Name: 3D hidrogel andamios para articular condrocitos cultura y cartílago Generación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Aprende a expandir condrocitos articulares humanos y generar cartílago usando hidrogeles biomiméticos 3D. Este método permite estudiar la fisiología celular y evaluar potencial regenerativo en ingeniería tisular.

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Los autores desean agradecer al Departamento de Cirugía Ortopédica de Stanford y a la Beca Semilla Traslacional de Stanford Coulter por su financiación. J.H.L. desea agradecer a la Beca de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias y a la Beca de Doctorado DARE por su apoyo.

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de los sujetos de Stanford Universidad Humanos y aprobados protocolo Junta de Revisión Institucional. 1. Articular condrocitos aislamiento <ol><li> Obtener cartílago de tejidos descartados durante la artroplastia total de rodilla y diseccionar lo descrito previamente 8. </li><li> Visualmente seleccionar los cóndilos femorales medial o lateral de muestras de cartílago para superficies lisas y hacer la incisión en la superficie del cartílago a través de un escalpelo para eliminar 4-5 mm biopsias de cartílago sin afectar el hueso subcondral. </li><li> Aislar los condrocitos de la matriz extracelular por la disociación enzimática del tejido con tratamiento O / N con colagenasa purificada. Use 1: 1 relación de la colagenasa II (125 U / ml) y la colagenasa IV (160 U / ml) en medio de crecimiento de condrocitos a 37 ° C. </li><li> El día siguiente, filtra el tejido digerido que contiene las células disociadas a través de una 70mm poro tamaño de malla de nylon. De lavado dos veces con 20 ml de DMEM / F12 y centrifugar a 600 xg durante 5 min. </li><li> Placa de los condrocitos aislados a una densidad de 1 x 10 6 células / 60 mm placa de cultivo después de re-suspensión en DMEM / F12 suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 25 mg / ml de ascorbato, 2 mM L-glutamina, antimicrobianos (100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,25 mg / ml de Fungizone). Mantener las placas a 37 ° C y mantener los cultivos de condrocitos primarios como una monocapa de alta densidad antes de la encapsulación en hidrogeles biomiméticos. </li></ol> 2. Biomimetic hidrogel Fabrication NOTA: Este método permite la síntesis de un hidrogel biomimético que contiene poli (etilenglicol diacrilato) (PEGDA, MW 5.000 g / mol), sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA) en DPBS. La adición de fotoiniciador permite reticulación fotoactivado. La composición de hidrogel final contiene 7% de pesajet / volumen (w / v) de PEGDA, 3% w / v de CS-MA, y 0,05% w / v de fotoiniciador. <ol><li> Sintetizar CS-MA por la funcionalización del polímero con grupos metacrilato CS. <ol><li> Preparar la solución tamponada de 50 mM de ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) y cloruro de 0,5 M de sodio (NaCl) disolviendo 1,952 g de MES y 5,84 g de NaCl en 200 ml de agua desionizada (DiH 2 O). Disolver 5 g de sal sódica de sulfato de condroitina en la solución tamponada. </li><li> Añadir 0,532 g (4,62 mmol) de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 1,771 g (9,24 mmol) de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) (relación molar de NHS: EDC = 1: 2) para la solución y se agita durante 5 min. </li><li> Añadir 0,765 g (4,62 mmol) de metacrilato de 2-aminoetilo (AEMA) (relación molar de NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) a la solución y mantener la reacción a TA durante 24 h. </li><li> Se purifica la mezcla mediante diálisis frente a agua desionizada (DIH 2 O) durante 4 días utilizando un tubo de diálisis (12-14 kDa MWCO). </li><li> Se filtra la purified solución a través de un filtro de 0,22 micras y colocar los tubos abiertos que contienen la solución en el desecador de vacío y O / N. Asegúrese de que todos los tubos están protegidos de la luz. Guarde el polímero disuelto a -20 ° C protegido de la luz y la humedad. </li></ol></li></ol> 3. La encapsulación de la célula <ol><li> Autoclave las películas y cilíndricos varillas de PCR (para la perforación de los hidrogeles 3D de células con carga) y esterilizar el molde de gel cilíndrica medida por inmersión en 0,2 micras filtrada etanol al 70% en el tejido campana de cultivo bajo luz UV. </li><li> Sellar el fondo del molde con la película de gel PCR en autoclave sin burbujas o huecos para evitar fugas de aire. Guárdelo en una placa estéril 150 mm. </li><li> El día antes de la encapsulación de células en hidrogel biomimético, disociar la monocapa de condrocitos de alta densidad con O / N en el tratamiento de colagenasa II y solución de colagenasa IV. Utilice 125 U / ml para la colagenasa II y 160 U / ml para la colagenasa VI en el crecimiento de condrocitos cada mediosa 37 ° C. </li><li> Tomar un tubo de 50 ml y añadir 5% en peso / volumen (w / v) (diacrilato de etilenglicol) poli (PEGDA, MW = 5000 g / mol), 3% w / v sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA), y 0,05% w / v fotoiniciador en DPBS. Vortex el tubo para mezclar la solución y mantener a un lado. Proteja el tubo de la luz. </li><li> Recoger las células disociadas en un tubo Falcon 50 ml, contar y centrifugar a 460 xg durante 5 min. Aspirar todos los medios de comunicación desde el tubo de células y añadir el material de gel mixto anterior a las células volver a suspender a una densidad de 15 × 10 6 células / ml. Mezclar 30 veces a fondo y evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> Pipeta 72 l de la suspensión de células de hidrogel o hidrogel solos en el molde de gel cilíndrica a medida e inducir la gelificación través de la exposición a la luz UV (365 nm de longitud de onda) a 3 mW / m 2 durante 5 min. Prepara un poco de solución de hidrogel sin contenido celular. Utilice estas construcciones como controles negativos para el futuro pruebas bioquímicas y mecánicas. Measure la intensidad de la luz UV con un medidor de intensidad de los rayos UV. Para ajustar la intensidad, cambiar la distancia entre la fuente de luz UV y el andamio de hidrogel durante la gelificación. NOTA: Dado que el hidrogel contiene CS, la contribución acelular se resta del contenido de GAG ​​bioquímica de los hidrogeles de células cargado para representar sólo el GAG celular. </li><li> Utilice un bisturí para cortar la película para fácil de despegar y retire con cuidado. Con la ayuda de las varillas cilíndricas, empujar hacia fuera el gel en una placa de 6 pocillos con 5 ml de DPBS estériles para lavar gel no polimerizado y las células sueltas. </li><li> Cultura los hidrogeles cargados de células en placas de 24 pocillos que contenían 1,5 ml de medio de crecimiento de condrocitos en cada pocillo. Use una espátula desechable para transferir los hidrogeles lavadas en el pozo. </li><li> Evaluar la viabilidad celular por muertos viven tinción 24 horas después de la encapsulación utilizando un kit de viabilidad / citotoxicidad. Cultura de los hidrogeles de células cargadas y los hidrogeles vacíos para 3-6 semanas cambiantes de gro condrocitos frescaswth medios cada 2 días antes de la cosecha para los análisis. </li></ol> 4. RNA de extracción y análisis de expresión de genes <ol><li> Aspirar con cuidado los medios de comunicación y poner estéril PBS 1X en el teléfono cargado, así como los hidrogeles de control vacías. </li><li> Con la ayuda de una espátula estéril, transferir cada hidrogel a un tubo Eppendorf de 1,5 ml limpio y añadir 250 l de Tri-reactivo a cada tubo. Siga las instrucciones del fabricante para aislar ARN. </li><li> Después