la suspensión celular restante y las células muertas en la interfase. Dependiendo del contenido de grasa uno también podría aspirar el gradiente de solución de densidad. Nota: PHH con bajo contenido de lípidos forman un sedimento denso y el gradiente de densidad puede ser aspirado por completo. PHH con alto contenido en lípidos formar un sedimento más difuso y una gran cantidad de células viables puede permanecer en la solución de gradiente de densidad por encima de la pastilla. </li><li>Vuelva a suspender los gránulos de hepatocitos con PBS y centrifugar de nuevo a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Agrupar los gránulos, se lava de nuevo con PBS y resuspender purificada PHH en medio de hepatocitos de incubación. Realizar el recuento de células como se describe en el paso 4.6. </li></ol> 6. Cultivo de hepatocitos <ol><li> Preparar las placas de cultivo de células para la siembra de PHH recubriéndolos con una matriz extracelular, por ejemplo colágeno de cola de rata (colágeno de tipo I). Preparar el colágeno de cola de rata de acuerdo con el protocolo establecido por Rajan et al. 17 </li><li> Se diluye la cola de rata colágeno solución madre de 1: 200 en PBS. Transferencia / cm solución de 100 l 2 de rata colágeno de cola en las placas de cultivo, teniendo cuidado de que toda la superficie está cubierta. Incubar los plásticos de cultivo de células durante 20 min a temperatura ambiente. Aspirar la solución de colágeno de cola de rata restante. </li><li> Semilla de 15 x 10 4 hepatocitos / cm2 en medio de hepatocitos de incubación sobre la cultura dishes recubierta con colágeno de cola de rata. Cultivar las células en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2 durante al menos 4 horas. Después de 4 horas los hepatocitos se han adherido y el medio puede ser cambiado. </li><li> Realizar investigaciones en función de la configuración experimental. Se recomienda un tiempo de cultivo de 48 horas para permitir que las células se recuperen del proceso de aislamiento. </li></ol> 7. Aislamiento de células hepáticas no parenquimatosas (1,5-2 h) <ol><li> Centrifugar el sobrenadante recogido (paso 4,5 y 4,6) a 72 xg, 5 min, 4 ° C para eliminar los eritrocitos y hepatocitos restantes. Agrupar los sobrenadantes y centrifugar dos veces para obtener dos sedimentos celulares: 300 xg, 5 min, 4 ° C durante la sedimentación de HSC, LEC y en parte KC y 650 xg, 7 min, 4 ° C para la sedimentación de los restantes KC. </li><li> Piscina ambos pellets y las vuelve a suspender en HBSS. Preparar un 25% y una densidad del 50% gradientes mediante la mezcla de solución de gradiente de densidad y PBS durante Centrif gradiente de densidadugation (25% de solución de gradiente de densidad: 5 ml solución de gradiente de densidad y 15 ml de PBS, solución de gradiente de densidad de 50%: solución de gradiente de 10 ml de densidad y 10 ml de PBS, ver Figura 2). Colocar la solución de gradiente de densidad 25% cuidadosamente en la parte superior de la capa de solución de gradiente de densidad de 50%. </li><li> Ponga la suspensión NPC con cuidado y poco a poco en la parte superior de la capa de solución de gradiente de densidad de 25% de una manera que se consigue una clara separación de las dos capas. </li><li> Centrifugar la suspensión de células en el gradiente de densidad en 1.800 xg, 20 min, 4 ° C sin freno (Figura 2.2). </li><li> Aspirar las células muertas y restos de células de la capa superior. El NPC se encuentran en la interfase entre la capa de gradiente de densidad de 