Name: Los andamios compuestos de fibras interfacial Polyelectrolyte para lanzamiento Temporalmente controlada de biomoléculas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende a crear andamios poliméricos compuestos con fibras IPC para liberación controlada de biomoléculas en ingeniería de tejidos. Este método permite replicar el nicho celular con precisión espacial y temporal.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Singapur administrada por uno de sus Centros de Investigación de Excelencia, el Instituto Mecanobiología, Singapur. MFAC con el apoyo de la Agencia para la Ciencia, Tecnología e Investigación (Singapur) y la Agencia Nacional de Investigación (Francia) el programa conjunto con el número 1122703037. BKKT proyecto es apoyado por el Instituto Mecanobiología. Agradecemos al Sr. Daniel HC Wong para la prueba de lectura del manuscrito y la Sra Amanecer JH Neo para ayudar en la producción de vídeo.

1. Preparación de Soluciones Polyelectrolyte <ol><li> Purificar quitosano, como se detalla en Liao et al. Brevemente, crear un 1% (w / v) de solución de quitosano en 2% (v / v) de filtro de ácido acético y vacío usando papel de filtro de grado 93. Neutralizar el filtrado usando NaOH 5 M hasta que el pH se estabilizó a 7. Centrifugar el quitosano precipitado a 1200 xg durante 10 min. Decantar el sobrenadante y añadir agua desionizada para lavar el quitosano. Repetir la etapa de centrifugación y lavado dos veces más. Congelar el quitosano precipitado a -80 ° C y se liofiliza O / N para obtener la forma purificada. Guarde quitosano purificada en un armario deshumidificado. </li><li> Pesar 1 g de quitosano purificado en una placa de cultivo de tejido estéril. Coloque el quitosano en el cultivo de tejidos plato tan cerca como sea posible a la lámpara UV en la cabina de seguridad biológica y exponer a luz UV durante 15 min. Con unas pinzas estériles, coloque el quitosano esterilizados en un recipiente de vidrio. Disolver quitosano utilizando filtró 0.15M ácido acético a una concentración final entre 0,5% y 1% (w / v). </li><li> Pesar 0,1 g de sal sódica del ácido algínico y disolver en 10 ml agua desionizada (DDI) de agua destilada para obtener un 1% (w / v) solución. Mezclar la sal sódica del ácido algínico durante al menos 2 horas en el mezclador de vórtice para asegurar la disolución completa. Se filtra la solución de alginato a través de filtro de jeringa de 0,2 micras. Guarde la solución de alginato a 4 ° C. </li><li> Reconstituir factores recombinantes humanas de crecimiento como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o beta - factor de crecimiento nervioso (NGF), según lo recomendado por el fabricante. </li></ol> 2. Dibujo de Fibras IPC <ol><li> Mezclar proteínas, factores de crecimiento u otras biomoléculas en 10-20 l alícuota de la solución de polielectrolito que tiene una carga neta similar. Las moléculas biológicas con carga negativa (por ejemplo, albúmina de suero bovino [BSA]) net deben mezclarse con la solución de alginato. Las moléculas biológicas con carga positiva neta (por ejemplo, VEGF) se deben mezclar consolución de quitosano. </li><li> Coloque pequeñas alícuotas (10-20 mu l) de quitosano y alginato en una superficie plana y estable que está cubierta con parafilm. Las gotitas de quitosano y alginato deben ser colocados en estrecha proximidad pero no en contacto uno con el otro. </li><li> Ligeramente moje cada punta en un par de pinzas en las gotitas de quitosano y alginato. Traiga las gotitas de polielectrolitos juntos pellizcando los fórceps. Cuando las gotas entran en contacto uno con el otro, tire lentamente el fórceps verticalmente hacia arriba para extraer la fibra IPC desde la interfaz de las dos gotas (figura 1A). </li><li> Coloque con cuidado el extremo de la fibra IPC dibujado en la pinza en un colector, como un andamio polimérica plana colocada sobre un mandril giratorio (véase la sección 3 y 4). Girar el mandril a una velocidad fija de 10 mm / seg para permitir la formación de fibras uniforme y beadless IPC. El aumento de la velocidad de dibujo las fibras IPC formar perlas, lo que provocará una liberación por reventamiento de incorporadoterminación de fibra bioquímica y prematura. 