Plásmido derivado de ADN Strand Displacement Puertas de Redes de reacción de Ejecución Química
November 25th, 2015
Este protocolo describe un método para derivar puertas de desplazamiento de cadenas de ADN a partir de plásmidos y probarlas utilizando mediciones de cinética de fluorescencia. Las puertas se pueden componer modularmente en sistemas de múltiples componentes para aproximar el comportamiento de las redes formales de reacción química (CRN), lo que demuestra un nuevo uso para las CRN como lenguaje de programación molecular.
El objetivo general de este procedimiento es derivar puertas de desplazamiento de cadenas de ADN a partir de plásmidos bacterianos. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza el plásmido bacteriano como fuente de alta pureza para generar puertas de ADN robustas. Para demostrar este procedimiento estaremos mis colegas Sam Dip y yo: Para comenzar la producción en masa y luego aislar las puertas de ADN contenedoras mediante el uso de kits de aislamiento de ADN como se describe en el protocolo de texto adjunto y de acuerdo con las instrucciones del fabricante siguiendo ellucian.
Mida la concentración de ADN plasmídico utilizando técnicas estándar. A continuación, digiere el ADN añadiendo cuatro unidades de la enzima de restricción PV U2 HF por cada miligramo del plásmido. A continuación, agregue dos volúmenes equivalentes de etanol absoluto helado a la muestra.
Incubar la mezcla a menos 80 grados centígrados durante al menos una hora para precipitar el ADN. A continuación, granule el ADN precipitado centrifugando la muestra a 10.000 a 14.000 veces G y cero grados Celsius durante 30 minutos. Retire el SNAT y agregue 1000 microlitros de etanol al 95% a temperatura ambiente a la muestra.
A continuación, invierta la muestra de 10 a 15 veces, centrifugar la muestra a 10.000 a 14.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Cuando termines, retira el sobrenadante y seca el ADN al aire en un banco durante 10 a 20 minutos. Al eliminar el sobrenadante del ADN precipitado, tenga cuidado de no alterar la peleta o el rendimiento disminuirá significativamente.
Una vez seco, vuelva a suspender el pellet de ADN en hasta 200 microlitros de agua libre de nucleasas y vórtice para mezclar. Agregar más de 200 microlitros de agua generalmente hará que la muestra se diluya para su uso. En los experimentos cinéticos, mida el ADN resuspendido con un espectrofotómetro siguiendo las instrucciones del fabricante.
A continuación, añada cuatro unidades de la enzima de corte M-B-B-S-R-D, una por cada microgramo de plásmido, y añada el tampón enzimático correspondiente. Incubar la muestra a 65 grados centígrados durante una hora para digerir las compuertas articulares. A continuación, digiera las compuertas de la horquilla agregando ocho unidades de la enzima de corte NT BST mb uno por un microgramo de plásmido y el tampón enzimático correspondiente.
Incubar la muestra a 55 grados centígrados durante una hora. Para preparar los reporteros fluorescentes, primero Resus, suspenda y cuantifique las muestras como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, mezcle 10 microlitros de la hebra inferior de los reporteros con 13 microlitros de la hebra superior del extintorador en tampón EDTA de acetato tris con 12,5 milimolares de magnesio.
Para asegurar que toda la flora, se enfríen cuatro hebras etiquetadas, se debe agregar un 30% de exceso de la hebra etiquetada con extinción. A continuación, analice el complejo reportero C utilizando un termociclador. Enfríe la muestra de 95 grados Celsius a 20 grados Celsius a una velocidad de un grado Celsius por minuto.
Cuando terminó, almacene la muestra a cuatro grados centígrados después de la calibración. Comience las mediciones de fluorescencia ajustando primero el controlador de temperatura a 25 grados Celsius mientras la temperatura se estabiliza. Configure los parámetros adecuados para las mediciones cinéticas en el software de adquisición de datos.
Después de abrir el software para el fluorímetro espectral, establezca el ancho de deslizamiento en 2,73 nanómetros tanto para el monocromo de excitación como para el de emisión. A continuación, establezca el tiempo de integración en 10 segundos para cada punto de tiempo 62 y establezca el tiempo total de medición en 24 horas. Por último, ajuste las longitudes de onda de excitación y emisión para que coincidan con el bosque de flora utilizado en el experimento.
A continuación, agregue 410,2 microlitros de agua libre de nucleasas y 52,8 microlitros de tampón EDTA de acetato extra que contiene 125 milimolares de magnesio a una celda de cuarzo sintético. También agregue dos microlitros de 300 milimolares de hebras Poly T y luego agite la celda de cuarzo sintético durante 10 a 15 segundos. A continuación, a los nueve microlitros de las hebras reporteras a 10 micromolares y a los seis microlitros de cada hebra auxiliar a 10 micromolares.
Luego, a 45 microlitros de las compuertas de la junta y de la horquilla en un micromolar y mezcle suavemente la solución pipeteándola hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces. Finalmente, a nueve microlitros de sulfato ductal al 10% de sodio para lograr una concentración final de 0.15%SDS, mezcle suavemente la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces, coloque inmediatamente las celdas de un cuarto de galón sintéticas en la cámara del fluter de espectros e inicie la medición cinética. Después de cinco minutos de medición, agregue tres microlitros de las hebras de entrada.
