Name: El uso de células Caco-2 para el Estudio de lípidos Transporte por el Intestino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda a estudiar el transporte de lípidos en el intestino usando células Caco-2 diferenciadas. Este método permite aislar lipoproteínas mediante ultracentrifugación y analizar su tamaño para comprender la absorción de nutrientes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el Premio Seed Grant de la Facultad de Farmacia de la Universidad Northstate de California (a AMN). Los autores desean agradecer a la Facultad de Farmacia de la Universidad Northstate de California por cubrir el costo de publicación de este artículo, y a George Talbott por su ayuda en la edición de este manuscrito.

1. Mantenimiento de las células Caco-2 <ol><li> El uso de platos regulares de cultivo de tejidos <ol><li> Descongelar las 2-Caco células de un vial congelado colocando el vial en un baño de agua a 37 ° C, e inmediatamente añadirlos a una placa de cultivo tisular de 10 cm que contenía 10 ml de medio de crecimiento (suero bovino fetal pre-calentado 15% (FBS ) en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)). <ol><li> Cuando las células Caco-2 han llegado a 50-70% de confluencia, ellos dividido 1: 6 mediante la incubación de las células con 3 ml de 0,05% / 0,53 mM de ácido etilendiaminotetraacético Tripsina (EDTA) a 37 ° C hasta que se separan (15 min) . Para evitar la formación de grumos de células, mezclar las células varias veces por pipeteo suave. Añadir 0,5 ml de las células tripsinizadas a una placa de cultivo de tejido de 10 cm que contenía 10 ml de medio de crecimiento pre-calentado. </li></ol></li><li> Agitar suavemente los platos varias veces en una dirección hacia adelante y hacia atrás seguido de una dirección hacia la izquierda y hacia la derecha. Evite remolinos de los platosya que puede resultar en una dispersión de células desigual. </li><li> Colocar las cápsulas en una superficie plana en una incubadora a 37 ° se suministra con 5% de CO 2. Superficies inclinadas también pueden resultar en una dispersión de células desigual. </li><li> Cambie los medios de crecimiento de un día después de comenzar la incubación. </li><li> Monitorear las células y registrar el día que lleguen a la confluencia. Tomará alrededor de 1 semana para que las células alcanzan la confluencia del día en que se dividen. </li><li> Cambiar el medio de crecimiento dos veces a la semana antes de que las células alcanzan la confluencia. Una vez que las células han alcanzado la confluencia, cambiar los medios de cultivo cada dos días. Después de que las células son 7 días post-confluentes, cambiar el medio de crecimiento diario. Nota: Las células están listas para experimentos cuando son 13 días post-confluentes (Figura 1). Dado que las células con el tiempo se vuelven menos efectivos para producir lipoproteínas, utilizar células que se encuentran entre 13 y 17 días post-confluentes 8. Vaya al paso 3 en la forma de realizar el experimento.</li></ol></li><li> Usando el sistema de membrana permeable <ol><li> Semilla las células Caco-2 en el inserto membrana permeable como se describe en el paso 1.1.1.1. arriba. Evitar el uso de células de un vial congelado debido a que su crecimiento celular es normalmente más lenta (período de recuperación). Brevemente, añadir 0,5 ml de las células tratadas con tripsina a la cámara apical (compartimiento superior) que contiene 10 ml de medio de crecimiento pre-calentado. Además, añadir 10 ml de medio de crecimiento pre-calentado a la cámara basolateral (compartimiento inferior). Nota: Para obtener las mejores prácticas, agregue los medios de cultivo a la cámara apical primero y luego a la cámara basolateral. Al retirar los viejos medios, retire los medios basolateral ante los medios apicales. Evite meter la membrana de policarbonato, ya que puede romper la membrana. </li><li> Debido a la visibilidad celular pobres a través de la membrana de policarbonato, sembrar las células Caco-2 en una placa de cultivo de tejidos regular con densidad similar, y el uso de este plato para juzgar la confluencia celular. </li><li> Siga steps 1.1.2-1.1.6 anteriores. </li></ol></li></ol> 2. La sobreexpresión de genes <ol><li> Utilizando el método ordinario transfección <ol><li> Semilla las células Caco-2 en una placa de cultivo de tejidos como se describe en 1.1.1.1.