10 </li><li> Para determinar la eficiencia de incorporación, recoger todos los líquidos restantes quedan en el Parafilm diluyendo con 500 l de 1X tampón fosfato salino (PBS). Mida el contenido de proteína o factor de crecimiento en el residuo a través de ensayo BCA (para BSA), ELISA (por VEGF y NGF) o un ensayo apropiado para detectar biomolécula incorporado. </li></ol> 3. Fabricación de Compuesto de hidrogel Cadalso de pululano-dextrano (PD) Polisacárido y Fibras IPC <ol><li> Fabricación marco pululano sacrificio para la recolección de fibra IPC <ol><li> Pesar polisacárido pululano y mezclar con agua desionizada destilada (DDI) agua para crear un 20% (w / v) solución acuosa. Mezclar la solución de pululano O / N para asegurar la homogeneidad. </li><li> Reparto de 15 g de solución de pululano en un 10 cm de diámetro de cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS) plato. Secar la solución de pululano O / N a 37 ° C. Cortar las películas de pululano en 7mm x 7 mm marcos cuadrados. </li></ol></li><li> Preparación de solución de polisacárido pululano-dextrano <ol><li> Crear un 30% (w / v) solución de los polisacáridos pululano y dextrano (3: 1 ratio) en agua DDI. Mezclar O / N para asegurar la homogeneidad de la solución de polisacárido. Añadir lentamente en bicarbonato de sodio a la solución de polisacárido para lograr una concentración final de 20% (w / v). Mezclar O / N para asegurar la homogeneidad de la solución. Guarde la solución de polisacárido a 4 ° C. </li></ol></li><li> Recogida de fibras IPC en marco pululano <ol><li> Fije el bastidor pululano sacrificial (sección 3.1) utilizando una pinza. Pegar la pinza de cocodrilo y el marco de pululano en el extremo del mandril giratorio con cinta adhesiva recubierta de plástico. Girar el mandril con el marco fijada a una velocidad constante de 10 mm / seg. El marco de pululano se puede fijar sobre el mandril giratorio en orientaciones deseadas. </li></ol></li><li> Dibuje las fibras IPC utilizando un par de pinzas (sección 1) y ATTACh al final elaborado de las fibras del IPC sobre el marco pululano rotativo. Dibuje las fibras IPC a una velocidad constante. Al llegar a la terminal de la fibra de IPC, secar el constructo O fibras sobre bastidor / N a temperatura ambiente. </li><li> Incorporación de fibras IPC en andamio hidrogel PD </li><li> Para reticular cada gramo de solución de pululano dextrano, añadir 100 l de 11% (w / v) de sodio trimetafosfato solución acuosa y 100 l de hidróxido de sodio 10M. 7 Mezclar la solución a 60 rpm utilizando una placa agitadora durante 1 a 2 min. Después de la adición de trimetafosfato de sodio y el hidróxido de sodio, la solución de polisacárido se reticular casi inmediatamente. Vierta la solución de polisacárido viscoso en la construcción fibras sobre bastidor para incrustar totalmente las fibras del IPC. Incubar las fibras pululano-dextrano-IPC combinados (PD-IPC) a 60 ° C durante 30 minutos para formar una andamios compuestos químicamente reticulado (Figura 1B). </li><li> PRECAUCIÓN: Siga el paso 3.3.2 en la campana de extracción y el uso de equi protección adecuadopo como ácido acético es un corrosivo e inflamable. </li><li> Para inducir la formación de poros en el andamio PD-IPC, sumergir todo el andamio en 20% (w / v) de ácido acético durante 20 min. </li><li> Retire los reactivos que no han reaccionado por lavado andamios-PD IPC en 1X PBS durante 5 min con agitación a 100 rpm. Repita este paso 2 veces. </li><li> Retire el exceso de PBS y congelar inmediatamente los andamios-PD IPC a -80 ° CO / N. Liofilizar los andamios de al menos 24 horas antes de su uso en cualquier ensayos de liberación o bioactividad controladas. </li></ol> 4. Fabricación de Andamios Compuesto de PCL y Fibras IPC PRECAUCIÓN: El diclorometano es un material peligroso. Utilice la campana de humos y equipo de protección personal al manipular diclorometano. <ol><li> Creación de sustratos PDMS prístinas y estampados <ol><li> Crear un polidimetilsiloxano prístina (PDMS) de sustrato elastomérico con un trozo de TCPS de dimensión deseada utilizando el proceso de litografía blanda. Crear pattePDMS rned sustratos mediante el uso de métodos litográficos suaves estándar en poli (metacrilato de metilo) plantillas con la topografía deseada. 