de aislamiento de ARN y cuantificación uso 1 g de la misma de cada muestra y realizar una transcripción inversa en ADNc utilizando la alta capacidad de cDNA Transcription Kit inversa. </li><li> Para la PCR cuantitativa TaqMan Arrays utilizar Expresión Génica para el examen de la expresión de los genes de interés. Normalizar los niveles de expresión génica internamente para GAPDH. </li><li> Para las condiciones de PCR incluir una incubación de 2 min a 50 ° C para inactivar amplicones anteriores con uracil-DNA glycosylase, seguido por un 1060; min de incubación a 95 ° C para activar la Taq polimerasa. A continuación, realice ciclos cuarenta de PCR, que consta de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C. </li></ol> 5. Los análisis bioquímicos <ol><li> Para cada constructos de células hidrogel cuantificar el ADN y glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) la producción de la siguiente manera. </li><li> Aspirar con cuidado los medios de comunicación y poner estéril PBS 1X en el teléfono cargado, así como los hidrogeles de control vacías. Pesar un tubo vacío y poner el hidrogel en el interior después de secante en papel de seda y registrar el peso o el peso húmedo de los hidrogeles. </li><li> Congelar cada hidrogel a -20 ° C en un tubo eppendorf de 1,5 ml por separado para la digestión enzimática y más tarde utilizar una parte alícuota del producto digerido para ejecutar ensayo de Picogreen (para ADN) y el ensayo de azul de metileno-Dimetil (por GAG). </li><li> Preparar la solución de papainase para la digestión enzimática de los hidrogeles. <ol><li> En primer lugar preparar el tampón PBE pesando 7,1 g de sodio phosphate dibásico (Na 2 HPO 4) y 1,6 g de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA-Na 2). Disolver en 500 ml de dH 2 O, ajustar el pH a 6,5 y filtrar la solución purificada a través de un filtro de 0,22 mm. </li><li> Disolver 0,035 g de L-cisteína en 20 ml de tampón de PBE. Se filtra la solución y 100 l de enzima papaína estéril. </li></ol></li><li> Cuando esté listo para realizar los ensayos, tomar los tubos de -20 ° C y añadir 300 l de la solución de papaína listo para los hidrogeles congelados. Machacar el gel con un mortero y se mezcla bien con la mano del mortero motor. </li><li> Llevar el volumen a 500 l con solución de papaína adicional. Realice el mismo procedimiento para los geles de control. Se incuba a 60 ° C durante 16 horas 3,9. La solución que contiene el hidrogel digerido por lo tanto se puede utilizar para la cuantificación de ADN y GAG. Mida el contenido de ADN utilizando el ensayo Picogreen con el ADN del fago Lambda de serie siguiente pr del fabricanteotocol. </li><li> Cuantificar el contenido-GAG sulfatados utilizando el azul de 1,9-dimetilmetileno (DMMB) ensayo de unión de tinte con sulfato de condroitina tiburón de serie 10. Determinar el contenido de GAG ​​dividiendo la cantidad de GAG ​​para el peso húmedo correspondiente. </li></ol> 6. Pruebas Mecánicas <ol><li> Realizar ensayos de compresión no confinada utilizando un sistema de ensayo Instron 5944 equipado con una célula de carga de 10 N. <ol><li> Después de los días deseados de cultivo in vitro, realice la prueba de compresión en el cadalso de células hidrogel y los hidrogeles de control acelular. </li><li> Sumergir las muestras en un baño de PBS a RT y comprimir a una velocidad de 1% de deformación / seg a una cepa máximo de 15% 11,12 ya que el esfuerzo fisiológico experimentado por tejido de cartílago bajo condición de carga ha sido informado de que el 10-20% 13,14. </li></ol></li><li> Crear estrés vs. curvas de tensión y ajuste de la curva utilizando una ecuación polinómica de tercer orden. Determinar las compressive módulo tangente de la curva de ecuación de ajuste a valores de deformación de 15%. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como se informó en este protocolo, los hidrogeles 3D son capaces de mantener el fenotipo de los condrocitos en la cultura, evitando el proceso de desdiferenciación celular en células fibrocartílago usualmente encontrados con cultivos monocapa 15. Por otra parte, cultivos a largo plazo de la construcción de hidrogel chondrocytes- revelaron un entorno favorable que mantiene las características intrínsecas de células asociadas con la edad y la enfermedad. El uso de un hidrogel biomimético 3D tiene varias ventajas. En primer lugar, la inclusión de sulfato de condroitina (CS), un componente principal encontrado en el cartílago articular, permiten a las células para degradar la matriz de hidrogel mediante la secreción de condroitinasa y fijar en el cartílago recién sintetizado extra-celular de matriz 5, 16. Además, CS ha demostrado que tienen propiedades anti-inflamatorias en la articulación artrítica. El hidrogel biomimético también puede ser utilizado como un material de andamiaje para la entrega celular en la reparación del cartílago, y puede ser modificado químicamentepara facilitar una mejor integración 17,18 biomaterial-tejido. El uso de los hidrogeles PEG-CS permite cultivos a largo plazo de los condrocitos y la evaluación de las propiedades bioquímicas y mecánicas. Aquí mostramos cómo esta plataforma puede ser útil para los análisis comparativos de diversas fuentes de condrocitos diferenciados con el fin de definir el tipo de célula óptima para la ingeniería de cartílago. Curiosamente, los condrocitos encapsulados en hidrogeles permanecen viables y proliferan según sus capacidades intrínsecas. Los soportes composición de hidrogel, de hecho, el crecimiento de juveniles y adultos condrocitos sanos como se muestra en la Figura 2. La composición y estructura de los hidrogeles descritos también promueve la formación de tejido de cartílago como se indica por la deposición de una matriz extracelular funcional evaluado por glicosaminoglicanos (GAG ) cuantificación. Una ventaja adicional es que las construcciones de condrocitos hidrogelse puede evaluar para las propiedades mecánicas del tejido de cartílago recién formado. Tenga en cuenta que la prueba de compresión no confinada se debe realizar en el hidrogel acelular para la comparación. Los hidrogeles, de hecho, tienen una rigidez intrínseca debido a la rigidez de los restos de CS. Esfuerzo de compresión no confinada de 5-20% (a una velocidad de deformación 1% / s) se puede aplicar para el ensayo mecánico del tejido cartilaginoso 11,12 ya que el esfuerzo fisiológico experimentado por tejido de cartílago bajo condición de carga se ha informado a 10-20 13,14%. La respuesta de ambas células cargadas y acelular hidrogeles a ensayos mecánicos se evaluó en el punto final de la cultura. En el ejemplo descrito anteriormente se observó una rigidez comparable de las construcciones que contienen adultos y juveniles condrocitos en contraste con la menor rigidez de las construcciones que contienen condrocitos OA. Tales propiedades mecánicas de la construcción de células-hidrogel permiten la evaluación de las propiedades funcionales de latejido formado dando un análisis en profundidad de la capacidad de maduración de las células. En conclusión, el uso de los hidrogeles biomiméticos 3D para estudiar el potencial de los diferentes población de condrocitos para generar tejido cartilaginoso puede ser ampliamente aplicada. Además de los estudios in vitro descritos aquí, el trasplante in vivo de los constructos de células cargado se puede prever para estudiar la maduración celular y el potencial regenerativo en el contexto fisiológico. Otras modificaciones de la plataforma de hidrogel con factores biomiméticos adicionales también se pueden prever para optimizar la proliferación de condrocitos y la maduración.