-1.1.4. Nota: Cuando las células son alrededor de 40-50% de confluencia, que están listos para ser transfectadas. </li><li> Añadir 67 l de reactivo de transfección a 472 l de los medios de comunicación séricos reducidos en un tubo de microcentrífuga. Evite el contacto del reactivo de transfección sin diluir con la pared del tubo. </li><li> Añadir 23 g de pLL3.7 aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) 9 en el reactivo de transfección / reducido mezcla de medio de suero. </li><li> Incubar la mezcla durante 20 min a TA. </li><li> Reemplace el medio de crecimiento de las células Caco-2 &#39;con 8 ml de 10% de FBS en DMEM. </li><li> Añadir la mezcla de ADN / reactivo de transfección / media suero reducido gota a gota al plato. </li><li> Agite con cuidado los platos varias veces en un delantero y backward dirección seguida por una dirección hacia la izquierda y hacia la derecha. </li><li> Coloque el plato en el 37 ° C incubadora. </li><li> Vuelva a colocar los medios de comunicación en el plato con 10 ml de medio de crecimiento un día después de comenzar la incubación. </li><li> Supervisar la expresión génica. <ol><li> Controlar la expresión génica sin 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) tinción. Utilizando un microscopio fluorescente, determinar el porcentaje de células que son verde. El porcentaje representa la eficiencia de transfección. </li><li> Supervisar la expresión génica con DAPI. <ol><li> Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) tres veces. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 10 ml de formaldehído al 4% en PBS (10 min de incubación a RT). </li><li> Lavar las células con PBS tres veces. </li><li> Se incuban las células en la oscuridad durante 15 min a TA con 8 ml de PBS que contenía 1: 500 DAPI, 1% de BSA, 0,01% de digitonina. </li><li> Lavar las células con PBS tres veces. </li><li> Ucantar un microscopio de fluorescencia, determinar el número de células que son verde / azul con relación a los que son de color azul (Figura 2 panel superior). El porcentaje calculado representa la eficiencia de transfección. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Utilizando el sistema de sobreexpresión lentivirus 10 <ol><li> Semilla de riñón embrionario (HEK) células humanas 293T en un 15 cm placa de cultivo de tejidos (10% de FBS en DMEM como su medio de crecimiento). Nota: Cuando las células son aproximadamente 60-70% de confluencia, que están listos para ser transfectadas. </li><li> Añadir 162 l de reactivo de transfección de 1.133 l de los medios de comunicación séricos reducidos en un tubo de microcentrífuga de 11. Evite el contacto del reactivo de transfección sin diluir con la pared del tubo. </li><li> Añadir 24 g de pLL3.7 eGFP (u otro constructo), 15,6 g de elemento de respuesta Rev (RRE), 6,0 g de REV, y 8,4 g de glicoproteína de virus de la estomatitis vesicular (VSVG) en el reactivo de transfección / rrelucida mezcla de medio de suero. </li><li> Incubar la mezcla durante 20 min a TA. </li><li> Reemplace el medio de crecimiento con 16 ml de 10% de FBS en DMEM. </li><li> Añadir la mezcla de ADN / reactivo de transfección / media suero reducido gota a gota al plato. </li><li> Agitar suavemente los platos varias veces en una dirección hacia adelante y hacia atrás seguido de una dirección hacia la izquierda y hacia la derecha. Es normal ver algunas de las células HEK293T unifamiliares en este punto. </li><li> Coloque el plato en la incubadora. </li><li> Después de 24 h de incubación, sustituir los medios de comunicación en el plato con 25 ml de medio de crecimiento. </li><li> Al día siguiente, recoger el medio de crecimiento que contiene el lentivirus (primera colección). </li><li> Repita el paso 2.2.10 para recoger más lentivirus (la segunda colección). </li><li> Agrupar la primera y la segunda colección, y eliminar los restos celulares por centrifugación (2.500 xg durante 5 min). </li><li> Se filtra la colección con un filtro desechable botella-superior (0,45 micras de poro), yconcentrar el virus por centrifugación de la colección a 31.400 xg durante 2 horas a RT (JA-20 rotor). Marque la parte inferior del tubo de centrífuga donde se encuentra el sedimento. Decantar el sobrenadante, y dejar el tubo invertido a temperatura ambiente durante unos 15 minutos. </li><li> Resuspender el sedimento que contiene el virus con 100 l de 1X PBS. Evite las burbujas. </li><li> Guarde el virus concentrado a -80 ° C. Evite los ciclos de congelación-descongelación. </li><li> Determinar la cantidad óptima de virus necesaria para transducir las células