Ferromagnético Bare Metal stent para la captura de la célula endotelial y Retención

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un stent metálico desnudo ferromagnético capaz de capturar y retener células endoteliales marcadas con nanopartículas magnéticas. Esto se logra diseñando un stent de acero inoxidable 2205 mediante el uso de software de diseño asistido por computadora (CAD) y análisis de elementos finitos (FEA) para comprender adecuadamente el comportamiento mecánico del material y la estructura del stent durante la compresión y expansión. A continuación, el stent fabricado se comprime y expande mecánicamente para demostrar su integridad mecánica, y se estudia la retención del campo magnético del stent, lo que valida su comportamiento magnético.

Luego, los stents se implantan en cerdos y se administran células endoteliales marcadas con nanopartículas magnéticas para verificar la captura y retención celular en la circulación coronaria. Los resultados muestran que el stent ferromagnético desarrollado en este estudio es capaz de capturar y retener células endoteliales marcadas magnéticamente, según el análisis histológico de vasos sanguíneos extraídos de experimentos in vivo. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de diversos dispositivos cardiovasculares, ya que la endotelización rápida puede promover la cicatrización y mejorar la compatibilidad con la sangre.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la complejidad de los procedimientos de CAD y MEF implicados en el diseño de stents; además, el cultivo celular también puede representar un desafío para principiantes. Debido a la importancia de mantener un ambiente estrictamente aséptico, deseábamos mejorar la cicatrización de los stents y se nos ocurrió la idea de utilizar fuerzas magnéticas para fijar células vivas a los stents. La demostración visual de este método es fundamental, ya que las etapas de desarrollo del stent y de calentamiento celular son difíciles de aprender debido a la complejidad del comportamiento del material durante el plegado y la expansión, y a la novedad del atrapamiento celular magnético en el stent.

Para comenzar, utilice un software CAD para crear un cilindro hueco extruido seleccionando una característica base de extrusión con un espesor de pared igual al espesor del estruto del stent. Diseñe un patrón de stent en un plano de croquis diferente tangente al cilindro extruido. Ajuste el ancho del patrón plano para que coincida con la circunferencia del cilindro hueco extruido.

Mediante la función de envoltura, transfiera el diseño del patrón plano al cilindro hueco. Guarde la pieza en su formato nativo y también en formato ACEs para exportarla y realizar el análisis por elementos finitos (AEF). Para llevar a cabo el análisis por elementos finitos, importe la geometría sólida guardada en formato ACEs al módulo de piezas del software de AEF para su posterior análisis en el modelador de piezas del software. Cree dos cilindros analíticos coaxiales con el stent. Haga doble clic en el elemento del árbol de instancias del modelador de ensamblaje para ensamblar las piezas en posiciones relativas mediante un módulo de malla del software de AEF.

Especifique el elemento, tipo como elemento hexaédrico de 20 nodos con integración reducida. Indique el tamaño del elemento y realice el mallado del stent dentro de las propiedades de interacción del árbol del modelo. Defina pares de contacto rígidos sin fricción entre el stent y los dos cilindros respectivamente.

Asigne los comportamientos de tensión-deformación de ELA del acero inoxidable 2205 al modelo de stent. Defina las condiciones de contorno para primero comprimir el cilindro exterior hasta un milímetro, lo que simula el plegado. Retire el cilindro exterior para simular la relajación del stent plegado.

Expanda el cilindro interno hasta tres milímetros para simular la expansión y, finalmente, retire el cilindro interno para simular el retroceso del stent. Una vez que la simulación esté completa, abra el archivo de resultados y procese los resultados para estudiar las deformaciones principales e iterativamente. Mejore el diseño del stent para lograr una deformación principal del 20 %, que es menor que el límite de falla del material.

Después de obtener los tubos de acero inoxidable 2205 y cortar los stents según el protocolo descrito en el texto bajo una campana extractora, utilizando equipo de protección adecuado, someta el stent a un decapado ácido para pasivar la superficie de los stents electro-pulidos, sumergiéndolos en ácido clorhídrico al 50 % durante 10 minutos, seguido de bicarbonato de sodio al 10 % durante otros 10 minutos para completar el decapado ácido. Lave los stents con etanol y luego con agua desionizada. A continuación, para probar el plegado de los stents, sostenga un stent y un balón trifolio.

En una herramienta manual de plegado, presione el mango para deformar el stent y plegarlo sobre el balón. Después de inspeccionar el stent plegado bajo el microscopio para verificar un plegado uniforme y cualquier signo de fallo, expanda el stent hasta el diámetro de diseño de tres milímetros utilizando agua para presurizar el balón de triple pliegue. Examine los stents expandidos en busca de fracturas microscópicas y expansión uniforme utilizando un imán fuerte de neodimio.

Magnetice los stents diametralmente sosteniendo el stent sobre una de las caras planas con su diámetro a lo largo de las líneas del campo magnético. Alternativamente, magnetice los stents axialmente sosteniendo el stent junto a la superficie cilíndrica con su eje a lo largo de las líneas del campo magnético. Mantenga el stent cerca del imán fuerte durante aproximadamente un minuto.