Con su limitado potencial de auto-reparación, el cartílago articular humano sufre frecuentes daños irreversibles. En la actualidad, se centran grandes esfuerzos en el desarrollo de enfoques eficientes basados en células para el tratamiento de las lesiones del cartílago articular. El éxito de estas terapias basadas en células depende en gran medida de la selección de una fuente celular óptima y del mantenimiento de su potencial regenerativo. Los condrocitos son una fuente celular común para la reparación del cartílago, pero su suministro es limitado y pueden desdiferenciarse durante la expansión in vitro en el cultivo de monocapa 2D, lo que limita su generación de cartílago hialino. 
El objetivo de este protocolo es establecer una plataforma de hidrogel tridimensional para un estudio comparativo in vitro de condrocitos humanos de diferentes edades y estados de enfermedad. A diferencia del cultivo bidimensional (2D) convencional, los hidrogeles tridimensionales (3D) permiten que los condrocitos mantengan su morfología y fenotipo y proporcionan un entorno fisiológicamente relevante que permite a los condrocitos producir tejido cartilaginoso 2,3. Además de proporcionar una estructura física en 3D para el cultivo de condrocitos, los hidrogeles imitan la función de la matriz extracelular (MEC) del cartílago nativo. En concreto, la inclusión de metacrilato de sulfato de condroitina proporciona un reservorio potencial para los factores paracrinos secretados 4 y permite la degradación mediada por células y el recambio de la matriz 5. Aunque muchos sistemas de cultivo de hidrogel 3D se han utilizado ampliamente en varios estudios, incluidos los geles de agarosa y alginato, hemos utilizado un sistema de cultivo 3D biomimético que tiene algunas ventajas distintivas para el cultivo de condrocitos. El sulfato de condroitina (CS) es un componente abundante en el cartílago articular y se ha demostrado que los hidrogeles PEG-CS mantienen e incluso mejoran el fenotipo condrogénico y facilitan la degradación y el recambio de la matriz mediada por células 2,5. Además, las propiedades mecánicas del andamio de hidrogel se pueden modular fácilmente cambiando la concentración de PEG y, por lo tanto, se pueden utilizar para mejorar aún más el potencial de regeneración de los condrocitos o de un tipo de célula relacionado 6,7. El PEG/CSMA también es biocompatible y, por lo tanto, tiene el potencial de una aplicación clínica directa en defectos del cartílago, por ejemplo. La limitación de este sistema es su complejidad y el uso de la fotopolimerización que puede afectar potencialmente la viabilidad celular en comparación con sistemas más simples como la agarosa, sin embargo, las ventajas para el cultivo de condrocitos superan las limitaciones potenciales.
El cultivo de hidrogel 3D es compatible con el ensayo convencional para la evaluación del fenotipo celular (expresión génica, inmunotinción de proteínas) y el resultado funcional (cuantificación de la producción de matriz de cartílago, pruebas mecánicas). Este entorno 3D favorable se probó para comparar el potencial de regeneración de tejidos de condrocitos humanos de tres poblaciones envejecidas diferentes en cultivos 3D a largo plazo. 
Los resultados se evaluaron mediante ensayos fenotípicos y funcionales. Los condrocitos juveniles, adultos y OA mostraron respuestas diferenciales en el cultivo de hidrogel biomimético en 3D. Después de 3 y 6 semanas, la expresión génica condrogénica se reguló al alza en los condrocitos juveniles y adultos, pero se reguló a la baja en los condrocitos OA. La deposición de componentes del tejido cartilaginoso, como el agrecano, el colágeno tipo II y el glicosaminoglicano (GAG), fue alta para los condrocitos juveniles y adultos, pero no para los condrocitos OA. Los módulos de compresión de las construcciones de cartílago resultantes también mostraron tendencias similares. En conclusión, tanto los condrocitos juveniles como los adultos mostraron una disposición condrogénica y de la matriz del cartílago hasta 6 semanas de cultivo 3D en hidrogeles. Por el contrario, los condrocitos osteoartríticos revelaron una pérdida del fenotipo del cartílago y una capacidad mínima para generar cartílago robusto.