Caco-2 por titulación. Para ahorrar costes, utilizar una placa de 24 pocillos (0,3 ml de crecimiento de los medios de comunicación / pocillo) en lugar de una placa de 10 cm de cultivo de tejidos para la titulación. <ol><li> Añadir cantidades crecientes del virus concentrado (0, 1, 2, 5, 10, 25, y 50 l / pocillo) suplementado con polibreno (concentración final = 5 g / ml) para el 40-70% de confluencia células Caco-2. Agite la placa de 24 pocillos con cuidado como se describe en 1.1.2. </li><li> Vigile su expresión génica (Paso 2.1.10.) (Figura 2 inferior4 paneles). </li></ol></li><li> Dado que la expresión de transgén es generalmente sostenido, mantener las células transducidas para futuros experimentos y controlar continuamente su expresión génica (Paso 2.1.10.). </li></ol></li></ol> 3. Estimular la secreción de lipoproteínas <ol><li> Usando el tejido plato normal cultura <ol><li> Preparar una mezcla de lípidos 100X mezclando 50 mg de ácido oleico, 40 mg de lecitina y 48 mg de taurocolato de sodio. Llevar el volumen a 900 l con PBS (suficiente para 8 platos). Agite la mezcla de lípidos vigorosamente. </li><li> Añadir 900 l de la mezcla de lípidos 100X en 89,1 ml de medio de crecimiento. Mezclar y filtrar los medios de comunicación que contiene lípidos. Las concentraciones finales (1X) de ácido oleico, lecitina, y taurocolato de sodio son 2,0 mM, 1,36 mM, y 1,0 mM, respectivamente. </li><li> Añadir 10 ml de los medios de comunicación que contiene lípidos a las células. </li><li> Se incuban las células con los medios de comunicación que contiene lípidos durante 4 horas en un 37° C incubadora. </li><li> Lavar las células con PBS tres veces. </li><li> Añadir 10 ml de medio de crecimiento a las células para recoger la secreción de lipoproteínas. </li><li> Incubar durante 2 horas en una incubadora a 37 °. </li><li> Se recoge el medio que contiene lipoproteínas. </li></ol></li><li> Usando el sistema de membrana permeable <ol><li> Siga los pasos 3.1.1-3.1.2 para preparar la mezcla de lípidos. </li><li> Añadir 10 ml de los medios de comunicación que contiene lípidos a la cámara apical y 10 ml de medio de crecimiento a la cámara basolateral. </li><li> Incubar durante 4 horas en una incubadora a 37 °. Se recoge el medio que contiene lipoproteínas en la cámara basolateral. </li></ol></li></ol> 4. Aislamiento lipoproteína (Figura 3) <ol><li> Eliminar los restos celulares de los medios de comunicación que contiene lipoproteína mediante centrifugación (2.000 xg durante 5 min). </li><li> Decantar los medios de comunicación en un tubo de 50 ml. </li><li> Añadir 5,95 g de cloruro de sodio a los medios. </li><li> Si la sample será analizada por el TEM, añadir 1 tableta de cóctel inhibidor de proteasa para mantener la integridad de las lipoproteínas. </li><li> Llevar el volumen a 23 ml con agua (1,2 g / ml NaCl solución de densidad). </li><li> Disolver los solutos completamente. </li><li> Decantar toda la solución en un tubo de ultracentrífuga de policarbonato. </li><li> Superponer suavemente la solución de densidad de 1,2 g / ml con 0,5 ml de agua (1,0 g / ml de densidad). </li><li> Equilibrar el tubo en peso y no por volumen. </li><li> Cargar suavemente los tubos en el rotor T865. </li><li> Haga girar las muestras en la ultracentrífuga a 429.460 xg durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Inmediatamente aislar la parte superior solución de 0,5 ml por pipeteo suave. Mantenga el tubo lo más quieto posible. </li></ol> Análisis 5. TEM <ol><li> Preparar 5 ml de ácido fosfotúngstico al 2% (w / v) y ajustar el pH a 6,0. </li><li> Filtrar el ácido fosfotúngstico al 2% con un filtro de jeringa (tamaño de poro: 0,2 micras). </li><li> Caída de 20 l de la muestra de la lipoproteína en un plato estéril. </li><li> Caída de 20 l de ácido fosfotúngstico filtrada 2% junto a la muestra en el mismo plato. </li><li> Caer suavemente una rejilla EM con el lado opaco descansando en la muestra. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Golpear suavemente el lado de la rejilla EM sobre un papel de filtro para eliminar la muestra de la red. </li><li> Caer suavemente la rejilla EM con el lado opaco que descansa sobre el ácido fosfotúngstico al 2%. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Golpear suavemente el lado de la rejilla EM sobre un papel de filtro para eliminar el ácido fosfotúngstico de la red. </li><li> El uso de un TEM, la captura de las imágenes de las lipoproteínas (Figura 4). </li></ol>