12 </li></ol></li><li> La fabricación de sacrificio marco PCL para la recolección de fibra IPC <ol><li> Pesar PCL y disolver en diclorometano para crear un 0,9% (w / v) solución. Por cada 1 cm 2 área del sustrato PDMS, la caída de 500 l de solución PCL 0,9%. Permitir todo el disolvente diclorometano se evapore completamente en la campana de humos. Repetir el proceso de fundición 0,9% PCL para espesar la película hasta el grosor deseado. Retire la película PCL secado del sustrato PDMS. Crear un agujero en el marco de PCL utilizando un golpeador de dimensiones adecuadas. 2 </li></ol></li><li> El cobro de las fibras del IPC en el marco de PCL <ol><li> Fije el bastidor PCL sacrificial con el agujero (de 4.2.1) en una pinza. Pegue la pinza sobre el mandril de rotación mediante el uso de cinta adhesiva recubierta de plástico. Conecte el extremo del trazado de la fibra del IPC en el fram PCLe antes de iniciar la rotación a una velocidad constante de 10 mm / seg (sección 2). Tras el final de dibujo fibra IPC, secar la fibra sobre bastidor constructo O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Incorporación de fibra sobre bastidor construir en el sustrato PCL con dibujos <ol><li> Caída de 500 l de solución PCL 0,9% sobre el sustrato PDMS para crear una base de PCL prístina o modelado, según se requiera. Reparto de múltiples capas de solución PCL 0,9% para obtener un andamio con el espesor deseado. Permitir todo el disolvente diclorometano se evapore completamente en la campana de humos. </li><li> Coloque la construcción de fibra sobre bastidor (sección 4.3.1) en la parte superior de la base de PCL. Añadir solución PCL 0,9% en los de fibra sobre bastidor construir varias veces para obtener el espesor deseado e incrustar totalmente las fibras de la CIP, la fabricación de un armazón de material compuesto PCL-IPC (Figura 1C). </li></ol></li></ol> 5. Medición de la liberación de agentes biológicos del compuesto IPC Andamios <ol><li> Coloque compuesta PD-IPC oAndamios PCL-IPC y autónomos fibras IPC por separado en una placa de 24 pocillos. </li><li> Sumerja el andamio y autónomos fibras IPC con 500 l de PBS 1X. Incubar las muestras a 37 ° C. Recoger PBS en diversos puntos temporales (medios de liberación) y reemplazar con 500 l de PBS 1X. </li><li> Medir la cantidad de proteína o factor de crecimiento en los medios de liberación usando un ensayo de BCA (BSA), ELISA (VEGF y NGF) u otro ensayo apropiado para calcular el perfil de liberación acumulativo para la biomolécula incorporado. </li></ol> 6. La siembra de células en compuestos Andamios IPC para probar bioactividad de Agentes Biológicos Liberadas <ol><li> Esterilizar los andamios compuestos liofilizados PD-IPC o PCL-IPC utilizando luz UV en la cabina de seguridad biológica durante al menos 20 min. </li><li> Usar técnicas de cultivo celular estándar para obtener una suspensión celular de 2 x 10 5 células en medios de crecimiento 200 l. Semillas de la suspensión celular concentrada en los andamios compuestos. After 20 min, recarga el volumen de medio de cultivo para sumergir totalmente los andamios. </li><li> Medir la actividad celular a través de técnicas estándar, tales como ensayo de actividad de Alamar azul metabólica, ensayo de crecimiento de neuritas PC12 o inmunofluorescencia. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

IPC fibras se forman por la interacción de dos polielectrolitos con cargas opuestas. El proceso utiliza la extracción del complejo desde la interfaz de los polielectrolitos, facilitando un proceso de autoensamblaje para la formación de fibras estable. El mecanismo de formación de la fibra IPC asegura que cualquier biomolécula añadió en un polielectrolito cargado de manera similar se puede incorporar durante el proceso de complejación. 10,11 A la inversa, la adición de una biomolécula en el polielectrolito de ...

