Plásmido derivado de ADN Strand Displacement Puertas de Redes de reacción de Ejecución Química
25 de noviembre de 2015
Este protocolo describe un método para derivar puertas de desplazamiento de cadenas de ADN a partir de plásmidos y probarlas utilizando mediciones de cinética de fluorescencia. Las puertas se pueden componer modularmente en sistemas de múltiples componentes para aproximar el comportamiento de las redes formales de reacción química (CRN), lo que demuestra un nuevo uso para las CRN como lenguaje de programación molecular.
El objetivo general de este procedimiento es derivar puertas de desplazamiento de cadenas de ADN a partir de plásmidos bacterianos. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza el plásmido bacteriano como fuente de alta pureza para generar puertas de ADN robustas. Para demostrar este procedimiento estaremos mis colegas Sam Dip y yo: Para comenzar la producción en masa y luego aislar las puertas de ADN contenedoras mediante el uso de kits de aislamiento de ADN como se describe en el protocolo de texto adjunto y de acuerdo con las instrucciones del fabricante siguiendo ellucian.
Mida la concentración de ADN plasmídico utilizando técnicas estándar. A continuación, digiere el ADN añadiendo cuatro unidades de la enzima de restricción PV U2 HF por cada miligramo del plásmido. A continuación, agregue dos volúmenes equivalentes de etanol absoluto helado a la muestra.
Incubar la mezcla a menos 80 grados centígrados durante al menos una hora para precipitar el ADN. A continuación, granule el ADN precipitado centrifugando la muestra a 10.000 a 14.000 veces G y cero grados Celsius durante 30 minutos. Retire el SNAT y agregue 1000 microlitros de etanol al 95% a temperatura ambiente a la muestra.
A continuación, invierta la muestra de 10 a 15 veces, centrifugar la muestra a 10.000 a 14.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Cuando termines, retira el sobrenadante y seca el ADN al aire en un banco durante 10 a 20 minutos. Al eliminar el sobrenadante del ADN precipitado, tenga cuidado de no alterar la peleta o el rendimiento disminuirá significativamente.
Una vez seco, vuelva a suspender el pellet de ADN en hasta 200 microlitros de agua libre de nucleasas y vórtice para mezclar. Agregar más de 200 microlitros de agua generalmente hará que la muestra se diluya para su uso. En los experimentos cinéticos, mida el ADN resuspendido con un espectrofotómetro siguiendo las instrucciones del fabricante.
A continuación, añada cuatro unidades de la enzima de corte M-B-B-S-R-D, una por cada microgramo de plásmido, y añada el tampón enzimático correspondiente. Incubar la muestra a 65 grados centígrados durante una hora para digerir las compuertas articulares. A continuación, digiera las compuertas de la horquilla agregando ocho unidades de la enzima de corte NT BST mb uno por un microgramo de plásmido y el tampón enzimático correspondiente.
Incubar la muestra a 55 grados centígrados durante una hora. Para preparar los reporteros fluorescentes, primero Resus, suspenda y cuantifique las muestras como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, mezcle 10 microlitros de la hebra inferior de los reporteros con 13 microlitros de la hebra superior del extintorador en tampón EDTA de acetato tris con 12,5 milimolares de magnesio.
Para asegurar que toda la flora, se enfríen cuatro hebras etiquetadas, se debe agregar un 30% de exceso de la hebra etiquetada con extinción. A continuación, analice el complejo reportero C utilizando un termociclador. Enfríe la muestra de 95 grados Celsius a 20 grados Celsius a una velocidad de un grado Celsius por minuto.
Cuando terminó, almacene la muestra a cuatro grados centígrados después de la calibración. Comience las mediciones de fluorescencia ajustando primero el controlador de temperatura a 25 grados Celsius mientras la temperatura se estabiliza. Configure los parámetros adecuados para las mediciones cinéticas en el software de adquisición de datos.