<ol><li>Drover, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+deficiency+impairs+intestinal+lipid+secretion+and+clearance+of+chylomicrons+from+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood.</a> J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).</li>
<li>Nauli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+is+important+for+chylomicron+formation+and+secretion+and+may+mediate+cholesterol+uptake+in+the+proximal+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).</li>
<li>Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+release+is+not+associated+with+chylomicron+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).</li>
<li>Lo, C. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+the+gut+choose+apolipoprotein+B48+but+not+B100+for+chylomicron+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).</li>
<li>Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+noninvasive+method+for+the+measurement+of+intestinal+fat+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption.</a> Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).</li>
<li>Nauli, A. M., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+transport+as+a+potential+determinant+of+drug+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability.</a> Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).</li>
<li>Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+fatty+acid+uptake+and+intestinal+fatty+acid-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein.</a> Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).</li>
<li>Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chylomicrons+produced+by+Caco-2+cells+contained+ApoB-48+with+diameter+of+80-200+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm.</a> Physiol Rep. 2 (6), (2014).</li>
<li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Pottekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+biosynthetic+interaction+network+component%2C+TMEM24%2C+facilitates+insulin+reserve+pool+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release.</a> Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).</li>
<li>Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+saturated%2C+mono-%2C+and+polyunsaturated+fatty+acids+on+the+secretion+of+apo+B+containing+lipoproteins+by+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells.</a> Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).</li>
<li>Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cells+and+human+fetal+colon%3A+a+comparative+analysis+of+their+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport.</a> Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).</li>
<li>Luchoomun, J., Hussain, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+secretion+of+chylomicrons+by+differentiated+Caco-2+cells.+Nascent+triglycerides+and+preformed+phospholipids+are+preferentially+used+for+lipoprotein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly.</a> J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).</li>
</ol>