La matriz extracelular tiene señales bioquímicas y biofísicas inherentes que dirigen los comportamientos celulares. La imitación de este microentorno fisiológico tridimensional (3D) es una estrategia ampliamente explorada para aplicaciones de medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. Por ejemplo, tanto los sustratos de origen natural como los sintéticos se han modificado con señales topográficas como medio para imitar el entorno celular biofísico. 1 Por ejemplo, los andamios de policaprolactona (PCL) se pueden modelar fácilmente mediante la fundición sobre sustratos de PDMS estampados. 2 Sin embargo, la mayoría de los andamios sintéticos recapitulan inadecuadamente el entorno bioquímico controlado in vivo. La modificación masiva o superficial de los materiales sintéticos solo presenta señales bioquímicas para la unión celular, pero aún carece de regulación temporal de la entrega bioquímica. 3 Por lo tanto, existe la necesidad de andamios óptimos que puedan imitar el sistema de entrega bioquímica regulado temporalmente de la matriz extracelular. 
Los sistemas de administración bioquímica, como las microesferas, están plagados de problemas de pérdida de bioactividad y baja eficiencia de incorporación debido a la gravedad y complejidad del proceso de síntesis de varios pasos. 4-6 Se demostró que los métodos alternativos que utilizan un método de fabricación e incorporación en un solo paso tienen un excelente potencial para crear un microambiente bioquímico favorable sin la ineficiencia concomitante en la incorporación y pérdida de bioactividad. Una solución viable es el uso de fibras de complejación de polielectrolitos interfaciales (IPC) para administrar y proteger agentes biológicos. Cuando se juntan dos soluciones acuosas de polielectrolito con carga opuesta, las fibras IPC se pueden extraer de la interfaz. Prácticamente cualquier tipo de biomolécula hidrofílica en solución acuosa se puede agregar a la solución de polielectrolito cargada negativa o positivamente, lo que facilita la incorporación de biomoléculas útiles en la fibra IPC durante el proceso de complejación. Además, este proceso solo requiere condiciones acuosas y ambientales, lo que disminuye el riesgo de pérdida de bioactividad. Con este método, se han administrado con éxito factores de crecimiento activos2,7 incluso células8,9. Además, el método simple de formación de fibras IPC permite moldear en cualquier forma u orientación. La estabilidad de dichas fibras ha sido ventajosa en su incorporación tanto en polímeros hidrófobos2 como hidrofílicos7 para crear andamios compuestos. Estos andamios compuestos con fibras IPC son beneficiosos para crear un entorno bioquímico fisiológicamente relevante, al tiempo que proporcionan un anclaje físico para las células. 
En este estudio, mostramos un método para incorporar fibras de IPC en un andamio hidrófilo e hidrofóbico con topografía para la liberación controlada de biomoléculas activas. Como prueba de concepto, incorporamos fibras de IPC fabricadas a partir de quitosano y alginato en el hidrogel hidrofílico de pululano-dextrano biocompatible, no inmunogénico y no antigénico o en el andamio hidrofóbico de policaprolactona biocompatible.

<table><tbody><tr><td>Pululano&nbsp;</td><td>Hayashibara Inc, Okayama, Japón</td><td></td><td>: Peso molecular (MW): 200 kDa. Este material es pululano de grado farmacéutico que se utiliza para fabricar marcos de pululano y andamios PD-IPC.</td></tr><tr><td>Dextrano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1037</td><td>MW 500 kDa. Este material ya no es producido por Sigma Aldrich. La alternativa sugerida es el número de catálogo 31392 (Sigma Aldrich). Este material se utiliza para fabricar andamios PD-IPC.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>El bicarbonato de sodio debe añadirse lentamente a la solución de polisacárido pululano-dextrano. La adición rápida de bicarbonato de sodio dará lugar a la precipitación.</td></tr><tr><td>Trimetafosfato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5508</td><td>Este producto químico es higroscópico y debe almacenarse en el gabinete de deshumidificación. La solución acuosa de trimetafosfato de sodio siempre debe prepararse fresca.</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Este material es peligroso y debe manipularse con el equipo de protección adecuado, como guantes de nitrilo.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448877</td><td>MW 190-310 kDa. Grado de acetilación del 75% al 85%. La purificación del quitosano es necesaria para crear fibras IPC estables.