Agregue 10 micromolares a la celda sintética de cuarto de galón. Mientras el programa de adquisición de datos está en pausa, mezcle suavemente la reacción pipeteándola hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces, y luego cierre la cubierta de luz y continúe registrando la cinética de la reacción hasta que se estabilice. Los datos cinéticos de estado para las puertas derivadas del plasma y las puertas sintetizadas se muestran aquí en los experimentos.
La concentración de la hebra de señal A es fija mientras que la cantidad de la señal catalítica B es variable. La señal C se utiliza para leer el progreso de la reacción sin interrumpir. La rotación del ciclo catalítico se define como la cantidad de señal C producida para cada catalizador B en un momento dado.
Para un sistema catalítico ideal, este número de rotación debe aumentar linealmente con el tiempo y ser independiente de la cantidad de catalizador, siempre que el sustrato no sea limitante. Aquí se observa que el sistema sintetizado se desvía del aumento lineal ideal del recambio mucho antes que el sistema derivado del plasma, lo que indica el secuestro del catalizador a través de una reacción secundaria indeseable. Aquí se compara la fuga del circuito de las puertas derivadas del plasma y sintetizadas, y se observa que la relación de la señal de fuga utilizando puertas derivadas del plasma es aproximadamente un 8% menor que la que utiliza las puertas sintetizadas después de 10 horas de reacción.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar puertas de ADN robustas a partir de plásmidos bacterianos y probar las puertas utilizando mediciones cinéticas de fluorescencia.
Visión general
Este protocolo describe un método para derivar puertas de desplazamiento de cadena de ADN a partir de plásmidos bacterianos y probarlas mediante mediciones de cinética de fluorescencia. El enfoque permite la composición modular de puertas en sistemas de múltiples componentes, simulando el comportamiento de redes de reacciones químicas formales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biotecnología
- Biología Molecular
- Biología de Sistemas
Antecedentes
- Las puertas de desplazamiento de cadena de ADN son esenciales para la programación molecular.
- Los plásmidos bacterianos sirven como una fuente pura para generar puertas de ADN robustas.
- Las mediciones de cinética de fluorescencia proporcionan información sobre el rendimiento de las puertas.
- Entender el comportamiento de estas puertas puede mejorar el diseño de circuitos moleculares.
Propósito del estudio
- Derivar puertas de desplazamiento de cadena de ADN a partir de plásmidos bacterianos.
- Demostrar el uso de cinética de fluorescencia en la prueba de estas puertas.
- Comparar el rendimiento de las puertas derivadas de plásmidos con las puertas sintetizadas.
Métodos utilizados
- Aislamiento y cuantificación del ADN plasmídico.
- Digestión del ADN utilizando enzimas de restricción.
- Preparación de reporteros fluorescentes y sus complejos.
- Mediciones de cinética de fluorescencia para analizar el rendimiento de las puertas.
Principales resultados
- Las puertas derivadas de plásmidos demostraron una menor fuga de circuito en comparación con las puertas sintetizadas.
- El ciclo de conversión catalítica fue más estable en los sistemas derivados de plásmidos.
- Las mediciones de fluorescencia indicaron diferencias en el rendimiento entre tipos de puertas.
- La robustez de las puertas de ADN se confirmó mediante pruebas repetidas.
Conclusiones
- El protocolo genera y prueba con éxito puertas de ADN a partir de plásmidos.
- Las puertas derivadas de plásmidos exhiben características de rendimiento superiores.
- Este método puede avanzar en el campo de la programación molecular y la biología sintética.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Plasmid-derived DNA strand displacement gates enable scalable, high-fidelity production of programmable DNA components for molecular computation and synthetic biology. This approach addresses the need for robust, reproducible DNA materials in the construction of chemical reaction networks (CRNs) and molecular devices. The method enhances predictive confidence and operational reliability at the interface of discovery biology and molecular engineering.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of molecular logic and reaction pathways using programmable DNA gates.
- Enables biological de-risking by providing high-purity, consistent DNA components for mechanistic studies.
- Supports predictive confidence in molecular network design and functional validation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated DNA gate systems for downstream kinetic and functional assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through plasmid-based DNA sourcing.
- Enables quantitative fluorescence-based readouts for reliable performance benchmarking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with synthetic biology initiatives for programmable molecular therapeutics and diagnostics.
- Provides continuity from molecular design to preclinical validation of DNA-based systems.
- Supports risk-adjusted advancement of programmable molecular platforms.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying robust DNA gates for hypothesis testing, assay development, and molecular network engineering.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of chemical reaction networks and molecular logic circuits.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs for comparative analysis of DNA gate performance.
- Analytics: Provides kinetic measurements and leakage quantification to inform design decisions.
- Translational Research: Supports the development of programmable DNA systems with potential translational applications.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, plasmid-based workflow for repeated DNA gate production across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in molecular network construction.
- Operational Value: Standardizes DNA gate production for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in synthetic biology R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of programmable molecular platforms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, enzymatic processing, and fluorescence kinetics.
- Needs access to plasmid preparation kits, restriction and nicking enzymes, and fluorescence spectrometry infrastructure.
- Demands cross-team standardization of DNA gate preparation and kinetic measurement protocols.
- Adaptation may be needed for different DNA sequences or reaction network designs.
- Potential limitations include enzyme specificity and optimization of reaction conditions for diverse applications.
