Microentornos-Sandwich como para aprovechar Celulares / Materiales Interacciones

El objetivo general de este procedimiento es ensamblar cultivos tipo sándwich para estudiar el comportamiento de las células dentro de un entorno 3D más fisiológicamente relevante. Esto se logra primero preparando y recubriendo los sustratos ventral y dorsal con proteínas como la fibronectina. A continuación, las células se colocan de forma similar a un cultivo 2D estándar.

Luego, el sustrato dorsal se superpone para que las células se estimulen ventral y dorsalmente. Por último, se pueden llevar a cabo experimentos como un ensayo de cicatrización de heridas. En última instancia, los cultivos tipo sándwich se analizan mediante procedimientos ya desarrollados para cultivos 2D estándar, como imágenes en vivo, inmunofluorescencia o extracción celular.

Para un análisis más detallado. La principal ventaja de esta técnica cultural sobre los sistemas tridimensionales existentes es que permitió el estudio de diferentes parámetros en las interacciones de los materiales, como la topografía, la química, la rigidez y el contenido de proteínas tanto en el sitio ventral como en el dorsal, ofreciendo un alto grado de versatilidad. Además de los procedimientos experimentales que podrían verse obstaculizados para algunos sistemas tridimensionales como la lipina, la inmunofluorescencia y las extracciones celulares se realizan fácilmente Para producir una película plana de ácido poliláctico o PLLA por fundición con solvente trabajando en una campana extractora, agregue dos gramos de PLLA a 100 mililitros de cloroformo y revuelva a temperatura ambiente durante aproximadamente tres horas o hasta que se disuelva por completo.

Coloque arandelas de acero inoxidable en una placa de Petri de vidrio. A continuación, añada 200 microlitros de la solución de PLLA en las lavadoras. Use papel de aluminio con algunos agujeros para cubrir el plato y deje que el PLLA se evapore lentamente a temperatura ambiente durante 30 minutos.

A continuación, calentar las muestras a 120 grados centígrados durante cinco minutos para evaporar cualquier rastro de disolvente. Luego, después de dejar que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos, use 18,2 mega ohmios centímetros de agua para cubrir las muestras en el plato e incubar a temperatura ambiente durante ocho minutos. Después de la incubación, use una cuchilla de afeitar para despegar las arandelas de la placa de Petri.

A continuación, utilice unas pinzas para eliminar cualquier imperfección del borde de las arandelas y deje que las muestras se sequen al aire. Debido a que el PLLA es degradable por hidrólisis, las muestras en vacío se secan hasta el día de los experimentos. Además, las fibras de ELLA se pueden producir de acuerdo con el protocolo de texto y se pueden utilizar como sustrato dorsal bajo una campana de cultivo estéril.

Añadir 20 microgramos por mililitro de FI nin en docos, PBS o DPBS con calcio y magnesio a las muestras y a temperatura ambiente incubada durante una hora después del recubrimiento de proteínas. Use DPBS para lavar las muestras dos veces y almacene en DPBS con P, calcio y magnesio hasta que estén listas para usar, las siguientes células de semilla en la cubierta de vidrio se deslizan e incuban a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante tres horas para permitir que las células se adhieran al sustrato ventral. A continuación, transfiera las muestras a nuevos pocillos de una placa de 12 pocillos.

Con unas pinzas, superponga con cuidado el sustrato dorsal sobre las células. Luego agregue un mililitro de medio. El peso de la arandela evitará que el sustrato dorsal flote.

Regrese las muestras a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono, cambiando el medio dos veces por semana para estudiar la migración celular dentro del cultivo tipo sándwich. Después de recubrir los sustratos ventral y dorsal con fibronectina, como se demostró anteriormente, las células de la semilla en la cubierta de vidrio se deslizan a alta densidad, incuban las muestras y permiten que las células logren la confluencia. A continuación, utilice la punta de una pipeta para rascar la monocapa celular con el fin de crear dos poblaciones celulares separadas por un espacio.

Coloque el sustrato ventral asentado en un nuevo pozo adecuado para la adquisición de lapso de tiempo y lo suficientemente grande como para que los sustratos dorsales quepan dentro. Luego, con pinzas como se demostró anteriormente, superponga el sustrato dorsal sobre las celdas y vuelva a llenar con medio. Coloque la muestra bajo un microscopio de lapso de tiempo y capture imágenes del cierre del espacio cada 20 minutos.

Utilice un software como mito BO de la imagen J para analizar el cierre del espacio en el sándwich. Como la cultura. El sulfato depende en gran medida del momento en que se estimulan los receptores dorsales y de las propiedades de la interacción dorsal.

Al igual que otros sistemas 3D como los hidrogeles, por ejemplo, como se ve aquí, las fibras PLLA electrohiladas dorsales dirigen la alineación celular cuando se recubren con fibronectina, pero no cuando se recubren con una proteína no adhesiva como BSA. Además, los cultivos tipo sándwich con PLLA dorsal simple desencadenaron un aumento en el nivel de miogénesis utilizando células C dos C 12. Esto también depende de los estímulos biológicos dorsales.

Dado que la interacción con diferentes proteínas dorsales da como resultado distintas tasas de diferenciación, como se demuestra en este video, los fibroblastos que migran dentro del cultivo similar al sándwich en un ensayo de cicatrización de heridas, adoptan una morfología alargada y migran distancias más cortas en comparación con las células. Cultivado en sustratos 2D similares a los geles de fibronectina y colágeno 3D. El cultivo tipo sándwich aumenta la reorganización de la ECM mediada por células en comparación con las condiciones 2D.

Este proceso se basa en los estímulos mecánicos dorsales y la estabilidad del citoesqueleto. Dado que el uso de inhibidores de la contractilidad como los BLE, las estatinas obstaculizaron el proceso S Está bien, después de ver este video, debe tener una comprensión clara de cómo ensamblar cultivos similares a sándwiches. Este método puede diseñar un microentorno similar al 3D para la medicina de reacción y el cáncer, incluidas aplicaciones en modelos de enfermedades, estudios de desarrollo y pruebas de medicamentos.