Name: En Mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento Microrheology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Aprende a medir propiedades viscoelásticas de biopelículas bacterianas mediante microrreología de seguimiento de partículas. Esta técnica no destructiva permite analizar la respuesta mecánica de las biopelículas con alta resolución espacial.

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Esta investigación es apoyada por la Fundación Nacional para la Investigación y el Ministerio de Educación de Singapur en virtud de su Centro de Investigación del Programa de Excelencia, las ayudas para la instalación (M4330002.C70) de la Universidad Tecnológica de Nanyang, y ACRF Nivel 2 (MOE2014-T2-2-172) del Ministerio de Educación, Singapur. Los autores agradecen a Joey Yam Kuok Hoong por participar en la manifestación de este protocolo.

1. Biofilm Cultivo <ol><li> Preparación de Cepas bacterianas <ol><li> 1 día antes de la cultivación biofilm, preparar cultivos bacterianos planctónicas mediante la inoculación de 2 ml de medio de crecimiento apropiado de cultivo bacteriano congelado. Utilice medio Luria-Caldo (10 g L -1 NaCl, 10 g de extracto de L -1 levadura y 10 g L -1 triptona) para mucoide P. aeruginosa y sus PEL Δ Δ y PSL mutantes defectuosos. Incubar durante la noche a 37 ° C y 200 rpm de remoción condiciones. Diluir cultivos de una noche a un OD 600 de 0,40 utilizando un espectrofotómetro. </li><li> Ensamble de configuración de celda de flujo, que ha sido descrito previamente 14, preferiblemente en una estación móvil o carro que puede ser llevado a la sala de microscopio para obtener imágenes de la célula de flujo sin necesidad de desmontarlos. </li><li> Preparar el medio de cultivo estéril en 2 L o botellas de 5 litros por cada celda de flujo. Utilice un medio mínimo M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM NH 4 Cl, NaCl 9 mM, 2 mM MgSO 4, y 0,1 mM CaCl 2) suplementado con 0,04% de glucosa (peso / vol) y 0,2% (peso / vol) casaminoácidos) para P. aeruginosa fluya biofilms celulares. </li><li> Microesferas fluorescentes Alícuota en tubos de microcentrífuga y giran en H2O estéril durante 5 min en centrifugar a 9,391.2 g. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de medio de crecimiento para eliminar el sodio azida (desinfectante) antes de añadir al medio de crecimiento en 2 L o 5 botellas medianas L. NOTA: Diferentes tamaños de microesferas vienen en diferentes concentraciones y deben diluirse de acuerdo con las instrucciones. Por ejemplo, dispersar a 120 l de 1,0 micras de diámetro microesferas, 15 l de 0,5 micras microesferas de diámetro y 0,96 l de 0,2 micras de diámetro microesferas en 2 l de medio de crecimiento para dar 2,18 × 10 6 microesferas ml -1 para cada tamaño de partícula. </li><li> Coloque la botella medio a UPSTresma de celda de flujo y permitir que el medio de cultivo fluya a través de la configuración entera. Detenga el flujo e inyectar cultivos de una noche diluidas en cámaras celda de flujo. Permitir que las bacterias se adhieran al sustrato cubreobjetos durante 1 h antes de flujo de medio de crecimiento continua a una velocidad de flujo de aproximadamente 5,5 x 10 -3 m seg -1, o 8 rpm con una bomba peristáltica. NOTA: Las biopelículas son generalmente cultivadas a temperatura ambiente (25 ° C) durante 3-7 días. </li><li> Alternativamente, para la configuración de la cultura estática, diluir cultivos de una noche 100 veces en tubos de microcentrífuga, añadiendo 10 l de cultivo durante la noche a 1 ml de medio de crecimiento con partículas. Aumentar la concentración de partículas en el medio de crecimiento para cultivo estático en aproximadamente 500 veces en comparación con la utilizada para las biopelículas de flujo (por ejemplo, lavar y resuspender 600 l de 1.0 micras esferas de diámetro en 10 ml de medio de crecimiento) como biofilms celda de flujo están constantemente repone con partículas sino culturas estáticas no lo son. <ol><li> Añadir 2001; l de cultivo de una noche se diluyó con partículas a las cámaras de 8 diapositivas así. Se incuba a 37 ° C en condiciones estáticas. Las biopelículas son generalmente cultivadas durante 1 día. Reemplace el medio de cultivo gastado diariamente con medio de cultivo fresco con partículas si biofilm se cultiva desde hace más de 1 día. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Microscopía <ol><li> En el día 3 y 5, apague flujo de la bomba peristáltica y llevar configuración de celda de flujo en la sala de microscopía. Abrazadera de tubo cerca de la entrada y salida de las cámaras de la celda de flujo para prevenir la deriva (una causa error sistemático por los cambios en el medio ambiente) de flujo. Coloque la celda de flujo en la platina del microscopio de un microscopio vertical. NOTA: Utilice un microscopio invertido para obtener imágenes de los pocillos. </li><li> Utilice microscopía de fluorescencia con objetivo 40X aceite para grabar vídeos de movimiento de microesferas embebidas en el biofilm en varios lugares (microcolonias y capas diferenciadas planos) y en diferentes días (día 3 y 5) parainvestigaciones espaciales y temporales. Tome cortos vídeos con una mayor velocidad de fotogramas para investigar los acontecimientos que ocurren en escalas de tiempo cortas (por ejemplo, 1,5-3 vídeos min a velocidad de fotogramas de 25-50 cuadros por segundo para la dinámica de rápidos), y videos más largos con menor velocidad de fotogramas para investigar los acontecimientos en el tiempo más largo escalas (por ejemplo, vídeos de 15-30 min de velocidad de fotogramas de 2.5-5 cuadros / seg para una dinámica más lenta). NOTA: Un video contiene típicamente 5-10 partículas, y es típicamente de 1,0 a 2,5 GB de tamaño de archivo. Microcolonias más grandes pueden contener más partículas. Tome 5-10 vídeos para cada categoría (por ejemplo, 5-10 vídeos de diferentes microcolonias y de diferentes lugares en capas planas indiferenciadas). El biofilm tiene una arquitectura heterogénea que puede consistir en microcolonias, canales, vacíos y las capas planas indiferenciadas. </li><li> Guardar vídeos en formato adecuado que pueden ser leídos por Fiji / ImageJ (por ejemplo CZI, tif). </li><li> Compruebe los vídeos para la deriva desplazándose por vid acabadaeo y la observación de que las partículas no se mueven en la misma dirección al mismo tiempo. Drift puede ser causada por el movimiento z-etapa, las corrientes en la celda de flujo, el desequilibrio de la mesa de anti-vibración, presión de aire o cambios de temperatura. Menor correcta deriva utilizando técnicas de post-procesamiento normalmente se suministran con software microscopio. Deseche todos los vídeos que la deriva no se puede corregir. Registre los siguientes parámetros, que son necesarios durante el análisis de seguimiento de partículas: Resolución (píxeles / um), Número de Marcos, Duración. </li><li> Retire la celda de flujo de platina del microscopio y reinicie la bomba peristáltica para seguir cultivando la biopelícula. </li></ol> 3. Análisis de seguimiento de partículas <ol><li> Obtener trayectorias de las partículas utilizando el plug-in TrackMate en software de código abierto (ImageJ). Descarga Fiji en <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji.</a> Abra el video con Fiji y en el menú Plugins, seleccione Seguimiento y TrackMate. </li><li> Compruebe o ajuste la configuración en °e ventana sugiriendo ajustes iniciales de calibración para que coincida con los parámetros de vídeo como se registra en el paso 2.4. </li><li> Detectar partículas en TrackMate usando ImageJ. <ol><li> Seleccione &#39;detector de log&#39;, diámetro de partícula de entrada y el valor umbral (por ejemplo, 1000). Desplazarse por el video, mientras que al hacer clic en el botón &#39;Vista previa&#39; para comprobar que los círculos morados siguen las partículas a lo largo del vídeo. Ajuste los valores de diámetro y de umbral, según sea necesario: aumentar el valor umbral si círculos de color púrpura aparecen en el espacio vacío. Reducir el valor de umbral si se detectan partículas no suficientes. Haga clic en el botón al lado de completar la