Para la magnetización, monte individualmente los stents sobre mandriles de vidrio y luego coloque los mandriles de vidrio en el portabrocas de precisión del accesorio de sonda magnética. Con los estadios X, Y, Z, ensamble el accesorio de sonda magnética para posicionar con precisión la sonda microsensora magnética cerca del stent sin tocar la superficie. Mida la lectura de referencia del microsensor magnético lejos del stent y luego utilice los estadios x, y, Z para posicionar la sonda y medir el campo magnético residual en la superficie del stent.

Después de obtener células endoteliales progenitoras o EOC a partir de sangre periférica porcina según se describe en el protocolo de cultivo del texto, cultivar las células en un matraz T75 hasta que alcancen aproximadamente un 80 % de confluencia. Tras la síntesis de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro o pyon, añadir pyon a las EOC en medio de cultivo celular a una concentración de 200 microgramos por mililitro. Incubar a 37 °C durante 16 horas.

Aspire suavemente el medio de cultivo celular y agregue 10 mililitros de PBS al frasco. Luego agite suavemente y aspire nuevamente. El PBS Agregue cinco microgramos por mililitro de un colorante fluorescente, como CM DAI, a 10 mililitros de medio de cultivo para teñir las células según las instrucciones del fabricante e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Use PBS para lavar suavemente las células como antes, luego agregue la solución de tripsina-EDTA al 0,25 % e incube a 37 grados Celsius durante cinco minutos para desprender las células del matraz. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Complete el volumen con PBS y centrifugue a 500 G durante cinco minutos para obtener el sedimento celular después de verter el sobrenadante.

Utilice PBS para resuspender las células a una concentración de uno a 2 millones de células por mililitro. Para estudios celulares in vitro, diseñe y fabrique un accesorio sencillo para sostener el stent justo por encima de la superficie de un cubreobjetos de vidrio. Utilice un dauer electromagnético para desmagnetizar un stent o, con un imán de neodimio potente, magnetice un stent diametral o axialmente. Pipetee el espécimen marcado con spy en ooc suspendido en PBS dentro del recipiente que contiene los stents magnetizados axialmente, magnetizados diametralmente o no magnetizados como control.

Luego, con un microscopio invertido de fluorescencia, tome imágenes de los stents con EOC suspendidas en PBS para realizar la implantación de stents tras administrar medicación antiplaquetaria a cuatro cerdos Yorkshire sanos y anestesiarlos según el protocolo descrito en el texto. Utilice una técnica estándar de cateterización cardíaca para implantar un stent magnetizado y un stent no magnetizado en la arteria coronaria derecha o RCA. Después de usar un alambre guía para avanzar el balón y el stent con un balón sobre alambre, obstruya el flujo sanguíneo dentro de la RCA proximal a los stents implantados. Luego, durante un período de dos minutos, administre aproximadamente 2 millones de EOC autólogas marcadas con scions suspendidas en cuatro mililitros de PBS mediante el catéter central. Tras dos minutos adicionales de oclusión, restablezca el flujo sanguíneo hacia la RCA, recupere el stent y realice el estudio histológico. Según el protocolo descrito en el texto, tal como se muestra aquí, el diseño iterativo del stent basado en el análisis por elementos finitos (FEA) indicó un stent que puede plegarse y expandirse con una deformación principal del 20 %, lo cual es menor que la deformación última del 30 %.

Un stent cortado con láser y electro-pulido, plegado sobre un catéter con balón trifle y expandido hasta tres milímetros utilizando un balón trifle, no mostró signos de fractura. Las imágenes del stent deformado mostraron una buena concordancia con la deformación calculada mediante análisis de elementos finitos (FEA), y las imágenes de microscopía también mostraron ausencia de fracturas, tal como se esperaba a partir de las mediciones del campo magnético residual. Las células marcadas con SPY fueron atraídas preferentemente hacia los segmentos Ben en stents magnetizados axialmente y de forma más uniforme hacia los segmentos rectos.

En stents magnetizados diametralmente, las imágenes de histología mostraron tinción de hierro cerca de los estratos del stent, lo que confirma la atracción y retención de las células endoteliales progenitoras (EOC) en el stent durante el período de implante de siete días. Al intentar este procedimiento, es importante comprender los conceptos de análisis por elementos finitos (FEA) y diseño asistido por computadora (CAD), ya que con parámetros de entrada inadecuados se podría obtener un diseño de stent erróneo, que sea demasiado rígido o que tenga tendencia a la fractura del stent.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como pruebas de fatiga acelerada y pruebas de toxicidad para responder preguntas adicionales, como ¿cuál es la durabilidad a largo plazo y la biocompatibilidad de los stents? Después de varios años de desarrollo, ahora contamos con una tecnología funcional que ha sido validada en un modelo porcino.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar un stent ferromagnético y evaluar la captura y retención de células arteriales marcadas magnéticamente.