Name: Plásmido derivado de ADN Strand Displacement Puertas de Redes de reacción de Ejecución Química (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprende a derivar puertas de desplazamiento de ADN a partir de plásmidos bacterianos y evaluar su rendimiento mediante mediciones de cinética de fluorescencia. Este método avanza la programación molecular y la biología sintética.

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Figuras 1, 2, 3, 4, 6, 8 y Tablas 2, 3, 10, 15, 16 se modifican de la referencia 29. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia (NSF conceder-CCF 1.117.143 y NSF-CCF 1.162.141 de GS). Y.-JC fue apoyado por becas del Gobierno de Taiwán. SDR fue apoyada por el Programa Nacional Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRFP).

<ol><li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat. Chem. 3, 103-113 (2011).</li>
<li>Krishnan, Y., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+based+molecular+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid based molecular devices.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, 3124-3156 (2011).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+strand+displacement+kinetics+using+toehold+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Control of DNA strand displacement kinetics using toehold exchange.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 17303-17314 (2009).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475, 368-372 (2011).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+digital+circuit+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scaling up digital circuit computation with DNA strand displacement cascades.</a> Science. 332, 1196-1201 (2011).</li>
<li>Zadegan, R. M., Jepsen, M. D., Hildebrandt, L. L., Birkedal, V., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+fuzzy+and+boolean+logic+gates+based+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Construction of a fuzzy and boolean logic gates based on DNA.</a> Small. 11, 1811-1817 (2015).</li>
<li>Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+nucleic+acid+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free nucleic acid logic circuits.</a> Science. 314, 1585-1588 (2006).</li>
<li>Zadegan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+4+zeptoliters+switchable+3D+DNA+box+origami%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Construction of a 4 zeptoliters switchable 3D DNA box origami.</a> ACS Nano. 6, 10050-10053 (2012).</li>
<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459, 73-76 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Y., Hariadi, R. F., Choi, H. M., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+DNA+strand-displacement+circuitry+with+DNA+tile+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Integrating DNA strand-displacement circuitry with DNA tile self-assembly.</a> Nat. Commun. 4, (1965).</li>
<li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406, 605-608 (2000).</li>
<li>Green, S. J., Lubrich, D., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+hairpins%3A+fuel+for+autonomous+DNA+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">DNA hairpins: fuel for autonomous DNA devices.</a> Biophys. J. 91, 2966-2975 (2006).</li>
<li>Venkataraman, S., Dirks, R. M., Rothemund, P. W., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autonomous+polymerization+motor+powered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">An autonomous polymerization motor powered by DNA hybridization.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 490-494 (2007).</li>
<li>Green, S. J., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+chemomechanical+cycles%3A+a+mechanism+for+autonomous+molecular+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Coordinated chemomechanical cycles: a mechanism for autonomous molecular motion.</a> Phys. Rev. Lett. 101, 238101(2008).</li>
<li>Omabegho, T., Sha, R., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bipedal+DNA+Brownian+motor+with+coordinated+legs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bipedal DNA Brownian motor with coordinated legs.</a> Science. 324, 67-71 (2009).</li>
<li>Turberfield, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fuel+for+free-running+nanomachines%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA fuel for free-running nanomachines.</a> Phys. Rev. Lett. 90, 118102(2003).</li>
<li>Dirks, R. M., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+amplification+by+hybridization+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Triggered amplification by hybridization chain reaction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 15275-15278 (2004).</li>
<li>Seelig, G., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzed+relaxation+of+a+metastable+DNA+fuel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalyzed relaxation of a metastable DNA fuel.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 12211-12220 (2006).</li>