</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck</td><td></td><td>Puede ser reemplazado por otro tipo de marca. Este material es corrosivo e inflamable. Se debe usar equipo de protección como protector facial, guantes de nitrilo, bata de laboratorio y cubierta de zapatos cuando se manipule este producto químico en la campana extractora.</td></tr><tr><td>Ácido algínico sal sódica de algas pardas, baja viscosidad</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2158</td><td>Disolver en agua durante la noche. Filtrar a través de estéril 0.2&nbsp; y micro; m filtro de jeringa antes de usar. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td> Reactivo <td></td><td>químico Sinopharm</td><td>Disolver en PBS estéril y filtrar usando 0.2 y micro; m Filtro de jeringa antes de usar.&nbsp;</td></tr><tr><td>kit de ensayo BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Este kit se utilizó para medir la liberación de BSA de andamios PD-IPC.</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento endotelial vascular recombinante humano</td><td>R& D systems</td><td>293-VE</td><td>Disuelva el factor de crecimiento en una solución de heparina al 0,2% hasta una concentración final de 5&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Sal de Heparina Sódica de Porcino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Esto puede ser reemplazado por otro tipo de marca. Disolver la sal de heparina en agua estéril a una concentración final del 1% y filtrar a través de 0,2 &micro; m Filtro de jeringa antes de usar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>Este tipo de célula primaria se utilizó en el ensayo para determinar la bioactividad del VEGF después de la liberación de los andamios PD-IPC.</td></tr><tr><td>Alamar azul</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>Se utiliza para medir la actividad metabólica de las células. Incubar el azul de Alamar con células y mantener en condiciones estándar de cultivo celular durante 2 a 4 horas. Mida la absorbancia a 570 nm para determinar la reducción porcentual del azul de Alamar, que se correlaciona con la actividad de la célula.</td></tr><tr><td>Liofilizador ScanVac Coolsafe</td><td>Labogene</td><td>7.001.200.060</td><td>Este es un liofilizador no programable que funciona a -105 a -110 &nbsp; &deg;C. Esto puede ser reemplazado por otros liofilizadores de laboratorio estándar.</td></tr><tr><td>Policaprolactona (PCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181609</td><td>MW 65 kDa. Sigma Aldrich ya no lo fabrica. Esto puede ser reemplazado por el número de catálogo Sigma Aldrich 704105.</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich V800151</td><td></td><td>Puede ser reemplazado por otro tipo de marca. Este material es peligroso y debe manipularse en la campana extractora. Se debe usar equipo de protección en todo momento cuando se manipule este producto químico.</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS; 184 Kit de elastómero de silicona)</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>El kit de elastómero viene con base de polímero y reticulante. La mezcla de la base de polímero y el reticulante en diferentes proporciones dará como resultado una rigidez diferente del PDMS.</td></tr><tr><td>Factor de Crecimiento Beta-Nervioso Recombinante Humano (NGF)</td><td>R& Sistemas D</td><td>256-GF</td><td>Reconstituido en agua desionizada estéril hasta una concentración final de 100&nbsp; y micro; g&#8288;/&#8288;ml. Alícuota y almacenamiento en -20 &deg; C hasta su uso.</td></tr><tr><td>Células madre mesenquimales humanas (hMSC)</td><td>Cambrex</td><td></td><td>Este tipo de célula se utilizó en el ensayo para determinar el efecto sinérgico del NGF y la nanotopografía.</td></tr><tr><td>Células de feocromocitoma PC12 de rata&nbsp;</td><td>ATCC</td><td></td><td>Este tipo de célula se utilizó en el ensayo de excrecimiento de neuritas para determinar la bioactividad del NGF. Después de la exposición a los medios de liberación con NGF, mida el número de células con extensiones de neuritas y normalice al número total de células.</td></tr><tr><td>Papel de filtro de grado 93</td><td>Whatman</td><td>Z699675</td><td>Se utiliza para la purificación del quitosano después de su precipitación con hidróxido de sodio a pH 7.</td></tr><tr><td>Centrífuga de cuchara oscilante</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Para ser utilizada durante la purificación de quitosano con una velocidad de 1.200 x g.</td></tr><tr><td>Motor con mandril que gira a velocidad constante</td><td>Rhymebus</td><td>RM5E</td><td>El motor se utiliza para la fabricación de fibras IPC en bastidor pululano o PCL.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>FirstBase</td><td></td><td>Sterilize a través de filtración (0.2 y micro; M) y autoclave.