Interfaz culturas 3D Engineered neuronales a micro-electrodos matrices: un innovador In Vitro Modelo Experimental

El objetivo general de este procedimiento es presentar un modelo novedoso de redes neuronales tridimensionales in vitro acopladas a matrices de microelectrodos. Esto se logra primero acondicionamiento, la parte central del MEA con una solución mixta de poli de lisina y laminina, luego recubre las microperlas con proteínas de adhesión, laminina y polilisina. El segundo paso es distribuir la suspensión de las microperlas tratadas en una placa de pocillos múltiples donde se autoensamblarán y formarán una capa uniforme.

El tercer paso del procedimiento es colocar las células en el área activa del MEA a una densidad de 2000 células por milímetro cuadrado para crear redes neuronales 2D. De seis a ocho horas después del enchapado, la suspensión se transfiere de las placas de pocillos múltiples al MEA y se permite que las microperlas se autoensamblen en una estructura compacta hexagonal. En última instancia, la microscopía confocal se utiliza para visualizar las redes 3D, que se comparan con las redes neuronales 2D convencionales cultivadas sobre MEA.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los cultivos celulares dimensionales BDI in vitro, es que en un modelo dimensional BDI, los conos somata y de crecimiento se aplanan, el andón y el ascenso no pueden extenderse en todas las direcciones. Además, la actividad de estallido domina la dinámica electrofisiológica de las redes dimensionales BDI, mientras que en una tridimensional también coexiste una actividad de moteado aleatorio. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando leímos el trabajo de investigación de Sophie Potto publicado en Nature Method en 2008, en el que utilizaba MICROBITS como andamio para construir redes tridimensionales de ne.

Luego adaptamos este método a mí para hacer las primeras grabaciones in vitro tridimensionales. Para preparar el elastómero PDMS, mezcle el agente de curado y un polímero en una proporción de volumen de uno a nueve en una placa de Petri. A continuación, agite la mezcla y colóquela en la cámara de vacío durante 10 minutos para eliminar las burbujas de aire.

Para construir la restricción PDMS, inserte el material PDMS en el moldeador más viejo después de eso, colóquelo en el horno durante 30 minutos a 120 grados Celsius. La restricción PDMS debe tener la forma de un cilindro con un diámetro externo e interno de 22,0 y 3,0 milímetros respectivamente, y una altura de 650 micrómetros el día antes del enchapado. Acople la mascarilla al área activa del MEA bajo un microscopio estereoscópico, luego esterilice la mascarilla PDMS en el horno a 120 grados Celsius.

A continuación, esterilice las microperlas de vidrio en un vial cónico de etanol al 70% durante dos horas, rotando cada 30 minutos para exponer todas las microperlas después. Retire la solución de etanol del vial y enjuague las microperlas dos veces con agua esterilizada. A continuación, acondicionar la parte central de la zona MEA delimitada por la mascarilla PDMS con 24 microlitros de solución mixta de polilisina y laminina a 0,05 microgramos por mililitro.

Cubra las microperlas con proteínas de adhesión, laminado y polilisina a 0,05 microgramos por mililitro. Posteriormente, colócalos en la incubadora durante la noche a 37 grados centígrados para obtener una red neuronal estable y duradera. A continuación, distribuya la suspensión de las microesferas tratadas en la placa de pocillos múltiples con un inserto de membrana donde se autoensamblarán y formarán una capa uniforme.

A continuación, llene cada pocillo de la membrana con 0,5 mililitros de medio. Póngalo en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que las neuronas estén listas para ser plateadas en este paso. Después de sacrificar una rata hembra E 18 preñada, obtenga los embriones de rata, luego retire el hipopótamo campi de cada embrión de rata.

Colócalos en madejas heladas. Equilibra la solución salina sin calcio ni magnesio. A continuación, disocie el tejido en una solución de Hanks al 0,125% que contenga un 0,05% de ADN durante 18 a 20 minutos a 37 grados centígrados.