El autor no tiene nada que revelar.

En este papel, los dos sistemas que se pueden utilizar para mantener las células Caco-2 se describen, a saber, el plato de cultivo de tejido normal y la membrana permeable. Los beneficios de usar el sistema de membrana permeable incluyen la separación de la apical y basolateral de los compartimentos, y la capacidad de incubar la mezcla de lípidos y recoger la secreción de lipoproteínas de forma simultánea. Sin embargo, los insertos de membrana permeable son caros, y su membrana de policarbonato no permite una buena visi...

Los estudios de absorción intestinal de grasas en la dieta, y las drogas y vitaminas solubles en lípidos pueden llevar a cabo in vivo mediante el uso de un modelo de fístula linfática de 1 - 4. Sin embargo, las técnicas quirúrgicas que participan no sólo son un reto, pero también costoso. Aunque in vivo enfoques basados ​​en el análisis fecal pueden ser utilizados, que se utilizan principalmente para determinar el porcentaje de absorción por el tracto gastrointestinal 2,5. El modelo in vitro descrito en este artículo es más rentable, y las técnicas utilizadas son sin duda menos difícil. Estudios de modificación genética también son más económicos y menos tiempo cuando se llevaron a cabo utilizando este modelo in vitro. Dado que los materiales solubles en lípidos que son absorbidos por los enterocitos son empaquetados en lipoproteínas de 6,7, la eficacia de este modelo in vitro para producir las lipoproteínas es crucial. Los dos intestina principall lipoproteínas son quilomicrones y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Los quilomicrones, definidos como lipoproteínas con 80 nm de diámetro o más, se producen estrictamente por el intestino delgado cuando los lípidos son abundantemente presentes en el lumen gastrointestinal. Puesto que son las lipoproteínas más grandes, los quilomicrones son posiblemente los transportadores de lípidos más eficientes. Este modelo in vitro, que es capaz de producir los quilomicrones 8, se puede utilizar para estudiar la absorción de grasa dietética, soluble en lípidos vitamina absorción por el intestino, y la biodisponibilidad oral de fármaco lipofílico. La presencia de moléculas solubles en lípidos, vitaminas, medicamentos o en la fracción de lipoproteína es un indicador de su absorción por el intestino delgado. Como se discutió anteriormente, este modelo se puede utilizar para mejorar la biodisponibilidad oral de fármaco lipofílico 6. Este artículo describe cómo se deben mantener células Caco-2 en la membrana permeable o platos regulares de cultivo de tejidos, cómo las millas de lípidosxture para estimular la producción de lipoproteínas debe prepararse, cómo el sistema de expresión lentivirus puede ser empleado para lograr la sobreexpresión efectiva, y cómo se debe analizar las lipoproteínas aisladas.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>16750-112</td><td>Precaliente el medio de crecimiento en una placa de cultivo de tejidos individual antes de agregar las células</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>3600511</td><td>No inactivamos por calor nuestro suero</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>Las células se pueden lavar con PBS antes del tratamiento con tripsina&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de membrana permeable</td><td>Fisher</td><td>7200173</td><td>plato de 10 cm, tamaño de poro de 3 mm, membrana de policarbonato</td></tr> plato de <tr><td>10 cm</td><td>Fisher</td><td>08-772-E plato de cultivo de</td><td>tejidos</td></tr> plato de <tr><td>15 cm</td><td>Fisher</td><td>08-772-24 Plato de</td><td>cultivo de tejidos</td>placa de</tr><tr><td>24 pocillos</td><td>Fisher</td><td>12565163</td><td>Placa</td></tr><tr><td>de cultivo de tejidos Reactivo de transfección a base de lípidos</td><td>Fisher</td><td>PRE2691</td><td>Puede sustituirse por otro reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Medios de suero reducidos</td><td>Invitrogen</td><td>11058021</td><td>Para la transfección</td></tr><tr><td>pLL3.7 eGFP</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td><a href="https://www.addgene.org/11795/">https://www.addgene.org/11795/</a></td></tr><tr><td>Filtro de tapa de botella</td><td>Fisher</td><td>9761120</td><td>poro de 0,45 mm</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Sigma</td><td>01383-5G</td><td>Prevenir el ciclo de congelación-descongelación</td></tr><tr><td>Lecitina&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>IC10214625</td><td>Lecitina de huevo &nbsp;</td></tr><tr><td>Taurocolato de sodio</td><td>Fisher</td><td>NC9620276</td><td>Producto descontinuado; Número de catálogo alternativo: 50-121-7956</td></tr><tr><td>Tableta de cóctel inhibidor de proteasa (sin EDTA)</td><td>Fisher</td><td>5892791001</td><td>Se utiliza principalmente para muestras que necesitan análisis TEM</td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga de policarbonato</td><td>Fisher NC9696153</td><td></td><td>Si lo utilizas varias veces, colapsarás el tubo</td></tr><tr><td>Tapa para tubo de ultracentrífuga</td><td>Fisher</td><td>NC9796914</td><td>Se requiere una herramienta para quitar el tubo/tapa del rotor</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Fisher</td><td>50-949-261</td><td>Desechable Filtro</td></tr><tr>de<td>jeringa</td><td>Fisher</td><td>09-719C Tamaño de</td><td>poro = 0,2 mm; nylon</td></tr><tr><td>Ácido fosfotúngstico</td><td>Fisher</td><td>AC208310250</td><td>Para preparar ácido fosfotúngstico al 2%, pH 6.0</td></tr><tr><td>Pinza</td><td>Fisher</td><td>50-238-62</td><td>Extra fino y Consejos fuertes</td></tr><tr><td>Formvar/rejilla de carbono</td><td>Fisher</td><td>50-260-34</td><td>Formvar/rejilla cuadrada de película de carbono 400 Cobre</td></tr></tbody></table>