</td></tr><tr><td>Placa de poliestireno para cultivo de tejidos de 10 mm de diámetro (TCPS)</td><td>Greiner</td><td></td><td>La placa TCPS se utiliza para la fundición de marcos de pululano.</td></tr><tr><td>Kit ELISA VEGF humano</td><td>R& D systems</td><td>DVE00</td><td>El kit ELISA se utiliza para la detección de VEGF en el medio de liberación.</td></tr><tr><td>Kit ELISA NGF humano</td><td>R& D systems</td><td>DY256</td><td>El kit ELISA se utiliza para la detección de NGF en el medio de liberación.</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva recubierta de plástico</td><td>Bel-Art 9040336</td><td></td><td>La cinta adhesiva se utiliza para pegar de forma segura la pinza de cocodrilo al mandril giratorio</td></tr></tbody></table>

los andamios compuestos de fibras interfacial polyelectrolyte para lanzamiento temporalmente controlada de biomoléculas

Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules

Varios andamios utilizados en la ingeniería de tejidos requieren un entorno bioquímico controlado para imitar el nicho celular fisiológico. Las fibras de complejación de polielectrolitos interfaciales (IPC) se pueden utilizar para la administración controlada de diversos agentes biológicos, como fármacos de moléculas pequeñas, células, proteínas y factores de crecimiento. La simplicidad de la metodología en la fabricación de fibras IPC brinda flexibilidad en su aplicación para la entrega controlada de biomoléculas. Aquí, describimos un método para incorporar fibras de IPC en dos andamios poliméricos diferentes, polisacárido hidrofílico y policaprolactona hidrofóbica, para crear un andamio compuesto multicomponente. Demostramos que las fibras de IPC pueden incrustarse fácilmente en estas estructuras poliméricas, lo que mejora la capacidad de liberación sostenida y mejora la conservación de las biomoléculas. También creamos un andamio polimérico compuesto con señales topográficas y liberación bioquímica sostenida que puede tener efectos sinérgicos en el comportamiento celular. Los andamios poliméricos compuestos con fibras IPC representan un método novedoso y sencillo para recrear el nicho celular.

En este artículo, hemos tratado de crear los andamios compuestos con fibras de IPC para la liberación sostenida de diversas biomoléculas. Características de las biomoléculas utilizados en este estudio se encuentran en la Tabla 1. IPC fibras se incrustaron primero en un hidrogel hidrófilo PD para crear un armazón de material compuesto PD-IPC (Figura 1B). Molécula Modelo BSA fue probado primero para determinar la viabilidad de utilizar un armazón de material compuesto para la liberación c...

Los andamios para la ingeniería de tejidos necesitan recapitular el complejo microambiente bioquímico y biofísico del nicho celular. Aquí, mostramos el uso de fibras de complejación de polielectrolitos interfaciales como plataforma para crear andamios poliméricos compuestos de múltiples componentes con liberación bioquímica sostenida.

Los andamios compuestos de fibras interfacial Polyelectrolyte para lanzamiento Temporalmente controlada de biomoléculas

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una liberación controlada de biomoléculas con control espacial para imitar el nicho celular a partir de andamios compuestos poliméricos hidrofílicos o hidrofóbicos. Esto se logra primero creando un marco sacrificial de polímeros deseados para proporcionar la disposición espacial de las fibras liberadoras de biomoléculas denominadas polielectrolitos interfaciales, o fibras IPC. El segundo paso consiste en incorporar fibras IPC que contienen la biomolécula hidrofílica objetivo en un marco sacrificial.A continuación, las fibras de CIP sobre estructuras con marco se incorporan a un andamio más grande utilizando un sustrato con microdiseño como molde de colado, integrando señales topográficas en el sustrato. El último paso consiste en permitir la completa asimilación de las fibras en el marco, el ensamblaje y la solidificación de los polímeros para crear sustratos sin patrón o con microdiseño. En última instancia, se pueden utilizar ensayos convencionales para demostrar los perfiles de liberación y la bioactividad de las moléculas diana.La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes, como la microencapsulación, es que ahora es posible incorporar biomoléculas hidrofílicas en una amplia variedad de andamiajes poliméricos hidrofílicos o hidrofóbicos mediante un proceso sencillo de incorporación y fabricación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la administración de fármacos, incluyendo la liberación regulada