<table><tbody><tr><td>condrocitos juveniles (Clonetics Normal Human Chredrocitos Cell System)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>condrocitos adultos (Clonetics Normal Human Choncyte Cell System)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>poli(diacrilato de etilenglicol)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td><td></td></tr><tr><td>2-morfolinoetanosulfónico ácido</td><td>Sigma</td><td>M5287</td><td></td></tr><tr><td>fotoiniciador</td><td>Irgacure&nbsp;</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de condroitina sal de sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C9819</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida</td><td>Sigma</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoetil metacrilato</td><td>Sigma</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>tubo de diálisis</td><td>Spectrum Laboratories&nbsp;</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa 2</td><td>Worthington Bioquímico&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004177</tr><tr><td>Colagenasa 4</td><td>Worthington Bioquímico&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004189</tr><tr><td>Medios DMEM/F12</td><td>HyClone, Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH3002301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ensayo vivo</td><td>/muerto Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td><td></td></tr><tr><td>Tri reactivo</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>1,9-dimetilmetileno azul&nbsp;</td><td>Equipo</td> de luz ultravioleta Sigma <td>341088</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- XX-15LW Lámpara de banco, 365 nm</td><td>UVP</td><td>95-0042-07</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de prueba Instron 5944&nbsp;</td><td>Corporación Instron</td><td>E5940</td><td></td></tr></tbody></table>