25% y 50% (Figura 2). Recoger la APN, lavarlos con HBSS y se centrifuga la suspensión celular aplicando el paso de doble centrifugación descrito anteriormente (punto 7.2.). </li></ol> 8. separación de las células de Kupffer (adherenciaEtapa de Separación) (1 h) <ol><li> Realizar un recuento de células para el KC en la fracción de la APN como se describe en el paso 4.6. (Para aparición de KC en suspensión véase la Figura 3B). Centrifugar la fracción NPC con la etapa de centrifugación de doble descrita anteriormente (paso 7.2) y volver a suspender el medio NPC en Kupffer la siembra de células (Tabla 2). </li><li> Sembrar la fracción que contiene KC en recipientes de cultivo celular de plástico a una densidad de 5 x 10 5 KC / cm2. Los cultivos se incuban KC durante 20 minutos en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2. KC primaria se adhieren sobre plásticos de cultivo de células dentro de un corto período de tiempo (Figura 2.3). </li><li> Recoger el sobrenadante que contiene no adherido APN, que consiste principalmente de LEC y HSC. Piscina los sobrenadantes para la separación posterior de LEC (véase la sección 9) y HSC (véase el apartado 10). Lavar el adherente KC con HBSS y cultivarlas en Kupffer medio de cultivo de la célula (Tabla 2) a 37 ° C, 5% de CO2 en una incubadora humidificada. </li></ol> 9. Separación de las células endoteliales (1,5 hr) <ol><li> Centrifugar el sobrenadante recogido (etapa 8.5.) En 300 xg, 5 min, 4 ° C. Lavar el pellet con PBS. Después de la centrifugación a 300 xg, 5 min, 4ºC volver a suspender las células en Stellate celular / medio de separación de células endoteliales y realizar un recuento de todas las células restantes como se describe en el paso 4.6. </li><li> Vuelva a suspender 1 x 10 7 células Mio en 1 ml de las células estrelladas / medio de separación de células endoteliales, añadir 20 l solución de bloqueo de la MACS-KIT y 20 l de los granos del CD31 Micro para immunolabeling e incubar la suspensión resultante durante 15 minutos a 4 temperatura ° C (Figura 2.4). </li><li> LEC separado de HSC como se describe en el protocolo manufacturer&#39;s para el sistema de clasificación de células activadas magnéticamente MACS (Figura 2.5). Eluir magnéticamente retenido LEC CD31-positivas y suspenderlos en Stellate Cell / medio de cultivo de células endoteliales (Tabla 2). </li><li> Realizar celular contando para LEC como se describe en el paso 4.6. LEC de semillas en una densidad de 1,25 x 10 5 células / cm 2 en recipientes de cultivo celular recubiertas con colágeno de cola de rata (véase el paso 6.1). Cultivar las células a 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador humidificado. </li></ol> 10. Separación de células estrelladas (0,5 hr) <ol><li> Sin etiqueta HSC pasar la columna de separación durante el procedimiento MACS. Recoger la fracción HSC (véase el paso 9.5, figura 2.5). Realizar el recuento de células como se describe en el paso 4.6. </li><li> HSC semilla con una densidad de 5 x 10 4 células / cm 2 en recipientes de cultivo celular recubiertas con colágeno de cola de rata (véase el paso 6.1) en Stellate celular / medio de cultivo de células endoteliales (Tabla 2) y cultivarlas a 37 ° C, 5% CO 2 en un incubador humidificado. </li></ol><img alt= &quot;Tabla 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53069 / 53069table1.jpg&quot; /&gt; Tabla 1: perfusión y solución de aislamiento. <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> Tabla 2: Cultivo y aislamiento medios de comunicación.