detección de las partículas. </li><li> Haga clic en el botón al lado cuando se le presenta la opción para agregar o quitar las partículas detectadas en &#39;umbral inicial&#39;, &#39;Seleccione una vista&#39; y &#39;Seleccionar un filtro&#39; ventanas continúen sin ajuste si la detección inicial de partículas fue satisfactoria. </li><li> Seleccione &#39;rastreador LAP simple&#39; en el optien la barra de &quot;Seleccionar un método de seguimiento&quot; ventana como partículas rara vez se mueven fuera de foco en el biofilm y se realiza un seguimiento fácilmente. Utilice los valores máximo distancia de enlace sugerido o baja y la brecha de cierre automático y haga clic en siguiente. </li><li> Compruebe que el seguimiento de las partículas es satisfactoria desplazándose por el video para ver que las partículas siguen las pistas dibujadas por TrackMate, y que no hay pistas deseadas o faltantes. Saltear las diversas etapas de filtrado. Ir a la última ventana &quot;Seleccione una acción &#39;. Seleccione &#39;pistas de exportación a archivo xml&#39; desde el menú desplegable y haga clic en &quot;Ejecutar&quot;. Elija una carpeta para guardar las pistas. NOTA: Hay varios programas disponibles en el dominio público para el análisis de trayectorias de las partículas y el uso de microrheology. msdanalyzer y TrackArt son ejemplos de partículas seguimiento de programas de análisis que se ejecutan en el entorno Matlab. </li></ol></li><li> Preparar Matlab para importar las trayectorias de las partículas en los archivos xml seleccionando en el menú deMatlab Archivo&gt; Ruta Set ... y poner la carpeta de scripts disponibles con el paquete de Fiji. </li><li> Para analizar las trayectorias de las partículas con msdanalyzer, descargue el enlace al archivo zip o el archivo tar.gz at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> Extraer la carpetamsdanalyzer 15 y colóquelo en una carpeta que pertenece a la ruta de Matlab (por ejemplo C: Documents and Settings &lt;nombre de usuario&gt; Mis documentos Matlab). Comience Matlab e iniciar el analizador escribiendo: ma = msdanalyzer (2, &#39;um&#39;, &#39;s&#39;) donde um y sec son las unidades de espacio y tiempo físicos en el video. <ol><li> Importe las trayectorias de las partículas escribiendo: [pistas, md] = importTrackMateTracks (&#39;nombre_de_archivo.xml&#39;, &#39;Clipz&#39;;, &#39;Scalet&#39;) ma = ma.addAll (pistas); donde &#39;Clipz&#39; elimina la dimensión z un vídeo 2D, y &#39;Scalet&#39;. </li><li> Trazar las trayectorias Onto gráfico usando: ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> Calcular los TME de las partículas usando: ma = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> Trazar los TME de cada partícula: cifra ma.plotMSD </li><li> Combine trayectorias de las partículas de otros vídeos de la misma categery (por ejemplo, partículas incrustadas en microcolonias de tipo salvaje en el día 3) repitiendo 3.5.1.1 a 3.5.1.4). </li><li> Trazar la media del conjunto o de la media de todas las curvas: ma.plotMeanMSD Cambiar el y- y el eje x de lineal a escala logarítmica. En tiempos de retardo largos, las curvas se vuelven MSD ruidoso debido a la insuficiencia de las estadísticas en los plazos más largos. Las curvas de MSD también pueden elevarse abruptamente debido a un error dinámica. Estas regiones de la curva se pueden eliminar mediante el uso de la herramienta de pincelpara seleccionar el final de la curva y seleccionando &#39;El cepillado&#39;&gt; &#39;Eliminar sin cepillar&#39; en el menú Herramientas. </li></ol></li><li> Descarga Ezyfit en <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> y añadir Ezyfit a una carpeta que pertenece a la trayectoria Matlab (por ejemplo C: Documents and Settings &lt;nombre de usuario&gt; Mis documentos Matlab). Instale el menú Ezyfit escribiendo en Matlab espacio de trabajo efmenu instalación. Reinicie MATLAB con el menú Ezyfit en la ventana de la figura. Ajustar las curvas de MSD a la ley de potencia seleccionando en el menú Ezyfit &#39;Mostrar Fit&#39;&gt; &#39;Power&#39;&gt; &#39;a * x ^ n&#39; eran n es el exponente de difusión estimada α. NOTA: msdanalyzer requiere el Curve Fitting Toolbox de Matlab para el ajuste de las curvas de MSD. Ezyfit es una alternativa y el software libre que puede realizar el ajuste de curvas. </li><li> Borrar trayectorias de las partículas actuales y los TME para calcular nuevos TME partículas en otros lugares o tiempo: claro </li&gt; <li> Después del cálculo de varias curvas medias MSD de partículas en un medio (control), y microcolonias y áreas diferenciadas de varias cepas, copiar y pegar las curvas en un gráfico para la comparación. La rigidez de la muestra y aumentar la reticulación con valores más bajos de MSD. Curvas planas tienen menores α y la muestra es más elástica que curvas más pronunciadas con mayor α. </li><li> Seleccione la curva e ir a &quot;Herramientas&quot; para mirar las estadísticas de datos, como la mediana y el rango. El MSD del talón es proporcional a la deformación por fluencia, J (t) del material en el que el cordón está incrustado según la relación, <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> donde J = deformación por fluencia, d = diámetro de las partículas, k B = constante de Boltzman, T = temperatura y t = tiempo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Microrheology es una herramienta útil para las mediciones reológicas locales en sistemas heterogéneos, tales como las biopelículas microbianas. Es una técnica no destructiva, lo que permite la supervisión en tiempo real de los cambios reológicos dentro de la misma muestra biológica a través de múltiples puntos de tiempo. En este protocolo, microrheology partícula de seguimiento se aplicó a Pel y los mutantes de exopolisacáridos Psl el fin de investigar cómo afectan a la elasticidad y la reticulación eficaz de la matriz ...

La mayoría de las células bacterianas son capaces de emplear tanto (sésiles) Modos adjunta a la superficie de crecimiento 1 planctónica (de vida libre) y. En el modo unido a la superficie de crecimiento, las células bacterianas secretan y encierran a sí mismos en grandes cantidades de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) para formar biopelículas. La EPS se compone principalmente de proteínas, exopolisacáridos, ADN extracelular y es esencial para la formación de biopelículas 2. Sirve como un andamio físico por el cual las bacterias pueden utilizar para diferenciar espacialmente y protege a las bacterias de las condiciones ambientales nocivas y las respuestas del huésped. Los diferentes componentes de EPS tienen papeles distintos en la formación de biopelículas 3 y los cambios en la expresión de los componentes de EPS puede remodelar radicalmente las estructuras biofilm 4. Componentes EPS también pueden funcionar como moléculas de señalización 5, y estudios recientes han mostrado ciertos componentes EPS que interactúan con las células microbianas para guiar sus diff migración y biofilmerentiation 6-8. La investigación sobre la EPS en gran medida se ha avanzado sobre la base de los análisis morfológicos de los biofilms producidos por mutantes defectuosos en un componente específico de la EPS 9,10. Además, el EPS se caracteriza generalmente en la escala macro (caracterización granel) 11. Morfológica analiza sin embargo puede faltar detalle cuantitativa y caracterización mayor, que devuelve valores medios, pierde el detalle que existe dentro de la heterogeneidad de la biopelícula. En la actualidad existe una creciente tendencia a progresar a la caracterización en tiempo real de las propiedades mecánicas de la EPS en la escala micro. Este protocolo se muestra cómo microrheology partícula de seguimiento es capaz de determinar los efectos espacio-temporales de componentes de la matriz Pel y exopolisacáridos Psl en la viscoelasticidad y eficaz reticulación de Pseudomonas aeruginosa biofilms 4. Microrheology pasiva es una rh simple y baratoeology método que proporciona el más alto rendimiento del muestreo microrheological espacial de un material hasta la fecha 12,13. En microrheology pasiva, esferas de sondas se colocan en la muestra