3d hidrogel andamios para articular condrocitos cultura y cartílago generación

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

El cartílago articular humano es altamente susceptible al daño y tiene un potencial limitado de auto-reparación y regeneración. Las estrategias basadas en células para diseñar el tejido cartilaginoso ofrecen una solución prometedora para reparar el cartílago articular. Para seleccionar la fuente celular óptima para la reparación de tejidos, es importante desarrollar una plataforma de cultivo adecuada para examinar sistemáticamente las diferencias biológicas y biomecánicas en el cartílago modificado por diferentes fuentes celulares. Aquí aplicamos una plataforma de cultivo de hidrogel biomimético tridimensional (3D) para examinar sistemáticamente el potencial de regeneración del cartílago de condrocitos juveniles, adultos y osteoartríticos (OA). El hidrogel biomimético 3D consistió en un componente sintético de poli(etilenglicol) y un componente bioactivo condroitín sulfato, que proporciona un microambiente fisiológicamente relevante para el cultivo in vitro de condrocitos. Además, el andamio puede utilizarse potencialmente para la entrega de células para la reparación del cartílago in vivo. El tejido cartilaginoso diseñado en el andamio se puede evaluar mediante expresión génica cuantitativa, tinción de inmunofluorescencia, ensayos bioquímicos y pruebas mecánicas. Utilizando estos resultados, pudimos caracterizar el potencial regenerativo diferencial de condrocitos de diferentes edades, tanto a nivel de expresión génica como en las propiedades bioquímicas y biomecánicas del tejido cartilaginoso modificado. El modelo de cultivo 3D podría aplicarse para investigar las diferencias moleculares y funcionales entre condrocitos y células progenitoras de diferentes etapas de desarrollo normal o aberrante.

Hidrogeles bioactivos que contienen PEG y restos CS (Figura 1) representan una plataforma ideal para la cultura y la maduración de los condrocitos articulares humanos 2,3,5,7. Los condrocitos de diferentes edades y estados de enfermedad pueden ser cultivadas con el método descrito y analizado por su fenotipo, la expresión génica y propiedades bioquímicas y mecánicas del tejido de cartílago generado. Tres muestras de condrocitos, juvenile- 6 meses, edad adulta 34 años y osteoarthritic- 74 años, se recogieron después de 3 semanas de cultivo en hidrogeles biomiméticos 3D. La expresión génica de los condrocitos analiza normal, tanto juveniles y adultos, mostró un aumento en la expresión de los genes COL6A1 y condrocitos Col2a1. Por el contrario, los condrocitos enfermas mostraron una disminución dramática en Col2a1 manteniendo al mismo tiempo la expresión de COL6A1 (Figura 2) que muestra una pérdida de fenotipo condrogénica a pesar de ser cultivadas en un medio ambiente favorable biomimético. Los hidrogeles de PEG-CS también sirven como un entorno dinámico para los condrocitos a proliferan, digieren la matriz pre-existente de PEG y CS y depositan su matriz pericelular y extracelular, los principales componentes del tejido de cartílago maduro. Dadas estas capacidades, la expansión de condrocitos después de 3 semanas de cultivo in vitro se puede estimar mediante la cuantificación de ADN con el tinte Picogreen. Análisis comparativo de los tres grupos de células muestran que la densidad celular de las poblaciones de juveniles y adultos se mantuvo sin cambios, mientras que los condrocitos OA mostraron una disminución dramática en comparación con los días 1 de la cultura. Una pérdida de contenido de ADN también se observó para la OA, pero no otros condrocitos que sugieren la posible muerte celular durante el largo plazo la cultura (Figura 3). La matriz secretada se cuantificó como contenido-GAG sulfatado mediante el ensayo de fijación de colorante DMMB en la etapa de punto final después de 3 semanas de las culturas. Contenido de GAG ​​se normaliza por el peso húmedo del hidrogel como recorded antes de la digestión enzimática y la contribución acelular se resta. Como se muestra en la Figura 4, los condrocitos depositan una cantidad significativa similar de GAG durante 3 semanas de cultivo en hidrogeles 3D. La presencia de un andamio física permite que la evaluación de las propiedades biomecánicas de las muestras a través de no confinado ensayos de compresión 2,3. Mientras que los hidrogeles acelulares se someten a una disminución en los módulos de compresión, los constructos de células Laden mantienen los módulos de compresión después de 3 semanas en cultivo (Figura 4). El fenotípica, análisis bioquímicos y biomecánicos descritos aquí son por lo tanto útiles para evaluar y comprender el potencial de las diferentes poblaciones de condrocitos para el cartílago ingeniería. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> Figura 1. PEG-CS hidrogeles biomiméticos para cul de condrocitos 3Dtura. Los condrocitos se resuspenden en una mezcla que contiene poli (etileno glicol diacrilato) (PEGDA) y sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA) y fundido en el molde de gel cilíndrica a medida. Después de la exposición UV, solidificaron geles se recogen de los moldes y la viabilidad celular se evalúa por tinción muertos en vivo 24 horas después de la encapsulación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> Figura 2. Expresión de genes condrogénicas en condrocitos humanos cultivados en hidrogeles biomiméticos 3D. La expresión génica cuantitativa de marcadores de cartílago Col2a1 y COL6A1 por juveniles, adultos y OA condrocitos después de 3 semanas de cultivo en hidrogeles biomiméticos 3D. Los valores se normalizaron a nivel de la expresión génica en el día 1. Error bars representan media ± DE. * p &lt;0,05 como se determina por una prueba t de Student de dos colas. Modificado de Smeriglio et al. 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> Figura 3. contenido de ADN en los condrocitos humanos cultivados en hidrogeles biomiméticos 3D. Cuantificación de ADN por el ensayo Picogreen en juveniles, adultos y OA condrocitos después de 3 semanas de cultivo en hidrogeles biomiméticos 3D. Los valores se normalizaron a nivel de ADN en el día 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;br /&gt; Figura medición de contenido 4. GAG y prueba de compresión no confinada de condrocitos humanos en el día 1 y después de 3 semanas de cultivo en hidrogeles biomiméticos 3D. (A) GAG cuantificación mediante ensayo DMMB en condrocitos en el día 1 y después de 3 semanas de cultivo en hidrogeles biomiméticos 3D. Los valores se normalizan a mojar peso (ww) y se expresaron como mg / g. (B) módulo de compresión (kPa) de acelulares y celulares cargados hidrogeles en el día 1 y después de 3 semanas de cultivo en hidrogeles biomiméticos 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La reparación del cartílago representa un desafío médico no resuelto y los enfoques basados en células para diseñar el cartílago articular humano son una solución prometedora. Aquí, describimos los hidrogeles biomiméticos tridimensionales (3D) como una herramienta ideal para la expansión y maduración de los condrocitos articulares humanos.