<li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318, 1121-1125 (2007).</li>
<li>Yin, P., Choi, H. M., Calvert, C. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+biomolecular+self-assembly+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming biomolecular self-assembly pathways.</a> Nature. 451, 318-322 (2008).</li>
<li>Chen, X., Briggs, N., McLain, J. R., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stacking+nonenzymatic+circuits+for+high+signal+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 5386-5391 (2013).</li>
<li>Phillips, A., Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programming+language+for+composable+DNA+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">A programming language for composable DNA circuits.</a> J. R. Soc. Interface. 6, Suppl 4. S419-S436 (2009).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Polo, F., Emmott, S., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+DSD%3A+a+design+and+analysis+tool+for+DNA+strand+displacement+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Visual DSD: a design and analysis tool for DNA strand displacement systems.</a> Bioinformatics. 27, 3211-3213 (2011).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Cardelli, L., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abstractions+for+DNA+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Abstractions for DNA circuit design.</a> J. R. Soc. Interface. 9, 470-486 (2012).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+and+modularity+properties+of+a+non-covalent+DNA+catalytic+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Robustness and modularity properties of a non-covalent DNA catalytic reaction.</a> Nucleic Acids Res. 38, 4182-4197 (2010).</li>
<li>Ducani, C., Kaul, C., Moche, M., Shih, W. M., Hogberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+production+of+%27monoclonal+stoichiometric%27+single-stranded+DNA+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic production of 'monoclonal stoichiometric' single-stranded DNA oligonucleotides.</a> Nat. Methods. 10, 647-652 (2013).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cloning+of+artificial+DNA+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo cloning of artificial DNA nanostructures.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 17626-17631 (2008).</li>
<li>Bhatia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icosahedral+DNA+nanocapsules+by+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Icosahedral DNA nanocapsules by modular assembly.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 4134-4137 (2009).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nat. Nanotechnol. 8, 755-762 (2013).</li>
<li>Arkin, A., Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+functions+in+biochemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Computational functions in biochemical reaction networks.</a> Biophys. J. 67, 560-578 (1994).</li>
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<li>Tyson, J. J., Chen, K. C., Novak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sniffers%2C+buzzers%2C+toggles+and+blinkers%3A+dynamics+of+regulatory+and+signaling+pathways+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sniffers, buzzers, toggles and blinkers: dynamics of regulatory and signaling pathways in the cell.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 15, 221-231 (2003).</li>
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<li>Angluin, D., Aspnes, J., Eisenstat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+population+protocol+for+fast+robust+approximate+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Distrib.+Comput%22%5BJournal%5D)">A simple population protocol for fast robust approximate majority.</a> Distrib. Comput. 21, 87-102 (2008).</li>
<li>Cardelli, L., Csikasz-Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+switch+computes+approximate+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">The cell cycle switch computes approximate majority.</a> Sci. Rep. 2, 656(2012).</li>
<li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUPACK%3A+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> J. Comput. Chem. 32, 170-173 (2011).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. , e253(2007).</li>
<li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+E.+coli+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of E. coli via electroporation.</a> Methods Enzymol. 529, 321-327 (2013).</li>
<li>Nasri, M., Thomas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+the+specificity+of+PvuII+restriction+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Alteration of the specificity of PvuII restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 15, 7677-7687 (1987).</li>
