En Mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento Microrheology

La microrreología de seguimiento de partículas investiga la viscoelasticidad de los materiales. Aquí, la técnica se utiliza para determinar la viscoelasticidad, el cumplimiento de la fluencia y las funciones efectivas de reticulación de diferentes componentes de la matriz de una biopelícula bacteriana. La matriz está formada por sustancias poliméricas secretadas por las bacterias y sus componentes determinan la estructura de la biopelícula y sus propiedades mecánicas.

El objetivo general de esta metodología es mostrar cómo medir las propiedades lógicas reales dentro de los microdominios de la celda de flujo heterogénea y las biopelículas estáticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la ología en el campo de la biopelícula, como la forma en que un componente de métricas específico, diferentes especies o compuestos afectan la neurología de la biopelícula y probar su respuesta a la fuerza física, como la herrea. Se trata de una técnica no destructiva con alta resolución espacial, y que puede realizarse con equipos estándar de los laboratorios biológicos.

Después de preparar cultivos y suministros bacterianos durante la noche y el medio para la configuración de la celda de flujo, de acuerdo con el protocolo de texto, alícuotas microesferas fluorescentes en agua estéril en tubos de microcentrífuga para eliminar la azida de sodio, gire los tubos durante cinco minutos en un entorno estéril como una campana de flujo, retire el supernat y use un mililitro de medio de crecimiento para volver a suspender las microesferas. A continuación, añada microesferas al resto de los medios de crecimiento para el cultivo de células de flujo. Configure el cultivo de células de flujo de acuerdo con el protocolo de texto para una configuración de cultivo estático para biopelículas cultivadas en cámaras de micropocillos, diluya los cultivos durante la noche 100 veces en tubos de microcentrífuga agregando 10 microlitros de cultivo nocturno a un mililitro de crecimiento.

Medio que contiene microesferas. A continuación, utilice los cultivos diluidos para llenar las cámaras de micropocillos e incubar a 37 grados centígrados en condiciones estáticas. En los días tres y cinco, apague el flujo de la bomba peristáltica y lleve la configuración de la celda de flujo a la sala de microscopía.

A continuación, sujete el tubo cerca de la entrada y salida de las cámaras de la celda de flujo para evitar la deriva del flujo. Coloque la celda de flujo en la platina de un microscopio vertical y, con un objetivo de aceite de 40 x y microscopía de fluorescencia, registre el movimiento de la microesfera incrustado en la biopelícula en varios lugares, como microcolonias y capas planas indiferenciadas para investigaciones temporales y espaciales. En el caso de los eventos que se producen en una escala de tiempo corta, grabe vídeos más cortos con una velocidad de fotogramas más rápida para una dinámica rápida En el caso de los eventos más largos, capture vídeos más largos con una velocidad de fotogramas más lenta.

Para dinámicas más lentas, guarde los videos en un formato apropiado que pueda ser leído por la imagen Fiji J, como CZI o Tiff. Compruebe que no se está produciendo la deriva. Desplazándose a través de un video terminado y confirmando que las partículas no se mueven en la misma dirección simultáneamente, sino que el movimiento es aleatorio.

Retire la celda de flujo de la etapa del microscopio y reinicie la bomba peristáltica para continuar cultivando la biopelícula. Para obtener las trayectorias de seguimiento de partículas de los videos grabados, abra Fiji y cargue un archivo En el menú de complementos, seleccione seguimiento y compañero de seguimiento. Compruebe o ajuste los parámetros de resolución y velocidad de fotogramas en la configuración de calibración inicial para que coincidan con los parámetros de vídeo Para detectar partículas, seleccione el detector LOG e introduzca el diámetro de partícula y el valor umbral.

Por ejemplo, 1000. Verifique el botón de vista previa y desplácese por el video para verificar que los círculos morados sigan a las partículas a lo largo del video. Aumente el valor del umbral.

Si el círculo púrpura aparece en el espacio vacío, reduzca el valor del umbral. Si no se detectan suficientes partículas, haga clic en el botón siguiente para completar la detección de partículas. Si la detección inicial de partículas fue satisfactoria y no es necesario agregar o eliminar partículas, haga clic en el botón siguiente Para las siguientes tres ventanas, umbral inicial, seleccione una vista y seleccione un filtro sin ajuste.

A continuación, en la barra de opciones de la ventana seleccionar un método de seguimiento, seleccione el rastreador LAP simple. Dado que las partículas rara vez se desenfocan en la biopelícula y se pueden rastrear fácilmente, utilice los valores sugeridos o bajos de vinculación y distancia máxima de cierre de espacio y haga clic. Próximo. Compruebe que el seguimiento de partículas es satisfactorio desplazándose por el vídeo para ver que las partículas siguen las pistas dibujadas por trackmate y que no hay pistas no deseadas o faltantes.

Se proporcionan varios filtros para excluir partículas en función de sus resultados de seguimiento individuales. Si esto no es necesario, vaya a la ventana final, seleccione en acción en el menú desplegable, seleccione exportar pistas a archivo XML y haga clic en ejecutar. Elija una carpeta y guarde las pistas en matlab.