Después de abrir el software para el fluorímetro espectral, establezca el ancho de deslizamiento en 2,73 nanómetros tanto para el monocromo de excitación como para el de emisión. A continuación, establezca el tiempo de integración en 10 segundos para cada punto de tiempo 62 y establezca el tiempo total de medición en 24 horas. Por último, ajuste las longitudes de onda de excitación y emisión para que coincidan con el bosque de flora utilizado en el experimento.
A continuación, agregue 410,2 microlitros de agua libre de nucleasas y 52,8 microlitros de tampón EDTA de acetato extra que contiene 125 milimolares de magnesio a una celda de cuarzo sintético. También agregue dos microlitros de 300 milimolares de hebras Poly T y luego agite la celda de cuarzo sintético durante 10 a 15 segundos. A continuación, a los nueve microlitros de las hebras reporteras a 10 micromolares y a los seis microlitros de cada hebra auxiliar a 10 micromolares.
Luego, a 45 microlitros de las compuertas de la junta y de la horquilla en un micromolar y mezcle suavemente la solución pipeteándola hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces. Finalmente, a nueve microlitros de sulfato ductal al 10% de sodio para lograr una concentración final de 0.15%SDS, mezcle suavemente la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces, coloque inmediatamente las celdas de un cuarto de galón sintéticas en la cámara del fluter de espectros e inicie la medición cinética. Después de cinco minutos de medición, agregue tres microlitros de las hebras de entrada.
Agregue 10 micromolares a la celda sintética de cuarto de galón. Mientras el programa de adquisición de datos está en pausa, mezcle suavemente la reacción pipeteándola hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces, y luego cierre la cubierta de luz y continúe registrando la cinética de la reacción hasta que se estabilice. Los datos cinéticos de estado para las puertas derivadas del plasma y las puertas sintetizadas se muestran aquí en los experimentos.
La concentración de la hebra de señal A es fija mientras que la cantidad de la señal catalítica B es variable. La señal C se utiliza para leer el progreso de la reacción sin interrumpir. La rotación del ciclo catalítico se define como la cantidad de señal C producida para cada catalizador B en un momento dado.
Para un sistema catalítico ideal, este número de rotación debe aumentar linealmente con el tiempo y ser independiente de la cantidad de catalizador, siempre que el sustrato no sea limitante. Aquí se observa que el sistema sintetizado se desvía del aumento lineal ideal del recambio mucho antes que el sistema derivado del plasma, lo que indica el secuestro del catalizador a través de una reacción secundaria indeseable. Aquí se compara la fuga del circuito de las puertas derivadas del plasma y sintetizadas, y se observa que la relación de la señal de fuga utilizando puertas derivadas del plasma es aproximadamente un 8% menor que la que utiliza las puertas sintetizadas después de 10 horas de reacción.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar puertas de ADN robustas a partir de plásmidos bacterianos y probar las puertas utilizando mediciones cinéticas de fluorescencia.
Descripción general
Este protocolo describe un método para obtener compuertas de desplazamiento de cadena de ADN a partir de plásmidos bacterianos y probarlas mediante mediciones de cinética de fluorescencia. El enfoque permite la composición modular de compuertas en sistemas de múltiples componentes, simulando el comportamiento de redes formales de reacciones químicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biotecnología
- Biología molecular
- Biología de sistemas
Antecedentes
- Las compuertas de desplazamiento de hebra de ADN son esenciales para la programación molecular.
- Los plásmidos bacterianos sirven como fuente pura para generar compuertas de ADN robustas.
- Las mediciones de cinética de fluorescencia proporcionan información sobre el rendimiento de las compuertas.
- Comprender el comportamiento de estas compuertas puede mejorar el diseño de circuitos moleculares.
Objetivo del estudio
- Obtener compuertas de desplazamiento de cadena de ADN a partir de plásmidos bacterianos.
- Mostrar el uso de la cinética de fluorescencia en la evaluación de estas compuertas.