3D hidrogel andamios para articular condrocitos cultura y cartílago Generación

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar un cultivo tridimensional de hidrogel biomimético para expandir condrocitos articulares y generar cartílago articular humano. Esto se logra primero mediante la disección de los cóndilos femorales obtenidos de una artroplastia total de rodilla, la eliminación del tejido cartilaginoso del hueso subcondral y el aislamiento de condrocitos de la matriz extracelular mediante disociación enzimática. El segundo paso consiste en sintetizar el polímero de metacrilato de sulfato de condroitina para la fabricación de un hidrogel biomimético.A continuación, los condrocitos se encapsulan en hidrogeles biomiméticos tridimensionales, y los constructos se cultivan durante tres a seis semanas in vitro. Finalmente, se pueden obtener resultados que demuestran el crecimiento y la maduración de los condrocitos articulares mediante pruebas bioquímicas y mecánicas. La principal ventaja de utilizar una plataforma tridimensional de hidrogel biométrico para el cultivo de condrocitos es que proporciona un microentorno fisiológicamente relevante, ya que incorpora los componentes nativos del cartílago.Esta es la ventaja de que los condrocitos puedan mantener su fisiología y fenotipo durante un período de tiempo más prolongado. La inclusión de un polímero bioactivo, la superficie de condroitina, en el hidrogel tridimensional permite las métricas y el recambio de degradación mediados por condrocitos. Además, las propiedades mecánicas y bioquímicas de la matriz de hidrogel pueden modificarse fácilmente.Esta técnica es compatible con ensayos convencionales para evaluar el fenotipo celular y el resultado funcional. Puede utilizarse para estudiar características intrínsecas de los condrocitos asociadas con etapas tempranas de enfermedades y para evaluar la maduración celular y el potencial regenerativo en un contexto fisiológico. Para comenzar, prepare el medio de disociación combinando una parte de colagenasa dos a 125 unidades por mililitro con una parte de colagenasa cuatro a 160 unidades por mililitro en medio de crecimiento para chondrocitos, utilizando tejido cartilaginoso fresco que normalmente se descarta durante una artroplastia total de rodilla.Tome un escalpelo estéril y extraiga una biopsia de la superficie lisa de uno de los cóndilos femorales. Luego, corte la biopsia en rebanadas delgadas. Añada las rebanadas de cartílago al medio de disociación combinado en una proporción de uno a tres en volumen, y coloque la placa a 37 grados Celsius durante la noche para liberar los condrocitos de la matriz extracelular al día siguiente.Filtre el tejido digerido que contiene las células disociadas a través de una malla de nailon de 70 micrones de tamaño de poro. Luego lave las células dos veces con 20 mililitros de D-M-E-M-F 12 precalentado, medio y centrifugue las células a 600 G durante cinco minutos. A continuación, cuente los condrocitos aislados en una placa de hemocitómetro.1 millón de células en un plato de cultivo de 60 milímetros y cubrir con medio D-M-E-M-F 12 suplementado. Mantener los cultivos primarios de choy como una monocapa de alta densidad siguiendo técnicas de cultivo estándar. Sintetizar sulfato de condroitina metacrilato añadiendo 1,952 gramos de ácido 2-morfolinoetanosulfónico y 5,84 gramos de cloruro de sodio en 200 mililitros de agua desionizada y agitar la solución hasta que se disuelva completamente.A continuación, disuelva cinco gramos de sal sódica de sulfato de condroitina en la solución amortiguadora. Luego agregue 0,532 gramos de N-hidroxi CIN amida y 1,771 gramos de clorhidrato de uno etil tres tres dimetil amino propil carbodiimida a la solución y agite durante cinco minutos. Una vez disuelto, añada 0,765 gramos de dos amino etil metacrilato a la solución y mantenga la reacción a temperatura ambiente durante 24 horas, cubierta con papel de aluminio.Purifique la mezcla final mediante diálisis frente a agua desionizada durante cuatro días, utilizando tubos de diálisis con un límite de peso molecular de 12 a 14 kilodalton. Luego, filtre la solución purificada a través de un filtro de 0,22 micrones y congele a menos 20 grados Celsius. Coloque los tubos abiertos que contienen la solución en un desecador.Protéjalos de la luz cubriéndolos con papel de aluminio y aplique vacío durante la noche. Almacene el polímero disuelto a menos 20 grados Celsius en tubos Falcon, envueltos con parafina y papel de aluminio para protegerlos de la luz y la humedad el día anterior a la encapsulación celular. Retire el medio de cultivo de los citos cultivados y cubra las células con medio de disociación.Incubar las células en la solución de colagenasa durante la noche a 37 grados Celsius. Autoclavar la película PCR y las varillas cilíndricas, y luego esterilizar el molde cilíndrico personalizado para geles sumergiéndolo en etanol al 70% filtrado con filtro de 0,2 micrones, colocado dentro de una campana de cultivo celular bajo luz UV durante la noche. Al día siguiente, retirar los moldes del etanol y dejar que sequen dentro de la campana de cultivo celular. A continuación, colocar el molde en una placa estéril de 150 milímetros. Una vez secos, sellar la base de los moldes utilizando película PCR autoclavada.Evite cualquier burbuja de aire o espacio