el uso de células caco-2 para el estudio de lípidos transporte por el intestino

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Los estudios de absorción de grasa en la dieta generalmente se realizan utilizando un modelo animal equipado con una cánula linfática. Aunque este modelo animal es ampliamente aceptado como el modelo in vivo de absorción de grasas en la dieta, las técnicas quirúrgicas involucradas son desafiantes y costosas. La manipulación genética del modelo animal también es costosa y requiere mucho tiempo. Podría decirse que el modelo alternativo in vitro es más asequible, ahorra tiempo y es menos desafiante. Es importante destacar que el modelo in vitro permite a los investigadores examinar los enterocitos como un sistema aislado, lo que reduce la complejidad inherente a todo el modelo de organismo. Este artículo describe cómo las células de carcinoma de colon humano (Caco-2) pueden servir como modelo in vitro para estudiar el transporte de lípidos por parte de los enterocitos, fármacos liposolubles y vitaminas. Explica el mantenimiento adecuado de las células Caco-2 y la preparación de su mezcla lipídica; y además discute la valiosa opción de utilizar el sistema de membranas permeables. Dado que las células Caco-2 diferenciadas están polarizadas, la principal ventaja de utilizar el sistema de membrana permeable es que separa el compartimento apical del basolateral. En consecuencia, la mezcla de lípidos se puede agregar al compartimento apical, mientras que las lipoproteínas se pueden recolectar del compartimento basolateral. Además, se discute la efectividad del sistema de expresión de lentivirus en la regulación positiva de la expresión génica en células Caco-2. Por último, en este trabajo se describe cómo confirmar el aislamiento exitoso de lipoproteínas intestinales mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Figura 13-días post-confluentes células normales Caco-2 1 muestra. La aparición de estructuras en forma de cúpula y las gotas de lípidos intracelulares son característicos de diferenciadas Caco-2 células. Cuando las células Caco-2 no se dispersan igualmente durante la siembra, se aglutinan y crecer demasiado en ciertas áreas del plato; y habrá algunas áreas en el plato sin células. Remolina y colocando el plato en una superficie inclinada debe ser evitado. También es importante señalar ...

Caco-2 pueden servir como modelo in vitro para estudiar el transporte de lípidos por parte de los enterocitos y fármacos/vitaminas liposolubles en lípidos. El sistema de membrana permeable separa el compartimento apical del basolateral, mientras que el sistema de expresión de lentivirus ofrece un método eficaz de sobreexpresión génica. El aislamiento de lipoproteínas está confirmado por TEM.