y su movimiento Browniano, impulsado por energías térmicas (k B T) es seguido por microscopía de vídeo. Varios partículas pueden ser rastreados de forma simultánea, y las coordenadas de tiempo-dependiente de las partículas siguen un camino aleatorio convencional. Por lo tanto, en promedio, las partículas se mantienen en la misma posición. Sin embargo, la desviación estándar de los desplazamientos o la media al cuadrado de desplazamiento (MSD) de las partículas, no es cero. Desde fluidos viscosos fluyen, la partícula MSD en un fluido viscoso crece linealmente a medida que pasa el tiempo. En contraste, la reticulación polimérico encuentra en viscoelástico o sustancias elásticas les ayuda a resistir el flujo, y las partículas se convierten limitada en su desplazamiento, que conduce a las mesetas de la curva de MSD (Figura 1A). Esta observación se deduce la relación MSDαt <sup&gt; α, donde α es el exponente de difusión que se relaciona proporción de contribuciones elásticas y viscosas de la sustancia. Para partículas que se mueven en los fluidos viscosos a = 1, en ​​sustancias viscoelásticas 0 &lt;α &lt;1, y en sustancias elásticas α = 0. El MSD también puede ser usada para calcular la deformación por fluencia, que es la tendencia del material se deforme permanentemente sobre tiempo y calcula cómo fácilmente un diferenciales materiales. La química tamaño, la densidad y la superficie de la partícula son críticos para la correcta aplicación de experimento microrheological y se eligen con respecto al sistema estudiado (en este caso los polímeros de la matriz del biofilm, véase la Figura 1B). En primer lugar, la partícula mide la reología de la sustancia con estructuras que son mucho más pequeño que la propia partícula. Si las estructuras de la sustancia son de escala similar a la partícula, el movimiento del partícu es perturbado por la forma y orientación de las estructuras individuales. Sin embargo, si las estructuras que rodean la partícula son mucho más pequeños, este efecto es pequeño y promedio, la presentación de un entorno homogéneo a la partícula (Figura 1B). En segundo lugar, la densidad de la partícula debe ser similar al del medio (1.05 g ml -1 para medios a base de agua) de tal manera que se evita la sedimentación y las fuerzas de inercia son insignificantes. La mayoría de las partículas con celosías de poliestireno cumplen los criterios anteriores. Idealmente, la partícula no interactúa con los polímeros de la matriz de la biopelícula como la interpretación reológico de MSD partícula sólo es válida si el movimiento es aleatorio, impulsada por la energía térmica y la colisión con estructuras de sustancias. Esto se puede observar mediante la comprobación de la partícula sonda tiende a obligar o rebotar en la superficie de un biofilm pre-adulto. Sin embargo, a pesar de la falta de atracción por el biofilm, las partículas deben ser capaces de ser incorporados a la matriz.Además, la heterogeneidad físico-químico de la biopelícula puede resultar en diferentes partículas siendo más adecuado como sondas en diferentes regiones del biofilm. De este modo, las partículas de diferentes tamaños y química de la superficie deben aplicarse a la biopelícula. Como tal, la partícula MSD es capaz de proporcionar información útil sobre cómo los diferentes componentes contribuyen a la reología y la difusión de la biopelícula. Además, el uso de diferentes sondas le permite a uno para derivar información sobre la heterogeneidad espacial fisicoquímica de la biopelícula. Este método puede ser utilizado para probar el tratamiento antimicrobiano efecto sobre las propiedades mecánicas de la biopelícula, o aplicarse a las biopelículas de especies mixtas para investigar cómo las propiedades mecánicas de la biopelícula se cambian de la introducción de otra especie. Partículas TME también puede ser útil para la caracterización de la dispersión de la biopelícula. Tales estudios serían útiles en la comprensión de los biofilms, lo que podría mejorar los tratamientos biofilm unnd ingeniería de biofilms para actividades útiles.