<li>Dalchau, N., Seelig, G., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+design+of+reaction-diffusion+patterns+using+DNA-based+chemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Computing+and+Molecular+Programming%22%5BJournal%5D)">Computational design of reaction-diffusion patterns using DNA-based chemical reaction networks.</a> DNA Computing and Molecular Programming. , 84-99 (2014).</li>
<li>Scalise, D., Schulman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+modular+reaction-diffusion+programs+for+complex+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Designing modular reaction-diffusion programs for complex pattern formation.</a> Technology. 2, 55-66 (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este documento describe un método para derivar puertas ndsDNA a partir de ADN plásmido de alta pureza. Por otra parte, un protocolo se presenta para caracterizar el rendimiento de puerta usando un ensayo de la cinética de fluorescencia. Los datos experimentales muestran que el sistema de plásmido derivado supera a su contraparte sintética incluso si el sistema sintético se ensambla a partir de hebras purificó usando electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Probablemente, el mejor desempeño de puertas plásmido derivado se debe principalmente a la muy alta pureza del ADN biológica. ADN sintético contiene una variedad de errores, en supresiones particulares que resultan en oligonucleótidos de longitud n-1, y dichos productos secundarios son normalmente no se elimina por completo en PAGE o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) procedimientos de purificación. También se observaron mejoras similares a los reportados aquí en un estudio previo de un amplificador de horquilla catalizada que utiliza ADN derivado de fuentes biológicas 21. <p clculo = &quot;jove_content&quot;&gt; Sin embargo, incluso el uso de puertas de plásmido derivado no puede eliminar por completo los errores en el desempeño de puerta, para los que hay al menos dos razones: en primer lugar el exceso de la digestión o la falta de corte de precisión puede conducir a puertas con demasiados muescas o hendiduras en las posiciones equivocadas. En cualquier caso, las puertas son más propensos a participar en reacciones no deseadas. Tales problemas pueden aliviarse mediante la optimización de la cantidad de enzima utilizada (véase la Figura 4). En segundo lugar, en estos experimentos, la mayoría de las entradas y las hebras eran auxiliares ADN sintético y de este modo contenían deleciones y mutaciones. En principio, todas las entradas de una sola hebra y hebras auxiliares también se pueden obtener a partir de ADN fagémido a través de una digestión con enzimas de nicking del genoma viral m13 pre-codificada 26. Tal vez el funcionamiento del circuito se puede mejorar adicionalmente usando ssDNA derivado del genoma bacteriano. Mientras que se encontró el uso de puertas de plásmidos derivados para mejorar el rendimiento del circuito, un análisisde los tiempos de procesamiento de coste y reveló que mientras la producción de puertas de plásmido derivado es ligeramente más barato (Tabla 15), se tarda 2-3 veces más largo el tiempo de procesamiento en comparación con el montaje y la purificación de puertas a partir de oligos sintetizados comercialmente (Tabla 16). Los costes primarios de puertas plásmido derivado son la síntesis de genes y el uso de enzimas de restricción. Por 300 pmoles de puertas (suficientes para 15 reacciones en 30 nM), el costo estimado para Únete puertas es de aproximadamente $ 170 y $ 200 para Fork puertas, la diferencia de costos se debe a la utilización de diferentes enzimas mellar. Por el contrario, la síntesis química de los hilos para los mismos costes de compuerta alrededor de $ 260 incluyendo una cuota de purificación PÁGINA. El costo de tiempo principal para puertas plásmido derivado está en el procedimiento de clonación, que, al igual que la síntesis de ADN, puede ser subcontratado a una empresa de síntesis de genes. Sin embargo, una vez ensamblados, puertas plásmido derivado tienen la ventaja de que los plásmidos de acogida fácilmente se pueden replicar unand se puede almacenar en forma de stocks de glicerol bacterianas. Esto hace posible la reutilización de las puertas muchas veces. De cara al futuro, la mejora del rendimiento de las puertas de plásmidos derivados podría permitir a una gama mucho más amplia de la dinámica de los comportamientos que han sido experimentalmente demostrado hasta ahora con ADN CRN. Por ejemplo, la reciente 47,48 trabajo teórico sugiere que los patrones espaciales auto-organizados en la escala macro se pueden realizar con el ADN CRNs a través de un mecanismo de difusión de reacción. El método que aquí se presenta proporciona una ruta viable para la construcción de los componentes moleculares subyacentes para tales materiales de ADN auto-patrones. Aunque difícil, el desarrollo de morfologías escala macro de una manera programable tendría implicaciones significativas en áreas que van desde la investigación de biomateriales para la medicina regenerativa.