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Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

El protocolo publicado describe una técnica para aislar puro PHH y NPC, a saber, KC, HSC y LEC, a la vez de alta calidad y pureza a partir de la misma muestra de tejido hepático humano. La mayoría de las publicaciones que se ocupan de aislamientos de células del hígado cubren sólo una de esas poblaciones de células 18-20 y procedimientos de aislamiento realizadas con tejidos humanos son raros (revisado por Damm y col.) 21. Adaptación de los métodos establecidos con el tejido animal (po...

tejido hepático humano es muy complejo y se compone de dos entidades diferentes de células, las células del parénquima y células no parenquimatosas (APN). las células hepáticas parenquimatosas incluyen los hepatocitos y cholangiocytes. Los hepatocitos representan 60 a 70% de las células hepáticas totales y representan la mayor parte de las funciones del hígado metabólicos, por ejemplo, ácidos biliares y complementan la síntesis del factor, la biotransformación y la energía metabolismo 2,3. La fracción más pequeña NPC constituye el 30-40% de las células hepáticas totales. NPC incluyen diferentes poblaciones de células, a saber, células de Kupffer (KC), células hepáticas endoteliales (LEC) y las células estrelladas hepáticas (HSC). Esta fracción de células heterogénea juega un papel central en los procesos fisiológicos del hígado. Además, NPC participar en la mediación de daño hepático agudo, por ejemplo, lesión hepática inducida por fármacos (DILI), así como en lesiones crónicas del hígado, como la cirrosis 4. En los últimos años, hlas células del hígado Uman se han vuelto cada vez más importante en la investigación y el desarrollo de las pruebas de drogas, el desarrollo de medicamentos e identificación de nuevas vías bioquímicas en las enfermedades hepáticas. Para el ensayo in vitro monocultivos PHH se siguen considerando como el &quot;patrón oro&quot; 5. La principal limitación de los modelos actuales de hígado homotípicos es desdiferenciación y pérdida de función de los hepatocitos dentro de unos pocos días 4. El establecimiento de técnicas (3D) de cultivo de 3-dimensionales ha demostrado que estas limitaciones se pueden compensar 4,6. Sin embargo, incluso las modernas técnicas de cultivo en 3D no son capaces de mostrar todos los modos de acciones hepatotóxicos 7. Faltan las poblaciones de la APN en los modelos in vitro existentes se discuten como una posible razón de esta discrepancia a la situación in vivo. Se ha demostrado que la comunicación célula-célula entre las diferentes poblaciones de células de hígado juega un papel central en la homeostasis fisiológica, sino también en pathophysiologic procesa 8. Por lo tanto la atención científica se centra cada vez más en la APN y sus interacciones célula-célula. Su uso con propósitos específicos en co-cultivo y sistemas de ingeniería tisular podría ser una solución para la alta demanda de los modelos in vitro de hígado 8,9, que son lo más cercano a la situación in vivo como sea posible. Actualmente, el principal reto es el desarrollo de un modelo de hígado co-cultura humana normalizada, que contiene partes claramente definidas de PHH y el CNP. En consecuencia, se necesitan técnicas de aislamiento de las células del hígado muy heterogéneos y los que tienen que ser optimizado para obtener poblaciones de células puras. Mientras que los protocolos estandarizados para el aislamiento PHH existen 10, el aislamiento normalizado de la APN humano está todavía en desarrollo. Protocolos de aislamiento de la APN más publicados se basan en experimentos con células no humanas 11,12. Sólo unas pocas publicaciones describen el proceso de aislamiento de la APN humana y la mayoría sólo cubrenmétodos para el aislamiento de un solo tipo de células 11-16. Las características de las células más importantes que han sido aprovechadas para la separación celular son el tamaño, la densidad, el comportamiento de fijación, y la expresión de proteínas de la superficie. Sobre la base de estas características se desarrolló un protocolo simplificado para aislar PHH, KC, LEC y HSC, que fue publicado previamente en Biología y Medicina Experimental 1. Debido al amplio interés en esta técnica, el objetivo de este trabajo fue proporcionar un protocolo más detallado para el proceso de aislamiento de células del hígado incluyendo un video, lo que permitirá la reproducción de la técnica con mayor facilidad. El protocolo incluye también métodos de control de calidad para la evaluación de rendimiento y la viabilidad, así como para la evaluación de la identificación y la pureza usando immunostainings específicos.