<table><tbody><tr><td>Fluoresferas</td><td>Invitrogen</td><td>F-8821</td><td>1.0 &#956; Microesferas fluorescentes rojas M (580/605) con modificación de carboxilato</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager M1</td> Carl <td>Microscopio epifluorescente</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td>Bomba peristáltica</td></tr><tr><td>Cámaras de celda de flujo Universidad</td><td>Técnica de Dinamarca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trampa de burbujas</td><td>Universidad Técnica de Dinamarca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicona</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>de 3 mm de diámetro exterior, 1&nbsp; mm de diámetro interior</td></tr><tr><td>Conectores de plástico de polipropileno transparente&nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06365-83</td><td>1/16 pulg. (1.588 mm)</td></tr><tr>Clips <td></td><td></td><td>de aglutinante</td><td>Para sujetar tubos</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Thermo Scientific&trade; Nunc&comercio;</td><td>50 x 24 mm</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 3 ml</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 &nbsp; Aguja G</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &nbsp; L Botellas de almacenamiento/medios VWR</td><td>&reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carro</td><td>para sujetar la configuración</td> de <td></td><td></td> la biopelícula</tr></tbody></table>

en mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Las células bacterianas son capaces de formar comunidades de biopelículas adheridas a la superficie conocidas como biopelículas al encerrarse en sustancias poliméricas extracelulares (EPS). El EPS sirve como un andamio físico y protector que alberga las células bacterianas y consta de una variedad de materiales que incluyen proteínas, exopolisacáridos y ADN. La composición del EPS puede cambiar, lo que remodela las propiedades mecánicas de la biopelícula para desarrollar o respaldar aún más estructuras alternativas de la biopelícula, como serpentinas, como respuesta a las señales ambientales. A pesar de esto, hay pocas descripciones cuantitativas sobre cómo los componentes del EPS contribuyen a las propiedades mecánicas y la función de las biopelículas. La reología, el estudio del flujo de la materia, es de particular relevancia para las biopelículas, ya que muchas biopelículas crecen en condiciones de flujo y están constantemente expuestas a esfuerzos cortantes. También proporciona medición e información sobre la propagación de la biopelícula en una superficie. Aquí, la microrreología de seguimiento de partículas se utiliza para examinar la viscoelasticidad y las funciones efectivas de reticulación de diferentes componentes de la matriz en varias partes de la biopelícula durante el desarrollo. Este enfoque permite a los investigadores medir las propiedades mecánicas de las biopelículas a microescala, lo que podría proporcionar información útil para el control y la ingeniería de biopelículas.

Las propiedades viscoelásticas locales de la biopelícula en diferentes regiones de la biopelícula, que incluía los huecos (medianas por encima de la biopelícula), llanuras (capa plana indiferenciado de células) y microcolonias (véase etiquetas en la Figura 2A) fueron investigados. Los cambios temporales en propiedades viscoelásticas del biofilm durante la maduración de 3 días a 5 también se determinaron. El MSD de las partículas en los huecos se utilizó como control y comparable a la MSD de partículas e...

La microrreología de seguimiento de partículas investiga la viscoelasticidad de los materiales. Aquí, la técnica se utiliza para determinar la viscoelasticidad, el cumplimiento de la fluencia y las funciones efectivas de reticulación de diferentes componentes de la matriz de una biopelícula bacteriana. La matriz está formada por sustancias poliméricas secretadas por las bacterias y sus componentes determinan la estructura de la biopelícula y sus propiedades mecánicas.

En Mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

El objetivo general de esta metodología es mostrar cómo medir las propiedades lógicas reales dentro de los microdominios de biopelículas estáticas y en celdas de flujo heterogéneas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biopelícula, como cómo componentes métricos específicos, diferentes especies o compuestos afectan la neurología de la biopelícula y evaluar su respuesta a fuerzas físicas como el esfuerzo cortante. Se trata de una técnica no destructiva con alta resolución espacial, que puede realizarse con equipos estándar en laboratorios biológicos.Después de preparar cultivos bacterianos nocturnos, suministros y medio para el montaje de la celda de flujo según el protocolo descrito, distribuya alícuotas de microesferas fluorescentes en agua estéril en tubos de microcentrífuga para eliminar el azida sódico, centrifugue los tubos durante cinco minutos en un ambiente estéril como una cabina de flujo laminar, elimine el sobrenadante y use un mililitro de medio de crecimiento para resuspender las microesferas. A