La previsibilidad de Watson-Crick ha permitido a la nanotecnología de ADN dinámico para emerger como una forma programable para diseñar dispositivos moleculares con propiedades dinámicas 1,2. En particular, cadena de ADN desplazamiento - una reacción de hibridación competitiva programable - ha demostrado ser un poderoso mecanismo para la ingeniería de sistemas dinámicos de ADN. En una reacción de desplazamiento de cadena de ADN, un oligonucleótido entrante desplaza una &quot;salida&quot; hebra previamente atado de una pareja de unión complementaria. Múltiples tales reacciones pueden ser encadenados juntos en cascadas de reacción de varios pasos con un alto grado de control sobre el orden y el tiempo de reacción individual 3 pasos. ADN cascadas de desplazamiento de cadena se han utilizado para crear circuitos digitales y analógicas moleculares 4-7, 8-10 nanoestructuras conmutables, motores moleculares autónomas 11-15, y amplificadores catalíticos no covalentes 13,16-21. Por otra parte, DDispositivos NA utilizando reacciones de desplazamiento de hebra se pueden simular y diseñados para diversas aplicaciones que usan el ordenador con ayuda de software de diseño 22-24. Actualmente, el ADN sintetizado químicamente sirve como material principal para la nanotecnología de ADN. Sin embargo, los errores en el proceso de la síntesis de ADN, y los oligonucleótidos resultantes imperfectos, se cree que limitar el rendimiento de los dispositivos dinámicos de ADN al causar reacciones secundarias erróneos. Por ejemplo, las reacciones de &quot;fugas&quot; pueden resultar en la liberación de un oligonucleótido de salida incluso en la ausencia de un disparador de reacción. Estos efectos son más evidentes en las cascadas de reacción autocatalíticos donde incluso una cantidad mínima de fuga inicial con el tiempo como resultado la activación completa del 19,20 cascada. Por el contrario, las reacciones a menudo fallan en alcanzar el nivel esperado de activación debido a que algunos componentes no activan incluso en la presencia de la entrada prevista 7,25. Para hacer que el rendimiento de ADN a base denanodispositivos comparables a sus homólogos basados ​​en proteínas biológicas, tales modos de error deben reducirse dramáticamente. Plásmidos bacterianos u otro ADN biológica podrían servir como una fuente relativamente barata de ADN de alta pureza para aplicaciones de la nanotecnología. Grandes cantidades de ADN se pueden generar por la replicación en bacterias y las capacidades de corrección de pruebas intrínsecas de los sistemas vivos asegurar la pureza del ADN resultante. De hecho, varios estudios recientes han reconocido la utilidad potencial de ADN biológico para aplicaciones de la nanotecnología 21,26-28. Sin embargo, la naturaleza completamente de doble hebra de ADN del plásmido hasta ahora ha prohibido su uso como material para la fabricación de dispositivos dinámicos de ADN, que normalmente consisten en múltiples oligonucleótidos y contienen ambos dominios de doble cadena y de cadena sencilla. En un trabajo reciente 29 de este tema fue abordado y una nueva arquitectura de puerta de ADN que se compone principalmente de ADN de doble cadena mellado (ndsDNA) fue introducirre. Es importante destacar que los sistemas de