múltiple de gradientes bioquímicos y el efecto sinérgico de las señales topográficas y la liberación sostenida de sustancias bioquímicas sobre el comportamiento celular. La demostración visual de la formación de fibras de polielectrolito es fundamental, ya que los pasos son difíciles de aprender.La velocidad de concentración y la pureza de la solución de polielectrolito son factores cruciales para la formación estable de fibras de IPC. Para comenzar, mezcle proteínas, factores de crecimiento u otras biomoléculas de interés en alícuotas de 10 a 20 microlitros de las soluciones de polielectrolito, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, coloque pequeñas gotas de 10 a 20 microlitros de quitosano y alginato sobre una superficie plana y estable recubierta con paraform. Las gotas de quitosano y alginato deben colocarse en proximidad cercana, pero sin estar en contacto entre sí.Sumerja ligeramente una punta de un par de pinzas en la gota de arena de kites y la otra punta en la gota de alginato. Luego, acerque las gotas de polielectrolitos presionando las pinzas. Cuando las gotas entren en contacto entre sí, tire lentamente de las pinzas en dirección vertical para extraer la fibra formada por la complejación interfacial de polielectrolitos, conocida como fibra IPC, desde la interfase de las dos gotas.Coloque cuidadosamente el extremo de la fibra IPC extrudida sobre un colector que consista en un andamio polimérico plano fijado en un mandril giratorio. Gire el mandril a una velocidad constante de 10 milímetros por segundo para permitir la formación de fibras IPC uniformes y sin gotas. Aumentar la velocidad de extrusión de las fibras IPC formará gotas, lo que provocará una liberación súbita de los componentes bioquímicos incorporados y una terminación prematura de la fibra.De acuerdo con la observación de Liao et al. y KO et al., cuando la fibra finaliza, diluya el líquido restante con 500 microlitros de PBS y mida la concentración de proteína o contenido de factor de crecimiento restante en el residuo. Para determinar la eficiencia de incorporación de las biomoléculas, pese tres gramos de polisacárido de Polonia y añádalos a 15 mililitros de agua destilada desionizada.Para crear una solución acuosa al 20 %, mezcle la solución Poland durante la noche para asegurar la homogeneidad al día siguiente. Vierta 15 mililitros de la solución Poland en un recipiente de poliestireno para cultivo de tejidos de 10 centímetros de diámetro. Seque la solución durante la noche a 37 grados Celsius; una vez seca, corte las películas en marcos cuadrados sacrificiales de siete milímetros por siete milímetros de la solución Poland.A continuación, prepare una solución al 30 % de los polisacáridos Poland y dextrina en agua destilada desionizada en una proporción de tres a uno. Mezcle durante la noche para asegurar la homogeneidad; agregue lentamente bicarbonato de sodio a la solución de polisacáridos para obtener una concentración final del 20 %. Mezcle la solución durante la noche y almacene la solución final de polisacáridos a cuatro grados Celsius hasta que sea necesaria. Fije el marco de sacrificio de Poland en la orientación deseada al mandril giratorio utilizando una pinza tipo cocodrilo y cinta adhesiva revestida de plástico.Gire el mandril con el marco fijado a una velocidad constante de 10 milímetros por segundo. Luego, comience a extraer las fibras IPC como se mostró en la sección anterior. Sin embargo, esta vez, fije el extremo extraído de las fibras IPC al marco giratorio de Polonia.Esperar el final del estirado de la fibra IPC posteriormente. Secar las fibras sobre el marco construido durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, liberar el montaje del mandril giratorio retirándolo del clip de cocodrilo.Coloque el constructo en la tapa de un tubo de microcentrífuga. Luego, coloque cinco gramos de la solución de dextrina de Polonia en un vaso de precipitados e inicie la agitación a 60 RPM. Utilizando una placa agitadora, agregue 500 microlitros de una solución al 11% de fosfato de trimetosodio y 500 microlitros de hidróxido de sodio 10 molar.Para entrecruzar la solución. Continúe mezclando la solución durante uno a dos minutos y luego vierta la solución viscosa de polisacárido sobre las fibras del armazón para integrar completamente las fibras de IPC. Incube el armazón a 60 grados Celsius durante 30 minutos para formar un andamio compuesto químicamente entrecruzado e inducir la formación de poros en el andamio compuesto.Sumerja todo el andamio en una solución de ácido acético al 20 % durante 20 minutos. Luego, lave el andamio tres veces con PBS durante cinco minutos agitando a 