para prevenir fugas. A continuación, tome un tubo de 50 mililitros y agregue 10% del metacrilato de condroitina sulfato preparado, 10% de polietilenglicol diacrilato y 5% peso por volumen. Iniciador fotográfico en DPBS hasta una concentración final de 3%5% y 0.05%, respectivamente.Proteja el tubo de la luz y vortexe brevemente la mezcla. Recolecte las células disociadas en un tubo cónico de 50 mililitros y luego cuéntelas utilizando un hemocitómetro. Pelote las células a 460 × g durante cinco minutos y resuspenda en el material de gel mixto a una densidad de 15 millones de células por mililitro.Mezcle la solución 30 veces teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas. A continuación, pipetee 72 microlitros de la suspensión de hidrogel celular o del hidrogel solo en el molde cilíndrico personalizado. Induzca la gelificación exponiendo los geles a luz UV de 365 nanómetros a tres milivatios por metro cuadrado durante cinco minutos.Una vez que haya gelificado, utilice un escalpelo para cortar la película y retírela con cuidado. Con la ayuda de las varillas cilíndricas, expulse el gel en una placa de seis pocillos con cinco mililitros de DPBS estéril para eliminar cualquier gel no polimerizado restante y las células sueltas. A continuación, transfiera los hidrogeles lavados a los pocillos de una placa de 24 pocillos que contenga 1,5 mililitros de medio de crecimiento Chondra site en cada uno.Incube adecuadamente los hidrogeles a 37 grados Celsius y cambie el medio cada dos días. Evalúe la viabilidad celular mediante tinción de células vivas y muertas a las 24 horas posteriores a la encapsulación, utilizando técnicas estándar de cultivo, los hidrogeles cargados con células y los hidrogeles vacíos durante tres a seis semanas antes de la recolección y el análisis. Después del número deseado de días de cultivo in vitro, retire las muestras del incubador para realizar la prueba de compresión sobre el andamiaje de hidrogel celular y los hidrogeles de control acelulares.Coloque las muestras una a la vez a temperatura ambiente sobre el baño de PBS conectado a un sistema de pruebas mecánicas equipado con una celda de carga de 10 Newtons, y comprima a una velocidad de 1% de deformación por segundo hasta una deformación máxima del 15%. Para analizar las pruebas mecánicas, cree curvas de tensión versus deformación para cada muestra y realice un ajuste de curva. Utilizando una ecuación polinómica de tercer orden, determine el módulo tangencial a compresión a partir de la ecuación del ajuste de curva a valores de deformación del 15% tras tres semanas de cultivo. En hidrogeles biomiméticos tridimensionales, el análisis de expresión génica de condrocitos normales, tanto juveniles como adultos, mostró un aumento en la expresión de los genes de los condrocitos colágeno dos A uno y colágeno seis A uno. Por el contrario, los condrocitos enfermos mostraron una disminución drástica en colágeno dos A uno, mientras mantenían la expresión de colágeno seis A uno, lo que indica una pérdida del fenotipo condrogénico a pesar de estar cultivados en un entorno biomimético favorable.La expansión de condrocitos después de tres semanas de cultivo puede estimarse mediante la cuantificación del ADN con el colorante pico verde. El análisis comparativo de los tres grupos de células muestra que la densidad celular de las poblaciones juvenil y adulta no cambió, mientras que los condrocitos osteoartríticos exhibieron una disminución drástica en comparación con el día uno del cultivo. La matriz de condrocitos secretada se cuantificó como contenido de GAG sulfatados después de tres semanas de cultivo.Como se muestra aquí, los condrocitos depositaron una cantidad significativa de GAG durante tres semanas de cultivo, lo cual pudo haber contribuido a las mejores propiedades mecánicas de los hidrogeles cargados con células en comparación con los controles. Además de aplicar este procedimiento en estudios individuales, el modelo de cultivo en hidrogel biomimético tridimensional puede trasladarse fácilmente a un modelo de defecto de cartílago de espesor completo y utilizarse para caracterizar el resultado funcional y bioquímico en la regeneración a largo plazo del cartílago articular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar condrocitos humanos a partir de especímenes articulares de rodilla y producir andamios tridimensionales de hidrogel para cultivo prolongado de condrocitos y generación de injertos. La utilización de los hidrogeles 3D OME nos permitirá a nosotros y a otros investigadores comparar el potencial condrogénico de diferentes poblaciones de condrocitos maduros, así como de nuevas poblaciones de células madre y progenitoras.En el futuro, estas técnicas pueden ampliarse para incorporar factores miméticos adicionales con el fin de formular un andamio óptimo que pueda utilizarse para la regeneración y reparación del cartílago.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Un sistema 3D de los condrocitos articulares humanos en cultivo de altos niveles de líquido sinovial se describe. El líquido sinovial refleja el microambiente más naturales para el cartílago articular, y puede ser fácilmente obtenido y almacenado. Así, este sistema puede ser utilizado para el estudio de la regeneración del cartílago y de terapias de detección para el tratamiento de la artritis.