puertas ndsDNA pueden ser diseñados que dan cuenta de la dinámica especificados por cualquier red reacción química formales (CRN) 29. puertas ndsDNA tanto, se podrían utilizar, en principio, para crear sistemas dinámicos que presentan oscilaciones y caos, biestabilidad y la memoria, la lógica de Boole o comportamientos algorítmicos 30-38. Por ejemplo, Ref. 29 demostraron una CRN de tres reacción que proporciona una implementación molecular de un protocolo de &quot;consenso&quot;, un tipo de algoritmo de computación distribuida 29,39,40. Este trabajo demuestra por primera vez un nuevo uso para el formalismo CRN como un &quot;lenguaje de programación&quot; para sintetizar rápidamente los sistemas moleculares funcionales (Figura 1). Aquí, se proporciona un protocolo detallado para derivar puertas ndsDNA de ADN plásmido. Primero es una revisión del proceso de diseño de la secuencia. Luego sigue una explicación de cómo oligonucleótidos sintéticos que contienenlas secuencias de compuerta se clonaron en plásmidos y la secuencia verificados y amplificados a través de cultivo bacteriano. A continuación, se muestra cómo ndsDNA puertas se pueden derivar de los plásmidos mediante procesamiento enzimático (véase la Figura 2). Finalmente, un método para probar el comportamiento puerta utilizando ensayos de cinética de fluorescencia se describe. Mecanismo de reacción Como ejemplo, el protocolo se centra en el catalítica reacción química A + B-&gt; B + C. La especie A, B, y C (&quot;señales&quot;, Figura 1B) todos corresponden a una molécula de ADN de una sola hebra diferente. Las secuencias de estas moléculas son completamente independientes y las hebras no reaccionan entre sí directamente. Las secuencias de todas las señales tienen dos dominios funcionales diferentes, es decir, subsecuencias que actúan juntos en reacciones de desplazamiento de hebra: 1) un dominio de punto de apoyo corto (etiquetas ta, tb, tc) que se utiliza para la iniciación de desplazamiento de cadena reaction, y 2) un dominio de largo (etiquetas a, b, c) que determina la identidad de la señal. Las interacciones entre los hilos de señal están mediadas por ADN (ndsDNA) complejos de puerta de doble cadena con muescas (llamados Únete AB y Tenedor aC) y las especies de cadena sencilla auxiliares (&lt;tr r&gt;, &lt;b tr&gt;, &lt;c tb&gt; y &lt;i tc &gt;). La reacción A + B- formales&gt; B + C se ejecuta a través de una serie de etapas de reacción de desplazamiento de cadena, donde cada paso de reacción expone un punto de apoyo para una reacción posterior (Figura 1B). En este ejemplo, las señales A y B son inicialmente libre en solución, mientras que la señal C está unido a la puerta de tenedor. Al final de la reacción B y C están en solución. De manera más general, las señales que están obligados a una puerta están inactivas mientras que las señales que están libres en solución son activos, es decir, que pueden participar en una reacción de desplazamiento de cadena comouna entrada. El curso temporal de la reacción se sigue utilizando una estrategia de indicador fluorescente (Figura 1C). En un trabajo anterior 29, se demostró que este mecanismo de reacción no sólo da cuenta de la estequiometría correcta, sino también la cinética de la reacción objetivo.