Prepárese para importar los archivos XML de trayectorias de partículas seleccionando la ruta del conjunto de archivos y agregue la carpeta scripts disponible con el paquete Fiji para llevar a cabo el análisis de trayectorias de partículas. Comience descargando MSD analyzer. Extraiga la carpeta at msd analyzer y colóquela en una carpeta que pertenezca a la ruta de MATLAB.

Inicie MATLAB e inicie el analizador escribiendo lo siguiente: donde los micrómetros y los segundos son las unidades físicas de espacio y tiempo en el vídeo. A continuación, importe las trayectorias de las partículas escribiendo lo siguiente, donde el clip Z elimina la dimensión Z. En el caso de un vídeo 2D y escala, T escala las unidades de la dimensión de tiempo de fotogramas a segundos y añade las pistas para trazar las trayectorias de las partículas.

Ingrese lo siguiente, calcule el desplazamiento cuadrático medio o MSDS de las partículas usando los comandos que se muestran aquí. Para trazar la MSDS de cada partícula, utilice la figura y el diagrama de puntos MA msd. A continuación, combine las trayectorias de las partículas de otros vídeos de la misma categoría.

Importando las trayectorias usando el comando import trajectory, luego trazando y calculando msds como se acaba de demostrar para trazar la media del conjunto o el promedio de las curvas generales. Escriba lo siguiente. A continuación, cambie los ejes Y y X de escala lineal a logarítmica.

Para eliminar regiones de la curva con tiempos de retraso largos o que aumentan abruptamente debido a un error dinámico, utilice la herramienta de pincel para seleccionar el final de la curva. Y en el menú de herramientas, seleccione cepillado. Elimine los unbred después de instalar easy FITT y reiniciar MATLAB con el menú easy en la ventana de la figura.

acuerdo con el protocolo de texto, ajuste las curvas MSD a la ley de potencia seleccionando mostrar potencia de ajuste A por X a N, donde N es el exponente difusivo alfa estimado. A continuación, para calcular las MSDS de nuevas partículas en otras ubicaciones o en el tiempo, escriba clear para descartar las trayectorias de las partículas y las MSDS actuales. Después de calcular varias curvas MSD para las partículas en varias ubicaciones de diferentes cepas de biopelícula y en diferentes puntos de tiempo, copie y pegue las curvas en un gráfico.

Para comparar, seleccione la curva y vaya a herramientas para ver las estadísticas de datos, como el rango de la mediana. El MSD del cordón es proporcional a la conformidad de fluencia JFT del material en el que está incrustado el cordón de acuerdo con la relación que se muestra en esta fórmula, donde J es igual a la conformidad de fluencia. D es igual al diámetro de la partícula, KB es igual al del barquero.

La T mayúscula constante es igual a la temperatura y la T minúscula es igual al tiempo. En estos experimentos, se investigaron las propiedades viscoelásticas de diferentes regiones de biopelículas de cepas mutantes de tipo silvestre P arosa y delta PE A, incluidos vacíos, planos y microcolonias. El MSD de partículas en el vacío se utilizó como control y fue comparable al MSD de partículas en medio puro.

Por el contrario, las partículas atrapadas en la biopelícula vibraron en posiciones fijas y los valores de MSD oscilaron entre los típicos materiales viscoelásticos A y los geles fuertemente elásticos en biopelículas formadas por el tipo salvaje y las cepas delta de Pele de las partículas. En el día, tres microcolonias fueron independientes del tiempo por el tiempo, con tramos de 0,1 segundos a 10 segundos, lo que indica que las microcolonias eran elásticas. La mediana de los cumplimientos de fluencia calculada a partir de las MSDS de las partículas correspondientes fue de 4,3 veces 10 elevado a los dos pascales negativos y de 3,6 veces 10 elevado a los dos pascales negativos elevados al negativo, respectivamente.

Para el quinto día, el cumplimiento de la fluencia de las micro colonias en la cepa de tipo silvestre aumentó a 2.5 veces 10 a la negativa, los pascales a la negativa indican una reducción en la reticulación efectiva dentro de la matriz Las biopelículas formadas por la cepa mutante delta P-S-L-B-C-D fueron menos diferenciadas y retrasadas en el desarrollo con planos gruesos que desarrollaron micro colonias después del tercer día. A partir de los valores de MSD, las biopelículas se reticularon de forma mucho menos eficaz que las cepas de tipo salvaje y delta Pele. Se toman suficientes estadísticas del microdominio cuando el análisis de más videos no agrega ninguna información nueva a la curva MSD.

Es importante llevar a cabo la microbiología utilizando una amplia gama de partículas que difieren en la química de la superficie y los tamaños. Se pueden agregar experimentos adicionales al procedimiento para investigar la salud. Las fuerzas físicas, como el tratamiento químico o transparente, influyen en la radiología de la biopelícula La microbiología extrae información estructural que no se obtiene fácilmente por otros métodos a escala micrométrica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo rastrear partículas, analizar sus MSDS y obtener exponentes difusivos de biopelículas. No olvide que trabajar con patógenos bacterianos puede ser peligroso. Todos los residuos deben ser esterilizados en autoclave y eliminados adecuadamente.