<table><tbody><tr><td>General Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY</td><td>pipetas Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscopio Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-incubadora</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamin Air</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Vávarifugo 3.0R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td>de orina Sarstedt 2041101</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jeringa perfusora 50 ml</td><td>B.Braun</td><td>12F0482022</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de tapa de botella</td><td>Nalgene</td><td>1058787</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Tubo cónico de polipropileno</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Tubo cónico de polipropileno</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos</td><td>BD Biosciences</td><td>533047</td><td>pipetas</td></tr><tr><td>serológicas</td> de 24 pocillos <td>BD Biosciences</td><td>357525, 357551, 357543</td><td>25 ml, 10 ml, puntas</td>de</tr><tr><td>pipeta</td> de 5 ml <td>SARSTEDT</td><td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td><td>100 &micro; l, 200 y micro; l, 1.000 y micro; l</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo de aislamiento</baño ></td><td></td><td></td><td></td> agua fuerte</tr> <tr><td>Bomba peristáltica Lauda</td><td></td> Circulación Carl Roth <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> termostato</td><td>Lauda medidor de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>balanzas finas</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stand</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; embudo chner embudo</td> de plástico <td>Haldenwanger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubo de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>silicona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cánulas con puntas</td><td></td><td></td><td></td>de oliva</tr><tr><td>pinza</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>plato</td><td></td><td></td><td></td>de vidrio</tr><tr><td>bisturí</td><td>Feather</td><td>12068760</td><td></td></tr><tr><td>cámara de recuento Neubauer</td>Elevador de células óptico <td>para el trabajo</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical Drape</td><td>Charit&eacute; Universit&auml; tsmedizin Berlin A2013027</td><td></td><td></td></tr><tr><td>compresa</td><td>Fuhrmann</td><td>40013331</td><td></td></tr><tr><td>guantes quirúrgicos estériles</td><td>Gammex PF</td><td>1203441104</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento para tejidos</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>frasco de vidrio</td><td>Colagenasa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P</td> de <td>Roche</td><td>Roche 13349524</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Biochrom</td><td>L6145</td><td>Densidad 1.124 g/ml</td></tr><tr><td>Hank' s BSS</td><td>PAA</td><td>H00911-3938</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS</td><td>PAA</td><td>H15 - 002</td><td>sin Mg/Ca</td></tr><tr><td>Ampuwa</td><td>Plastipur&nbsp;</td><td>13CKP151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1.064.041.000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>49.361.000</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Pufferan&nbsp;</td><td>Roth</td><td>133196836</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Media Equipment&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-005</td><td>Glucosa baja (1 g/L) (sin L-glutamina)</td></tr><tr><td>HEPES Solución tampón 1&nbsp; M</td><td>GIBCO</td><td>1135546</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15 - 039</td><td>sin L-Glutamina</td></tr><tr><td>Piruvato de Sodio</td><td>GIBCO</td><td>1137663</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Azul Tripano Solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0.4%</td></tr><tr><td>William' s E&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>32551-020</td><td></td></tr><tr><td>con GlutaMAX&trade;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Fortecortin</td><td>Merck</td><td>49367</td><td>8 mg/2 ml</td></tr><tr><td>Insulina Humana</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td>100 I.E./ml</td></tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternera (FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Equipo para inmunotinciones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68</td><td>R& D Systems, EE. UU.</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>CK 19</td><td>Santa Cruz</td><td>D2309</td><td>policlonal</td></tr><tr><td>CK18</td> Santa <td>Cruz</td><td>K2105</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23.472-9</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-ratón IgG1-PE</td><td>Santa Cruz</td><td>C0712</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG-FITC</td><td>Santa Cruz</td><td>L0412</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T.Baker</td><td>1104509006</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído 4%</td><td>Herbeta Arzneimittel</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Al lado de los hepatocitos parenquimatosos, el hígado consiste en células no parenquimatosas (APN), a saber las células de Kupffer (KC), hígado células endoteliales (LEC) y las células estrelladas hepáticas (HSC). De dos dimensiones (2D) cultura de hepatocitos humanos primaria (HPP) todavía se considera como el &quot;patrón oro&quot; para las pruebas in vitro de metabolismo de fármacos y hepatotoxicidad. Es bien sabido que el monocultivo 2D de PHH sufre de desdiferenciación y pérdida de función. Recientemente se demostró que NPC hepáticas jugar un papel central en la fisiología del hígado (patógeno) y el mantenimiento de las funciones PHH. La investigación actual se centra en la reconstrucción de la arquitectura del tejido in vivo por 3D-y co-cultivo de los modelos para superar las limitaciones de los monocultivos 2D. Previamente hemos publicado un método para aislar células de hígado humano y se investigó la idoneidad de estas células para su uso en cultivos de células en Biología y Medicina Experimental 1. Basado en el amplio interés en este technique el objetivo de este trabajo fue proporcionar un protocolo más detallado para el proceso de aislamiento de células del hígado incluyendo un video, lo que permitirá una fácil reproducción de esta técnica. células de hígado humano se aislaron de muestras de tejido hepático humano de las intervenciones quirúrgicas por un EGTA / colagenasa técnica P perfusión de dos etapas. PHH se separaron de la NPC por una centrifugación inicial a 50 x g. Densidad etapas de centrifugación de gradiente se utilizan para la eliminación de células muertas. poblaciones de células hepáticas individuales fueron aislados de la fracción enriquecida NPC usando las propiedades de células específicas y procedimientos de clasificación de células. Al lado del aislamiento PHH fuimos capaces de separar KC, LEC y HSC para su posterior cultivo. En conjunto, el protocolo presentado permite el aislamiento de PHH y NPC en alta calidad y la cantidad de muestra de tejido de un donante. El acceso a las poblaciones de células hepáticas purificados podría permitir la creación de in vivo como Li humanamodelos Ver.