<table><tbody><tr><td>Phusion Mezcla Maestra de PCR de Alta Fidelidad con Tampón HF</td><td>NEB</td><td>M0531S</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>PstI-HF</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Terrificante,</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0918-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación QIAprep Spin (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Hispeed Maxi-prep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>Nb.BsrDI</td><td>NEB</td><td>R0648L</td><td></td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>NEB</td><td>R0607L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloques genómicos de doble cadena</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorímetro Fluorolog-3</td><td>Horiba / Jobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células de cuarzo sintético &nbsp;</td><td>Starna</td><td>23-5.45-S0G-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Kit de Extracción de Gel</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Esqueletos de plásmidos</td><td>BioBrick</td><td>E0240-pSB1A2</td><td>Plásmido de alto número de copias con resistencia a la ampicilina. La secuencia se puede encontrar en http://parts.igem.org</td></tr></tbody></table>

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Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

La nanotecnología de ADN requiere grandes cantidades de ADN altamente puro como material de ingeniería. El ADN plasmídico podría satisfacer esta necesidad, ya que se replica con alta fidelidad, se amplifica fácilmente a través del cultivo bacteriano y puede almacenarse indefinidamente en forma de reservas de glicerol bacteriano. Sin embargo, la naturaleza bicatenaria del ADN plásmido ha dificultado hasta ahora su uso eficiente para la construcción de nanoestructuras de ADN o dispositivos que normalmente contienen dominios monocatenarios o ramificados. En un trabajo reciente, se descubrió que las puertas de desplazamiento de la hebra de ADN bicatenario (ndsDNA) mellados podrían provenir del ADN plasmídico. El siguiente es un protocolo que detalla cómo estas puertas ndsDNA se pueden codificar de manera eficiente en plásmidos y se pueden derivar de los plásmidos a través de un pequeño número de pasos de procesamiento enzimático. También se proporciona un protocolo para probar las puertas de ndsDNA utilizando mediciones de cinética de fluorescencia. Las puertas de NdsDNA se pueden utilizar para implementar redes de reacciones químicas arbitrarias (CRN) y, por lo tanto, proporcionar un camino hacia el uso del formalismo CRN como lenguaje de programación molecular prescriptivo. Para demostrar esta tecnología, se construye una cascada de reacción de varios pasos con cinética catalítica. Además, se ha demostrado que los componentes derivados de plásmidos funcionan mejor que los componentes idénticos ensamblados a partir de ADN sintético.

Este protocolo describe un método para derivar puertas de desplazamiento de cadenas de ADN a partir de plásmidos y probarlas utilizando mediciones de cinética de fluorescencia. Las puertas se pueden componer modularmente en sistemas de múltiples componentes para aproximar el comportamiento de las redes formales de reacción química (CRN), lo que demuestra un nuevo uso para las CRN como lenguaje de programación molecular.

Plásmido derivado de ADN Strand Displacement Puertas de Redes de reacción de Ejecución Química