El uso de células Caco-2 para el Estudio de lípidos Transporte por el Intestino

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el transporte de moléculas solubles en lípidos por parte del intestino. Esto se logra primero colocando células Caco-2 diferenciadas en la membrana permeable del inserto. A continuación, las células Caco-2 se incuban con una mezcla de lípidos y se estimula la secreción de lipoproteínas.Luego, las lipoproteínas se aíslan mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad de cloruro de sodio. Finalmente, las lipoproteínas aisladas se tiñen negativamente con ácido fosfotúngstico. En última instancia, se utiliza un análisis del tamaño de partículas para mostrar la abundancia relativa de quilomicrones frente a lipoproteínas de muy baja densidad.Aunque este método puede proporcionar información sobre el transporte de lípidos dietéticos por el intestino, también puede aplicarse a otros sistemas, como la determinación de la biodisponibilidad de fármacos lipídicos orales. Después de implementar la sobreexpresión génica y el monitoreo según el protocolo descrito, mantenga las células KCO dos que conservan la sobreexpresión génica. Utilizando células que han alcanzado una confluencia del 50 al 70 %, divida las células uno a seis añadiendo tres mililitros de tripsina al 0,05 %, 0,53 milimolar de A DTA, e incube a 37 grados Celsius hasta que las células se desprendan; pipetee suavemente las células varias veces para evitar la formación de agregados.Luego, después de transferir 0,5 mililitros de las células a la cámara apical o superior de una membrana permeable, inserte 10 mililitros de medio de crecimiento precalentado. Añada 10 mililitros de medio de crecimiento tibio a la cámara lateral inferior. Agite suavemente las placas varias veces con un movimiento hacia adelante y hacia atrás.Evite agitar las placas, ya que esto puede provocar una dispersión desigual de las células. Coloque las placas sobre una superficie plana en un incubador a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, cambie el medio de crecimiento y continúe cambiando el medio según el protocolo descrito en el texto.Prepare una mezcla de lípidos 100 x añadiendo 900 microlitros de PBS a 50 miligramos de ácido oleico en vórtex. Transfiera vigorosamente toda la mezcla de ácido oleico a un tubo que contenga 40 miligramos de Han y 48 miligramos de tartrato sódico. Disuelva la mezcla de lípidos mediante vórtex vigoroso.Añada los 900 microlitros de la mezcla de lípidos a 89,1 mililitros de medio de crecimiento y mezcle la solución filtrada para obtener las concentraciones finales en el medio mostradas aquí. Utilizando caco-2 de 13 días post-confluente cultivadas en insertos con membrana permeable, añada 10 mililitros del medio que contiene lípidos a la cámara apical y 10 mililitros del medio de crecimiento a la cámara basal lateral.Incubar durante cuatro horas a 37 grados Celsius antes de recoger el medio que contiene lipoproteínas en la cámara basolateral. Para aislar las lipoproteínas, elimine los restos celulares del medio que contiene lipoproteínas mediante centrifugación a 2000 × g durante cinco minutos. Vierta cuidadosamente el medio en un tubo de 50 mililitros, luego agregue 5,95 gramos de cloruro de sodio y, si va a analizar mediante microscopía electrónica de transmisión o TEM, agregue una tableta de inhibidor de proteasas.Utilice agua para llevar el volumen a 23 mililitros y disolver completamente los solutos. Luego, vierta cuidadosamente la solución en un tubo de ultracentrífuga de policarbonato. Utilice 0.5 mililitros de agua para superponer suavemente la solución de densidad de 1.2 gramos por mililitro.Luego equilibre el tubo por peso. Coloque los tubos en un rotor T 8 65 y realice la ultracentrifugación a 429,460 ×g y 4 °C durante 24 horas. A continuación, manteniendo el tubo lo más inmóvil posible, aísle inmediatamente los primeros 0,5 mililitros de la solución.Para realizar el análisis de MET, prepare cinco mililitros de ácido fosfotúngstico al 2 % y ajuste a un pH de 6,0. Filtre la solución utilizando un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,2 micrómetros. Coloque 20 microlitros de la muestra de lipoproteína sobre un recipiente estéril.Luego, coloque 20 microlitros del ácido fosfotúngstico filtrado al lado de la muestra en el mismo portaobjetos, con el lado mate orientado hacia la muestra. Coloque suavemente una rejilla de microscopía electrónica sobre la gota de lipoproteína e incube a temperatura ambiente durante un minuto. A continuación, toque suavemente el lateral de la rejilla sobre un papel de filtro para eliminar el exceso de muestra de la rejilla.Luego, deje caer suavemente la rejilla con el mismo lado apoyado sobre la gota de ácido fosfotúngstico e incube durante un minuto antes de golpear suavemente la rejilla sobre papel de filtro para eliminar la solución en exceso. Finalmente, realice microscopía electrónica de transmisión (TEM) para capturar imágenes de lipoproteínas. Aquí se muestran células kco dos normales a los 13 días posteriores a la confluencia, que presentan estructuras en forma de cúpula y gotas lipídicas intracelulares características de células caco dos diferenciadas.En este momento, se debe agregar suavemente medio nuevo porque las células son más susceptibles a la desprendimiento. Mediante el método de ultracentrifugación en gradiente de densidad de cloruro de sodio, se aislaron y analizaron por MET las lipoproteínas secretadas por las células caco dos. Aquí se muestran algunos de los quilomicrones, que son lipoproteínas mayores de 80 nanómetros de diámetro.También están presentes LDL de menor tamaño. Un alto porcentaje de partículas de quilomicrones en relación con el número total de partículas de lipoproteínas indica un transporte lipídico eficiente tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las ciencias farmacéuticas exploraran más extensamente la biodisponibilidad de fármacos lipofílicos orales.

using-caco-2-cells-to-study-lipid-transport-by-the-intestine

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra una técnica in vitro para evaluar la biodisponibilidad de hierro en fuentes de alimentos complejas. La técnica combina la simulación de la digestión humana junto con la absorción de hierro por parte de células Caco-2 diferenciadas. La formación de ferritina intracelular actúa como un marcador para la absorción de hierro celular.