La separación en una fracción del parénquima y no parenquimatosas, usando centrifugación en gradiente de densidad como un procedimiento de limpieza en combinación con el uso de propiedades de adherencia y MACS conduce a éxito PHH y NPC aislamiento. PHH y el CNP se pueden aislar en alta calidad y en cantidad. La figura 1 muestra la configuración representante del equipo para la perfusión del hígado y la digestión. 10% de FCS se añadió a la colagenasa P que contiene de per...

Se describe una técnica para aislar hepatocitos humanos y células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante. Los diferentes tipos de células hepáticas constituyen la base para los modelos funcionales de hígado y la ingeniería de tejidos. Este nuevo método tiene como objetivo aislar células hepáticas en un alto rendimiento y viabilidad.

Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la hepatología y la toxicología y ofrecernos la oportunidad de desarrollar nuevos modelos in vitro de co-cultivo y de hígado ingenierizado. La ventaja de esta nueva técnica consiste en aislar todas las poblaciones de células hepáticas del mismo donante y del mismo pequeño fragmento de tejido hepático. Para comenzar este procedimiento, pese el tejido hepático recién diseccionado en condiciones estériles y coloque la muestra de tejido hepático en la cabina de flujo laminar.Luego limpie la sangre de la superficie de la muestra de tejido. A continuación, lave las cánulas utilizando la solución de perfusión 1X uno. Use el pegamento para tejidos para fijar las olivas de las cánulas en los vasos sanguíneos más grandes.Luego, pruebe la perfusión y verifique fugas en las cánulas. Posteriormente, cierre todos los vasos sanguíneos que presenten fugas de solución de perfusión clara 1X utilizando pegamento tisular. A continuación, coloque la muestra de tejido hepático canulado en el embudo de Buchner.A continuación, ajuste el caudal de la bomba peristáltica entre 7,5 y 14,6 mililitros por minuto, dependiendo del número de cánulas utilizadas y de la resistencia del tejido hepático. Perfunda el tejido hasta que se haya eliminado completamente la sangre durante al menos 20 minutos y un máximo de 30 minutos. En algunos casos, puede ser necesario ocluir una de las cánulas con pinzas de plástico o aumentar la presión interna de una zona presionando suavemente contra la cápsula hepática con una espátula para optimizar la perfusión.Un cambio de color completo, de rojizo marrón a marrón claro o amarillo claro, indica una buena perfusión. Posteriormente, cambie el líquido de perfusión por la solución de digestión que contiene colagenasa P. A continuación, reorganice el montaje para la etapa de digestión. Luego, realice un flujo circular de la solución de digestión durante hasta 15 minutos.Detenga periódicamente la perfusión y verifique el grado de digestión. Es esencial detener inmediatamente la perfusión con la solución de digestión cuando la muestra de tejido hepático esté suficientemente digerida. Saque el hígado del dispositivo cuando esté listo y colóquelo en un recipiente de vidrio.Lave el exterior de la muestra de tejido con Solución de Parada fría con hielo. Retire las cánulas de la muestra de tejido hepático. A continuación, use un escalpelo para abrir la muestra de tejido hepático realizando una incisión en el centro del área donde se sujetaron las cánulas y asegúrese de que la cápsula de Glisson permanezca intacta.Lave el interior de la muestra de tejido y luego cubra toda la muestra de tejido con la Solución de Parada. A continuación, agite suavemente el tejido para liberar las células. Después, recoja la suspensión celular y filtre a través de un embudo con gasa en 10 tubos plásticos de 50 mililitros.Añada más Solución de Parada a la muestra de tejido hepático hasta que se consuma un volumen final de 500 mililitros. Posteriormente, centrifugue la suspensión celular, recoja el sobrenadante para el aislamiento de NPC más adelante y reúna los pellet celulares en tubos plásticos de 250 mililitros. A continuación, lave los pellet celulares con PBS.Para ello, centrifugue la suspensión celular. Recopile el sobrenadante, reúna los sedimentos y resuspenda el sedimento en medio de incubación de hepatocitos. Luego, determine el número celular y la viabilidad en la suspensión celular resultante mediante tinción con azul de tripano.Para aislar las células hepáticas no parenquimatosas, centrifugue el