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

El objetivo general de este procedimiento es derivar puertas de desplazamiento de cadenas de ADN a partir de plásmidos bacterianos. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza el plásmido bacteriano como fuente de alta pureza para generar puertas de ADN robustas. Para demostrar este procedimiento estaremos mis colegas Sam Dip y yo: Para comenzar la producción en masa y luego aislar las puertas de ADN contenedoras mediante el uso de kits de aislamiento de ADN como se describe en el protocolo de texto adjunto y de acuerdo con las instrucciones del fabricante siguiendo ellucian.Mida la concentración de ADN plasmídico utilizando técnicas estándar. A continuación, digiere el ADN añadiendo cuatro unidades de la enzima de restricción PV U2 HF por cada miligramo del plásmido. A continuación, agregue dos volúmenes equivalentes de etanol absoluto helado a la muestra.Incubar la mezcla a menos 80 grados centígrados durante al menos una hora para precipitar el ADN. A continuación, granule el ADN precipitado centrifugando la muestra a 10.000 a 14.000 veces G y cero grados Celsius durante 30 minutos. Retire el SNAT y agregue 1000 microlitros de etanol al 95% a temperatura ambiente a la muestra.A continuación, invierta la muestra de 10 a 15 veces, centrifugar la muestra a 10.000 a 14.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Cuando termines, retira el sobrenadante y seca el ADN al aire en un banco durante 10 a 20 minutos. Al eliminar el sobrenadante del ADN precipitado, tenga cuidado de no alterar la peleta o el rendimiento disminuirá significativamente.Una vez seco, vuelva a suspender el pellet de ADN en hasta 200 microlitros de agua libre de nucleasas y vórtice para mezclar. Agregar más de 200 microlitros de agua generalmente hará que la muestra se diluya para su uso. En los experimentos cinéticos, mida el ADN resuspendido con un espectrofotómetro siguiendo las instrucciones del fabricante.A continuación, añada cuatro unidades de la enzima de corte M-B-B-S-R-D, una por cada microgramo de plásmido, y añada el tampón enzimático correspondiente. Incubar la muestra a 65 grados centígrados durante una hora para digerir las compuertas articulares. A continuación, digiera las compuertas de la horquilla agregando ocho unidades de la enzima de corte NT BST mb uno por un microgramo de plásmido y el tampón enzimático correspondiente.Incubar la muestra a 55 grados centígrados durante una hora. Para preparar los reporteros fluorescentes, primero Resus, suspenda y cuantifique las muestras como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, mezcle 10 microlitros de la hebra inferior de los reporteros con 13 microlitros de la hebra superior del extintorador en tampón EDTA de acetato tris con 12,5 milimolares de magnesio.Para asegurar que toda la flora, se enfríen cuatro hebras etiquetadas, se debe agregar un 30% de exceso de la hebra etiquetada con extinción. A continuación, analice el complejo reportero C utilizando un termociclador. Enfríe la muestra de 95 grados Celsius a 20 grados Celsius a una velocidad de un grado Celsius por minuto.Cuando terminó, almacene la muestra a cuatro grados centígrados después de la calibración. Comience las mediciones de fluorescencia ajustando primero el controlador de temperatura a 25 grados Celsius mientras la temperatura se estabiliza. Configure los parámetros adecuados para las mediciones cinéticas en el software de adquisición de datos.Después de abrir el software para el fluorímetro espectral, establezca el ancho de deslizamiento en 2,73 nanómetros tanto para el monocromo de excitación como para el de emisión. A continuación, establezca el tiempo de integración en 10 segundos para cada punto de tiempo 62 y establezca el tiempo total de medición en 24 horas. Por último, ajuste las longitudes de onda de excitación y emisión para que coincidan con el bosque de flora utilizado en el experimento.A continuación, agregue 410,2 microlitros de agua libre de nucleasas y 52,8 microlitros de tampón EDTA de acetato extra que contiene 125 milimolares de magnesio a una celda de cuarzo sintético. También agregue dos microlitros de 300 milimolares de hebras Poly T y luego agite la celda de cuarzo sintético durante 10 a 15 segundos. A continuación, a los nueve microlitros de las hebras reporteras a 10 micromolares y a los seis microlitros de cada hebra auxiliar a 10 micromolares.Luego, a 45 microlitros de las compuertas de la junta y de la horquilla en un micromolar y mezcle suavemente la solución pipeteándola hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces. Finalmente, a nueve microlitros de sulfato ductal al 10% de sodio para lograr una concentración final de 0.15%SDS, mezcle suavemente la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces, coloque inmediatamente las celdas de un cuarto de galón sintéticas en la cámara del fluter de espectros e inicie la medición cinética. Después de cinco minutos de medición, agregue tres microlitros de las hebras de entrada.Agregue 10 micromolares a la celda sintética de cuarto de galón. Mientras el programa de adquisición de datos está en pausa, mezcle suavemente la reacción pipeteándola hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces, y luego cierre la cubierta de luz y continúe registrando la cinética de la reacción hasta que se estabilice. Los datos cinéticos de estado para las puertas derivadas del plasma y las puertas sintetizadas se muestran aquí en los experimentos.La concentración de la hebra de señal A es fija mientras que la cantidad de la señal catalítica B es variable. La señal C se utiliza para leer el progreso de la reacción sin interrumpir. La rotación del ciclo catalítico se define como la cantidad de señal C producida para cada catalizador B en un momento dado.Para un sistema catalítico ideal, este número de rotación debe aumentar linealmente con el tiempo y ser independiente de la cantidad de catalizador, siempre que el sustrato no sea limitante. Aquí se observa que el sistema sintetizado se desvía del aumento lineal ideal del recambio mucho antes que el sistema derivado del plasma, lo que indica el secuestro del catalizador a través de una reacción secundaria indeseable. Aquí se compara la fuga del circuito de las puertas derivadas del plasma y sintetizadas, y se observa que la relación de la señal de fuga utilizando puertas derivadas del plasma es aproximadamente un 8% menor que la que utiliza las puertas sintetizadas después de 10 horas de reacción.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar puertas de ADN robustas a partir de plásmidos bacterianos y probar las puertas utilizando mediciones cinéticas de fluorescencia.

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Investigación

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Plásmido derivado de ADN Strand Displacement Puertas de Redes de reacción de Ejecución Química

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