continuación, añada las microesferas al resto del medio de crecimiento para el cultivo en celda de flujo. Monte el cultivo en celda de flujo según el protocolo descrito para un montaje de cultivo estático para biofilms crecidos en cámaras de microplaca; diluya los cultivos nocturnos 100 veces en tubos de microcentrífuga añadiendo 10 microlitros de cultivo nocturno a un mililitro de medio de crecimiento.Medio que contiene microesferas. Luego, utilice los cultivos diluidos para llenar las cámaras de micropozos e incube a 37 grados Celsius en condiciones estáticas. En los días tres y cinco, detenga el flujo de la bomba peristáltica y lleve el sistema de celda de flujo a la sala de microscopía.Luego, sujete la tubería cerca de la entrada y salida de las cámaras de la celda de flujo para evitar desplazamientos causados por el flujo. Coloque la celda de flujo sobre la platina de un microscopio vertical y, utilizando un objetivo de inmersión de 40 x y microscopía de fluorescencia, registre el movimiento de las microesferas embebidas en el biofilm en diversas ubicaciones, como microcolonias y capas planas no diferenciadas, para investigaciones temporales y espaciales. Para eventos que ocurren en una escala de tiempo corta, registre videos más breves con una mayor velocidad de cuadros por segundo para capturar dinámicas rápidas; para eventos más prolongados, capture videos más largos con una velocidad de cuadros más baja.Para dinámicas más lentas, guarde los videos en un formato adecuado que pueda ser leído por Fiji ImageJ, como CZI o Tiff. Verifique que no ocurra deriva. Al desplazarse por un video finalizado, confirme que las partículas no se muevan simultáneamente en la misma dirección, sino que el movimiento sea aleatorio.Retire la celda de flujo del portaobjetos del microscopio y reinicie la bomba peristáltica para continuar cultivando el biofilm. Para obtener las trayectorias de seguimiento de partículas a partir de los videos grabados, abra Fiji y cargue un archivo. En el menú de complementos, seleccione Seguimiento y luego TrackMate. Verifique o ajuste los parámetros de resolución y velocidad de cuadro en la configuración inicial de calibración para que coincidan con los parámetros del video. Para detectar partículas, seleccione el detector LOG e ingrese el diámetro de la partícula y el valor umbral.Por ejemplo, 1000. Compruebe el botón de vista previa y desplácese por el video para verificar que los círculos morados sigan las partículas durante todo el video. Aumente el valor del umbral.Si el círculo púrpura aparece en el espacio vacío, reduzca el valor de umbral. Si no se detectan suficientes partículas, haga clic en el botón siguiente para completar la detección de partículas. Si la detección inicial de partículas fue satisfactoria y no es necesario agregar ni eliminar partículas, haga clic en el botón siguiente. Para las siguientes tres ventanas, umbralización inicial, seleccione una vista y seleccione un filtro sin realizar ajustes.A continuación, en la barra de opciones de la ventana seleccionar un método de seguimiento, seleccione el rastreador LAP simple. Dado que las partículas rara vez salen del plano de enfoque en el biofilm y son fáciles de rastrear, utilice los valores sugeridos o bajos para la distancia máxima de vinculación y cierre de brechas y haga clic en Siguiente. Verifique que el seguimiento de partículas sea satisfactorio desplazándose por el video para comprobar que las partículas sigan las trayectorias trazadas por TrackMate y que no haya trayectorias no deseadas ni faltantes.Se proporcionan varios filtros para excluir partículas según los resultados individuales de seguimiento. Si esto no es necesario, vaya a la ventana final, seleccione una acción en el menú desplegable, elija exportar las trayectorias a un archivo XML y haga clic en ejecutar. Elija una carpeta y guarde las trayectorias en matlab.Prepárese para importar los archivos XML de las trayectorias de partículas seleccionando la ruta del conjunto de archivos y agregue la carpeta de scripts disponible con el paquete Fiji para realizar el análisis de trayectorias de partículas. Comience descargando el analizador de MSD. Extraiga la carpeta del analizador de MSD y colóquela en una carpeta que pertenezca a la ruta de MATLAB.Inicie MATLAB e inicie el analizador escribiendo lo siguiente, donde micrómetros y segundos son las unidades físicas de espacio y tiempo en el video. A continuación, importe las trayectorias de las partículas escribiendo lo siguiente, donde el clip Z elimina la dimensión Z. Para un video 2D, la escala T ajusta las unidades en la dimensión temporal de fotogramas a segundos y agregue las pistas para trazar las trayectorias de las partículas.Introduzca lo siguiente, calcule el desplazamiento cuadrático medio o MSDS de las partículas utilizando los comandos mostrados aquí. Para graficar los MSDS de cada partícula, use figure y MA dot plot msd. Luego combine las trayectorias de las partículas de otros videos de la misma categoría.Al importar las trayectorias mediante el comando importar trayectoria, luego graficando y calculando los msd como se acaba de demostrar para