100 RPM. Para eliminar cualquier reactivo no reaccionado restante, retire el exceso de PBS y congele inmediatamente los andamios compuestos a menos 80 grados Celsius durante la noche.A continuación, liofilice los andamios durante al menos 24 horas antes de utilizarlos en cualquier ensayo de liberación controlada o de bioactividad. Comience creando un sustrato de PDMS prístino y estructurado con una topografía deseada utilizando métodos estándar de litografía suave. A continuación, prepare tanto el marco sacrificial de PCL para la recolección de fibras IPC como la base de PCL estructurada, disolviendo primero 0,9 %PCL en diclorometano.Por cada área de un centímetro cuadrado del molde de colada de la película de PDMS, coloque 500 microlitros de la solución de PCL al 0,9 % sobre el molde. Deje que el disolvente evapore completamente en la campana extractora y luego repita el proceso de colado del PCL al 0,9 % para aumentar el grosor de la película. A continuación, prepare el marco sacrificial colocando 500 microlitros a la vez de la solución de PCL al 0,9 % sobre un sustrato de PDMS prístino separado.Para crear una base de PCL impecable, vierta varias capas de PCL para obtener un andamio con el grosor deseado. Permita que todo el disolvente de clorometano se evapore completamente en la campana extractora una vez alcanzado el grosor deseado. Retire la película seca de PCL del sustrato de PDMS impecable y haga un orificio en el marco de PCL utilizando un punzón del tamaño PSAP.A continuación, monte el marco de PCL en el mandril de recolección y comience a enrollar la fibra IPC sobre el marco como se describió previamente. Cuando finalice el enrollado de la fibra IPC, retire el conjunto de fibra sobre el marco y déjelo secar durante la noche a 25 grados Celsius. Coloque el conjunto de fibra sobre el marco encima de la base de PCL patroneada y añada la solución de PCL al 0,9 % sobre el conjunto de fibra sobre el marco varias veces para obtener el espesor deseado y asegurar que las fibras IPC queden completamente embebidas.La albúmina sérica bovina o BSA liberada del compuesto de dextrina de Polonia IPD mostró una cinética casi lineal con una liberación inicial en ráfaga atenuada seguida de un estado estacionario simultáneo. Después de dos meses, la BSA alcanzó una liberación total del 97 %. En contraste, las fibras IPC independientes exhibieron una liberación rápida del 80 % de la BSA en cuatro horas. Utilizando este mismo compuesto, también se logró liberar de forma sostenible un factor de crecimiento vascular a partir de las fibras, empleando células endoteliales de vena umbilical humana como plataforma de prueba.Se descubrió que el factor de crecimiento liberado era bioactivo tras su liberación en cada punto temporal. En este ejemplo, el factor de crecimiento nervioso se cargó en las fibras durante un período de 18 días. Aproximadamente el 80 % del factor de crecimiento nervioso cargado se liberó del compuesto P-C-L-I-P-C mediante una liberación sostenida y lineal, evaluado mediante un ensayo de crecimiento de neuritas PC12.La cantidad de factor de crecimiento nervioso bioactivo liberada desde el andamiaje hacia el medio en cada punto temporal tuvo un efecto similar sobre el crecimiento de neuritas a la adición de 30 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento nervioso al medio simple. Los andamiajes compuestos P-C-L-I-P-C que contienen tanto topografía como liberación controlada de factor de crecimiento nervioso podrían tener un efecto sinérgico sobre el comportamiento celular. Las células madre mesenquimatosas humanas cultivadas sobre andamiajes compuestos con nanoestructuras mostraron un mayor nivel de diferenciación neuronal en comparación con las células expuestas únicamente a topografía o a factor de crecimiento por separado.Al intentar este procedimiento, es importante recordar mezclar la molécula hidrofílica deseada en la solución de polielectrolito con la misma carga neta para incorporarla en las fibras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear un andamio polimérico compuesto con la capacidad de liberación controlada de moléculas. La gran ventaja mostrada en este video le permitirá crear un andamio pulmonar con la capacidad de liberación sostenida de factores de crecimiento, liberación de múltiples factores de crecimiento y la creación de un gradiente de señales bioquímicas que recapitule el nicho fisiológico.No olvide que trabajar con ácido acético, hidróxido de sodio y cloruro de metilo puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal y la campana extractora al realizar este procedimiento.

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