sobrenadante recolectado para eliminar los eritrocitos y hepatocitos restantes. Recoja los sobrenadantes y centrifúgelos dos veces para obtener los pellets celulares destinados a la sedimentación de HCS, LEC, parte de KC y el KC restante. A continuación, re-suspenda los pellets en HBSS. Luego, prepare un gradiente de densidad del 25 % y uno del 50 % mezclando la solución para gradiente de densidad y PBS para la centrifugación en gradiente de densidad.Coloque cuidadosamente la solución de gradiente de densidad al 25 % encima de la capa de solución de gradiente de densidad al 50 %. Posteriormente, coloque cuidadosa y lentamente la suspensión de NPC encima de la capa de solución de gradiente de densidad al 25 % para lograr una separación clara de ambas capas. Centrifugue la suspensión celular en el gradiente de densidad sin frenado.Las NPC se encuentran en la interfase entre las capas del gradiente de densidad del 25 % y del 50 %. Aspire las células muertas y los restos celulares de la capa superior y recoja cuidadosamente la interfase. Después de la doble centrifugación, realice un conteo celular para la fracción de KC y la fracción de MPC.Luego, centrifugue la fracción de NPC con el paso de doble centrifugación descrito previamente y re suspenda el NPC en medio de siembra para células de Kupffer. Siembre la fracción que contiene KC en recipientes plásticos para cultivo celular a una densidad de cinco veces 10 a la 5ª KC por centímetro cuadrado. Incube los cultivos de KC durante 20 minutos en un incubador humedecido a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Las KC primarias deben adherirse a los plásticos de cultivo celular en un breve período de tiempo. Luego, recolecte el sobrenadante que contiene las NPC no adheridas, compuestas principalmente por LEC y HSC. Para separar las LEC de las HSC, comience con una centrifugación del sobrenadante.Luego, lave el sedimento con PBS. Después de la segunda centrifugación, re-suspenda las células en medio de separación de células estrelladas y células endoteliales y realice un recuento celular para todas las células restantes. A continuación, re-suspenda 10 millones de células en un mililitro de medio de separación de células estrelladas y células endoteliales.Luego, agregue 20 microlitros de la solución de bloqueo del kit MAX y 20 microlitros de microperlas CD31 para inmunomarcar, e incube la suspensión resultante durante 15 minutos a una temperatura de cuatro grados Celsius. Posteriormente, separe las LEC de las HSC según se describe en el protocolo del fabricante para el sistema de clasificación celular activado magnéticamente max y recoja la fracción de HSC. Eluya las LEC positivas para CD31 retenidas magnéticamente y suspéndalas en medio de cultivo de células endoteliales de células estrelladas.Aquí, estas imágenes muestran las diferentes poblaciones de células hepáticas aisladas inmediatamente después del proceso de aislamiento en vista de microscopía de contraste de fase. Este conjunto de imágenes presenta las células aisladas y cultivadas tras 24 horas de cultivo. Se muestra aquí la caracterización mediante inmunofluorescencia de diferentes fracciones celulares.Los HH mostraron señales positivas para el marcador de hepatocitos CK18 24 horas después del aislamiento, las KC fueron positivas para el marcador CD68 24 horas después del aislamiento, las LEC mostraron señales positivas para vimentina 72 horas después del aislamiento, y las HSC fueron positivas para GFAP 72 horas después del aislamiento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que un aislamiento exitoso depende de la digestión óptima de la muestra de tejido hepático. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo controlar la digestión y cómo realizar la separación mediante gradiente de densidad, que son los pasos críticos de este procedimiento.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación médica exploraran las funciones hepáticas y las enfermedades en cultivos celulares in vitro recién creados y en modelos de hígado bioingenierizados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Hepatocitos primarios proporcionará una herramienta valiosa para evaluar las funciones bioquímicas, moleculares y metabólicos en un sistema experimental fisiológicamente relevantes. Se describe un protocolo fiable para la rata en la perfusión del hígado in situ, que constantemente genera hepatocitos viables hasta to1.0 ×...