Después de eso, retire el sobrenadante con una pipeta peor. Detenga la digestión enzimática agregando medio con 10% FBS durante cinco minutos. Luego retire el medio con FBS y lave una vez con el medio de crecimiento, su suplemento 1%L-glutamina y Gentamicina a 10 microgramos por mililitro.

Posteriormente, retire el medio. Rellénalo de nuevo con 500 microlitros de crecimiento. Medio. Su suplemento 1%L-glutamina y Gentamicina a 10 microgramos por mililitro.

Disocie el gránulo de tejido mecánicamente con una pipeta de PE estrecha hasta que se haga evidente una suspensión lechosa de células. Después de eso, diluya un pequeño volumen de suspensión celular con el medio de crecimiento para obtener un volumen final de 2.0 mililitros. Cuente la concentración celular obtenida con la cámara del hemocitómetro.

A continuación, diluya esta concentración en una proporción de uno a cinco para obtener la concentración celular deseada de 600 a 700 células por microlitro. Coloque las células a una densidad de 2000 células por milímetro cuadrado en el área activa de la MEA definida por la restricción PDMS para crear una red neuronal 2D. A continuación, coloque el dispositivo MEA en la incubadora con una atmósfera de dióxido de carbono humidificada al 5% a 37 grados centígrados.

Para completar el paso preliminar para la construcción del cultivo 3D, distribuya 160 microlitros de la suspensión con una concentración de celdas de 600 a 700 celdas por microlitro sobre la superficie de la monocapa de microperlas colocada dentro de las placas de pocillos múltiples. A continuación, coloque las placas de pocillos múltiples en la incubadora con una atmósfera de dióxido de carbono humidificado al 5% a 37 grados centígrados, seis a ocho horas después de la colocación transfiera de 30 a 40 microlitros de la suspensión con microperlas y neuronas a la zona del MEA delimitada por la restricción del PDMS. Después de cada transferencia, espere aproximadamente medio minuto para permitir que las microperlas se autoensamblen en una estructura hexagonal.

Una vez depositadas todas las capas y ensambladas espontáneamente a 300 microlitros de medio en la parte superior del área delimitada por la restricción PDMS. Coloque la estructura 3D acoplada al MEA en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Después de eso, agregue un mililitro de medio de crecimiento con su suplemento después de tres semanas in vitro, la estructura 3D es estable también sin la restricción PDMS mostrada.

Aquí hay una imagen DIC de una sola capa de cuentas acopladas a la superficie MEA. La posición de los puntos negros representa la disposición espacial de los electrodos. La tinción inmunofluorescente para el mapa dos, que se refleja en la señal roja, muestra la distribución de la arborización dendrítica y ADA de las neuronas alrededor de las microperlas acopladas directamente al plano de electrodos del MEA.

Esta imagen muestra la proyección máxima de una secuencia de Zack de un cultivo 3D que muestra una red altamente interconectada donde las neuronas se marcan para el nuevo N expresado en neuronas postmitóticas maduras. Y para gaba, aquí está el registro electrofisiológico representativo de las redes del hipocampo en configuración 3D. Y aquí está el registro electrofisiológico representativo de las redes del hipocampo en configuración 2D.

Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en siete horas. Sin embargo, vale la pena notar que, dado que el procedimiento tiene varios pasos que se han realizado durante diferentes días, la estimación del tiempo para realizar todo el procedimiento es simplemente una indicación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que primero se debe colocar una capa 2D de diurético neuronal en el electrodo de la mea, y luego transferir con mucho cuidado la suspensión de microbits y neuronas de la placa de pocillos múltiples a la mea para realizar la estructura 3D después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia computacional exploraran cómo la conectividad de red puede dar forma a la dinámica de red emergente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir una red neuronal tridimensional in vitro acoplada a matrices de microelectrodos.