Bioensayo celular Caco-2: un método in vitro para medir la biodisponibilidad del hierro en fuentes alimentarias complejas

Muchas aplicaciones terapéuticas requieren un transporte seguro y eficiente de los portadores de fármacos y sus cargas a través de barreras celulares en el cuerpo. En este artículo se describe una adaptación de los métodos establecidos para evaluar la tasa y el mecanismo de transporte de nanovehículos drogas (NCS) a través de barreras celulares, tales como el tracto gastrointestinal (GI) epitelio.

Modelos y métodos para evaluar el transporte de Drug Delivery Systems a través de barreras celulares

Se describe un protocolo in vitro de co-cultivo microbioma intestinal y vellosidades intestinales durante un periodo prolongado utilizando un sistema de microphysiological gut-on-a-chip humano.

Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos

Se describen métodos sencillos para estudiar la regulación de la función intestinal transportador de serotonina (SERT) y la expresión utilizando una célula in vitro modelo de cultivo de las células Caco-2 crecido en 3D y un modelo ex vivo de los intestinos de ratones. Estos métodos son aplicables al estudio de otros transportadores epiteliales.

Métodos de estudio de la función de proteínas de transporte epitelial y expresión en nativo Intestino y Caco-2 células cultivadas en 3D

Este protocolo describe el aislamiento y cultivo de células del intestino delgado murino mixtos. Estos cultivos primarios intestinales permiten la investigación de vías de señalización subyacentes secreción de péptido intestinal usando un número de técnicas.

Mezcla de cultivos primarios de murino intestino delgado previstos para el Estudio de Gut Hormone secreción y Imágenes de células vivas de células enteroendocrinas

Presentamos un protocolo para investigar la diafonía entre Caco-2 irradiadas por rayos X y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El protocolo comienza con la irradiación de Caco-2 y puesta en marcha de la cultura junto con PBMC; Posteriormente, trans epitelial resistencia eléctrica se mide regularmente durante 48 h y occidental la mancha blanca /negra en Caco-2 y PBMC.

Un método de cultura cooperación para investigar la interferencia entre rayos x irradia PBMC y células Caco-2

Aquí se presentan dos métodos para determinar la función de barrera intestinal. Un medidor epitelial (voltios/ohmios) se utiliza para la medición de la resistencia eléctrica transepitelial de epitelio cultivado directamente en los pocillos de cultivo de tejidos. En ratones, el método de sonda de FITC-los dextranos se utiliza para determinar la permeabilidad intestinal en vivo.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

Este protocolo describe un ensayo para la caracterización de la formación de gotas lipídicas (LD) en organoides intestinales humanos tras la estimulación con ácidos grasos. Discutimos cómo se utiliza este ensayo para la cuantificación de la formación de LD, y cómo se puede utilizar para la detección de alto rendimiento de medicamentos que afectan a la formación de LD.

Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos

Hemos expuesto un sistema microfisiológico (MPS) con organoides intestinales y hepáticos al paracetamol (APAP). Este artículo describe los métodos para la producción de organoides y las evaluaciones de propiedades farmacocinéticas y toxicológicas APAP en el MPS. También describe los análisis de funcionalidad tisular necesarios para validar los resultados.

Un sistema microfisiológico intestinal/hepático para la evaluación farmacocinética y toxicológica de fármacos

El bioensayo de células Caco-2 para la biodisponibilidad de hierro (Fe) representa un enfoque rentable y versátil para evaluar la biodisponibilidad de Fe de alimentos, productos alimenticios, suplementos, comidas e incluso regímenes dietéticos. Completamente validado para estudios en humanos, representa el estado del arte para estudios de biodisponibilidad de Fe.

El bioensayo de células Caco-2 para la medición de la biodisponibilidad de hierro en los alimentos

Aprenda a estudiar el transporte de lípidos en el intestino usando células Caco-2 diferenciadas. Este método permite aislar lipoproteínas mediante ultracentrifugación y analizar su tamaño para comprender la absorción de nutrientes.

El uso de células Caco-2 para el Estudio de lípidos Transporte por el Intestino

Explorar más videos