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Se describe un procedimiento de perfusión con colagenasa de dos etapas modificado para el aislamiento de hepatocitos humanos. Este método también se puede aplicar a otros hígados de mamíferos. Los hepatocitos aislados están disponibles con un alto rendimiento y la viabilidad, por lo que un modelo adecuado para la investigación científica en áreas como la regeneración hepática, farmacocinética y toxicología.

El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos

lesiones hepáticas están acompañados por la expansión de células progenitoras que representa una población heterogénea de células. clasificación Novel de este compartimento celular permite la distinción de varios subconjuntos. El método descrito aquí ilustra el flujo de análisis de citometría de alto aislamiento y pureza de varios subconjuntos que se pueden utilizar para más ensayos.

El aislamiento y enriquecimiento de hígado progenitoras subconjuntos identificados por una combinación de marcadores de superficie Novel

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de hepatocitos primario de ratón sano y funcional. Para detectar la síntesis hepática de la proteína naciente por substrato etiquetado no radiactivo se instrucciones para ayudar a comprender los mecanismos subyacentes a la síntesis de proteínas en el marco de la homeostasis del metabolismo energético en el hígado.

Aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo L-azidohomoalanine

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía paso a paso para realizar experimentos 3D "hígado-en-un-chip" infección con el virus de la hepatitis B.

"Hígado-en-un-Chip" cultivos de hepatocitos primarios y células de Kupffer para infección del Virus de la Hepatitis B

Los hepatocitos primarios son una herramienta valiosa para estudiar la respuesta hepática y el metabolismo in vitro. Utilizando reactivos disponibles comercialmente, se desarrolló un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón.

Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones

Este protocolo detalla el uso de un catéter intravenoso especial, tubos desechables estériles estandarizados, control de temperatura complementado con monitoreo en tiempo real y un sistema de alarma para el procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos para mejorar la consistencia en la viabilidad, el rendimiento y la funcionalidad de los hepatocitos primarios aislados de ratas.

Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

Los hepatocitos cargados de lípidos son inherentes a la regeneración hepática, pero generalmente se pierden con la centrifugación por gradiente de densidad. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento celular optimizado que retiene hepatocitos esteatósicos, produciendo poblaciones representativas de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones.

Aislamiento de hepatocitos regeneradores después de hepatectomía parcial en ratones

Aquí presentamos un método no genético para generar esferoides hepáticos autólogos humanos utilizando células mononucleares aisladas de sangre periférica en estado estacionario.

Esferoides hepáticos humanos de sangre periférica para estudios de enfermedad hepática

Este protocolo presenta una técnica optimizada de perfusión hepática de colagenasa en dos pasos en un modelo de rata y muestra el uso de hepatocitos aislados para el cultivo in vitro a largo plazo de organoides 3D.

Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación

Aprende a aislar hepatocitos primarios humanos y poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante mediante perfusión y gradiente de densidad. Este método optimiza la viabilidad celular para modelos hepáticos in vitro.

Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas (Video) | JoVE Journal

Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

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