- Comparar el rendimiento de las compuertas derivadas de plásmidos con las compuertas sintetizadas.
Métodos Utilizados
- Aislamiento y cuantificación de ADN plasmídico.
- Digestión de ADN mediante enzimas de restricción.
- Preparación de reporteros fluorescentes y sus complejos.
- Mediciones de cinética de fluorescencia para analizar el rendimiento de las compuertas.
Resultados principales
- Las compuertas derivadas de plásmidos mostraron una menor fuga del circuito en comparación con las compuertas sintetizadas.
- La renovación del ciclo catalítico fue más estable en los sistemas derivados de plásmidos.
- Las mediciones de fluorescencia indicaron diferencias en el rendimiento entre los tipos de compuertas.
- Se confirmó la robustez de las compuertas de ADN mediante pruebas repetidas.
Conclusiones
- El protocolo genera y prueba con éxito compuertas de ADN a partir de plásmidos.
- Las compuertas derivadas de plásmidos presentan características de rendimiento superiores.
- Este método puede impulsar el campo de la programación molecular y la biología sintética.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las compuertas de desplazamiento de hebra de ADN derivadas de plásmidos permiten la producción escalable y de alta fidelidad de componentes de ADN programables para la computación molecular y la biología sintética. Este enfoque aborda la necesidad de materiales de ADN robustos y reproducibles en la construcción de redes de reacciones químicas (CRNs) y dispositivos moleculares. El método mejora la confianza predictiva y la fiabilidad operativa en la interfaz entre la biología del descubrimiento y la ingeniería molecular.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Facilita la interrogación de la lógica molecular y las vías de reacción mediante compuertas de ADN programables.
- Permite la reducción de riesgos biológicos al proporcionar componentes de ADN de alta pureza y consistencia para estudios mecanicistas.
- Apoya la confianza predictiva en el diseño de redes moleculares y la validación funcional.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara sistemas de puertas de ADN validados para ensayos cinéticos y funcionales posteriores.
- Mejora la reproducibilidad y la estandarización del ensayo mediante el uso de plásmidos como fuente de ADN.
- Permite lecturas cuantitativas basadas en fluorescencia para una evaluación de rendimiento confiable.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con iniciativas de biología sintética para terapéuticos y diagnósticos moleculares programables.
- Proporciona continuidad desde el diseño molecular hasta la validación preclínica de sistemas basados en ADN.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de plataformas moleculares programables.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al proporcionar compuertas de ADN robustas para la comprobación de hipótesis, el desarrollo de ensayos y la ingeniería de redes moleculares.
- Biología del Descubrimiento: Permite pruebas basadas en hipótesis de redes de reacciones químicas y circuitos lógicos moleculares.
- Selección: Proporciona salidas cuantitativas reproducibles de fluorescencia para el análisis comparativo del rendimiento de las compuertas de ADN.
- Análisis: Ofrece mediciones cinéticas y cuantificación de fugas para orientar las decisiones de diseño.
- Investigación Traducional: Apoya el desarrollo de sistemas de ADN programables con posibles aplicaciones traslacionales.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo escalable basado en plásmidos para la producción repetida de compuertas de ADN en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la construcción de redes moleculares.
- Valor operativo: Estandariza la producción de compuertas de ADN para lograr reproductibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital en I+D de biología sintética.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de plataformas moleculares programables.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular, procesamiento enzimático y cinética de fluorescencia.
- Necesita acceso a kits de preparación de plásmidos, enzimas de restricción y de mella (nicking), e infraestructura para espectrometría de fluorescencia.
- Exige estandarización entre equipos en los protocolos de preparación de compuertas de ADN y de medición cinética.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes secuencias de ADN o diseños de redes de reacción.
- Entre las limitaciones potenciales se incluyen la especificidad enzimática y la optimización de las condiciones de reacción para diversas aplicaciones.