Un sistema 3D para los condrocitos articulares humanos cultivo de líquido sinovial

La biosíntesis de la matriz extracelular cartilaginosa por los condrocitos pueden ser afectados por la aplicación de estímulos mecánicos. Este método describe la técnica de aplicación de dinámicas tensiones compresivas a los condrocitos encapsulados en construcciones en 3D y la evaluación de los cambios inducidos en el metabolismo de los condrocitos.

La estimulación mecánica de condrocitos-agarosa hidrogeles

Un bioprinter se utilizó para crear hidrogeles modelado basado en un molde de sacrificio. El molde poloxámero se rellenó con un segundo hidrogel y luego se eluyó, dejando huecos que estaban llenos de una tercera hidrogel. Este método utiliza elución rápida y buena capacidad de impresión de poloxámero para generar arquitecturas complejas a partir de biopolímeros.

Impresión Moldes inversa termosensible para la Creación de modelado hidrogeles de dos componentes para el 3D de cultivo celular

Los métodos descritos en este artículo muestran cómo convertir una impresora de inyección de tinta comercial en un bioprinter con la polimerización UV simultánea. La impresora es capaz de construir la estructura del tejido 3D con células y biomateriales. El estudio ha demostrado aquí construyó un neocartílago 3D.

El cartílago humano Tissue Fabrication Usando tridimensional Tecnología de impresión inyección de tinta

La ingeniería y el análisis de tejidos portadores de carga con poblaciones celulares heterogéneas siguen siendo un desafío. Aquí, describimos un método para crear discos de hidrogel de alginato de dos capas como plataforma para el cocultivo de diversas poblaciones celulares dentro de una construcción.

Las construcciones en capas de alginato: Una plataforma para el co-cultivo de poblaciones celulares heterogéneas

Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Aquí describimos una fácil preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano utilizando química dinámica imina. Se presentan métodos para ajustar la fuerza mecánica de hidrogel y su aplicación en cultivos celulares 3D.

Preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano y su aplicación en cultivos celulares 3D

Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

Proporcionamos métodos detallados para generar cuatro tipos de tejidos a partir de células madre mesenquimales humanas, que se utilizan para recapitular el cartílago, el hueso, la almohadilla de grasa y la membrana sinovial en la articulación de la rodilla humana. Estos cuatro tejidos se integran en un biorreactor personalizado y se conectan a través de microfluídica, generando así una articulación de rodilla en un chip.

Creación de una articulación de rodilla en un chip para modelar enfermedades articulares y probar medicamentos

La terapia ósea a través de la osificación endocondral mediante la implantación de tejido cartilaginoso artificial producido a partir de células madre mesenquimales tiene el potencial de eludir los inconvenientes de las terapias convencionales. Los hidrogeles de ácido hialurónico son eficaces para escalar injertos de cartílago uniformemente diferenciados, así como para crear hueso integrado con vascularización entre injertos fusionados in vivo.

Formación ósea integrada a través de la osificación endocondral in vivo utilizando células madre mesenquimales

Este estudio describe un método para producir esferoides condrocíticos mediante la agregación de células en esferoides en condiciones de baja adherencia utilizando la gravedad, seguido de un cultivo de los esferoides resultantes en mini-biorreactores.

Generación de esferoides a partir de varios condrocitos utilizando condiciones de baja adherencia por gravedad y mini-biorreactores caseros

Aprende a expandir condrocitos articulares humanos y generar cartílago usando hidrogeles biomiméticos 3D. Este método permite estudiar la fisiología celular y evaluar potencial regenerativo en ingeniería tisular.

3D hidrogel andamios para articular condrocitos cultura y cartílago Generación

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