trazar la media del conjunto o las curvas promedio generales. Escriba lo siguiente. Luego cambie los ejes Y y X de escala lineal a escala logarítmica.Para eliminar regiones de la curva con largos tiempos de retardo o que presentan un ascenso abrupto debido al error dinámico, utilice la herramienta de pincel para seleccionar el extremo de la curva. Y en el menú de herramientas, seleccione pincelado. Elimine los no apareados después de instalar easy FITT y reiniciar MATLAB con el menú fácil en la ventana de la figura.De acuerdo con el protocolo del texto, ajuste las curvas MSD a la ley de potencia seleccionando mostrar el ajuste de potencia A veces X a la N, donde N es el exponente difusivo estimado alfa. Luego, para calcular nuevos MSD de partículas en otras ubicaciones o tiempos, escriba clear para descartar las trayectorias y MSD de partículas actuales. Después de calcular varias curvas MSD para las partículas en distintas ubicaciones de diferentes cepas de biopelículas y en diferentes puntos temporales, copie y pegue las curvas en un solo gráfico.Para comparar, seleccione la curva y vaya a herramientas para ver las estadísticas de los datos, como el rango mediano. La MSD de la partícula es proporcional a la compliance de fluencia JFT del material en el que está incrustada la partícula, según la relación mostrada en esta fórmula, donde J es igual a la compliance de fluencia. D es igual al diámetro de la partícula, KB es igual a la constante de Boltzmann.La T mayúscula constante es igual a temperatura y la t minúscula es igual a tiempo. En estos experimentos, se investigaron las propiedades viscoelásticas de diferentes regiones del biopelícula de cepas silvestres de P arosa y mutantes delta PE A, incluyendo vacíos, planos y microcolonias. El MSD de las partículas en el vacío se utilizó como control y fue comparable al MSD de las partículas en medio puro.En contraste, las partículas atrapadas en el biofilm vibraron en posiciones fijas y los valores de MSD oscilaron entre los típicos de materiales viscoelásticos hasta geles fuertemente elásticos en los biofilms formados por las cepas de tipo salvaje y delta Pele. En las microcolonias del día tres, el MSD de las partículas fue independiente del tiempo para intervalos de 0,1 segundos a 10 segundos, lo que indica que las microcolonias eran elásticas. Las complianzas medias de fluencia, calculadas a partir de los MSD de las partículas correspondientes, fueron de 4,3 × 10⁻² Pa⁻¹ y 3,6 × 10⁻² Pa⁻¹, respectivamente.Al quinto día, la fluencia por fluencia lenta de las microcolonias en la cepa silvestre aumentó a 2,5 veces 10 a la menos uno, pascales a la menos uno, lo que indica una reducción en el entrecruzamiento efectivo dentro de la matriz. Los biofilms formados por la cepa mutante delta P-S-L-B-C-D fueron menos diferenciados y presentaron un retraso en el desarrollo, con planos gruesos que desarrollaron microcolonias después del tercer día. A partir de los valores de MSD, los biofilms estuvieron mucho menos entrecruzados que los de la cepa silvestre y las cepas delta Pele. Se tomaron estadísticas suficientes del microdominio cuando el análisis de más videos no agregó ninguna información nueva a la curva de MSD.Es importante realizar microbiología utilizando una amplia gama de partículas que difieran en química de superficie y tamaños. Se pueden añadir experimentos adicionales al procedimiento para investigar la salud. Las fuerzas físicas, como el esfuerzo cortante o los tratamientos químicos, afectan la radiología del biofilm. La microbiología extrae información estructural que no se obtiene fácilmente mediante otros métodos a escala micrométrica.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo rastrear partículas, analizar sus MSD y obtener exponentes difusivos de biopelículas. No olvide que trabajar con patógenos bacterianos puede ser peligroso. Todos los desechos deben esterilizarse en autoclave y desecharse adecuadamente.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Fuente: Kurz, D. L., et al. Plataforma microfluídica para estudiar el biobloqueo en medios porosos. J. Vis. Exp. (2022)El vídeo demuestra el uso de un dispositivo microfluídico para estudiar la formación de biopelículas. Se introduce una suspensión bacteriana en el microcanal, seguida de incubación para permitir el desarrollo de biofilm. Luego se reanuda el flujo y se utiliza la monitorización de la presión junto con la imagen para detectar la formación de biofilm y la obstrucción de los poros...

Un dispositivo microfluídico para imágenes en tiempo real y seguimiento de presión durante la formación de biopelículas

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El accionamiento a distancia magnética del micrométrica Sondas para<em&gt; In situ</em&gt; Mapping 3D bacterianas Biofilm Propiedades Físicas

Microrheology de partículas de seguimiento se puede utilizar para cuantificar de forma no destructiva y espacialmente mapa cambios en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en modelos de tumores en 3D.

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

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