Método cryosectioning para microdisección de murino mucosa colónica

El objetivo general de este procedimiento es microdiseccionar dos regiones espacialmente distintas del colon, la zona proliferativa de la cripta K y las células epiteliales de superficie diferenciadas. Esto se logra eliminando primero los dos puntos del ratón. El segundo paso es congelar el tejido entre dos placas de metal.

A continuación, el tejido se monta en un bloque OCT prenivelado. El paso final es seccionar el tejido en un criostato a intervalos de 10 micras. En última instancia, la PCR en tiempo real o Western blot se utiliza para mostrar cambios en la expresión de genes y proteínas.

La ventaja de nuestra técnica es que es rápida, económica y de alto rendimiento. Nuestro procedimiento es Christian Garner Schmidt, un técnico de nuestro grupo. Todos los procedimientos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Emory, y se realizaron de acuerdo con los criterios de los Institutos Nacionales de Salud.

Después de configurar el criostato, como de costumbre, equilibre las cuchillas y los mandriles del criostato a menos 20 grados centígrados. A continuación, llene un molde criogénico vacío con un compuesto de temperatura de corte óptima y equilibre a menos 20 grados centígrados. Esto tomará aproximadamente 30 minutos.

Retire el OCT congelado del molde y fíjelo al mandril con OCT líquido. Coloque el mandril en el brazo del micrótomo y deje que el OCT se asiente durante 10 minutos. Ajuste el criostato a 10 micras por sección y afeite el bloque OCT hasta que quede plano hacia atrás, alejando el brazo del micrótomo de la cuchilla varios centímetros.

A continuación, prepare dos hojas de afeitar por muestra con una lima de metal, desafile el borde afilado de las hojas. A continuación, retire la brida de aluminio con pinzas. Prepare una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros, llena al 50% con silicona, y con 10 a 15 clavijas de disección.

Agregue cinco mililitros de temperatura ambiente, tampón de madejas al plato después de sacrificar al ratón de acuerdo con los métodos aprobados y extirpar un segmento distal del colon entre cero y seis centímetros del ano. Usa unas tijeras para cortar. Abra el colon longitudinalmente y retire el contenido fecal.

Sujete el tejido con alfileres a la placa de disección de silicona que contiene el tampón de Hank con la superficie mucosa hacia arriba. Estire el tejido con los clavos de disección. Luego déjelo reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente para eliminar los pliegues del tejido y permitir que las capas musculares se relajen.

Actúa después de que el tejido haya descansado, retire todos los puntos excepto los extremos. Deslice una hoja de afeitar debajo de la sección deseada de pañuelo y luego vierta el tampón de madejas. Agregue otra hoja de afeitar en la parte superior haciendo un sándwich.

Corta el segmento de tejido y retira los alfileres de los extremos. Transfiera el sándwich de pañuelo de la hoja de afeitar a hielo seco. Deje que el pañuelo se congele durante cinco a 10 minutos.

Toma el sándwich de pañuelo de afeitar y deja que se caliente un poco colocando un dedo en la hoja superior. Separe el sándwich y corte alrededor de los bordes del segmento de tejido. Cortar un segmento de tejido de aproximadamente 0,5 centímetros por un centímetro.

Deje que el pañuelo se caliente hasta que el hielo sobre el pañuelo comience a derretirse. En este punto, presione rápida y cuidadosamente el tejido en el bloque OCT. En el criostato, coloque un dedo sobre la muestra.

La transferencia de calor le permitirá quitar la cuchilla sin alterar el tejido. Cubra el pañuelo con OCT y deje que se equilibre durante cinco minutos. A continuación, corte secciones de 10 micras.

Coloque las secciones en un portaobjetos e inspeccione visualmente las secciones hasta que se vean las criptas. Coloque las secciones en tubos de 1,5 mililitros o en portaobjetos. Esta imagen muestra tejido colónico teñido con hematina eoína en corte transversal tradicional con la muscular circular marcada en cm.

La mucosa muscular marcada como MM, las células de la base de la cripta, las células de transición y las células de superficie se ven claramente. Esta imagen muestra la muscular circular después del corte en serie. A medida que avanzamos hacia las células superficiales, se observa la mucosa muscular.

Esta imagen muestra las células base de la cripta teñidas con h y D con mayor aumento. Nótese la ausencia de un lumen central. Aquí, se ven las celdas de transición y esta imagen muestra las celdas de la superficie.

Las siguientes imágenes muestran la tinción inmunofluorescente de las criptas colónicas aisladas para la proteína de unión de célula a célula. La sula, la ocludina uno o la ZO uno aparecen de color verde y los núcleos, que parecen azules, se observan en sección transversal. Las celdas de transición y de superficie se muestran aquí después del corte en serie.

Varios factores de diferenciación se expresan de manera espacio-temporal a lo largo del eje de la superficie de crip. Esto incluye el factor de transcripción inválido como el factor cuatro que se muestra en verde, que se enriquece en las poblaciones de células de superficie cuando se ve en sección transversal. El corte en serie permite la evaluación por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de KLF cuatro entre los tres compartimentos. Finalmente, este Western blot demuestra los niveles de la proteína KLA cuatro en estas poblaciones celulares.

No olvide que trabajar con cuchillas de microtono puede ser extremadamente peligroso, así que tenga mucho cuidado siempre que realice este procedimiento.