Name: Una técnica-Label libre para el Imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende a medir secreciones proteicas de células individuales con alta resolución espacio-temporal usando nanosensores plasmónicos de oro sin etiquetado. Este método permite mapear dinámicas de secreción celular en tiempo real.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Fabricación 1. Nanoestructura <ol><li> Elija 25 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro con un espesor aproximado de 170 mm (No. 1.5) como sustratos para la nanofabricación. </li><li> Sumergir los cubreobjetos en solución Piranha (3: 1 relación de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno) durante al menos 6 h. Lave la piraña cubreobjetos empapado con abundante ultrapura 18,2 mO agua destilada desionizada (DDW). PRECAUCIÓN: ácido Piranha reacciona violentamente con materiales orgánicos y debe manejarse con sumo cuidado. </li><li> Depósito de 10 nm de cromo película delgada sobre los cubreobjetos por evaporación por haz de electrones para evitar efectos de carga durante el modelado y las imágenes de nanoestructuras. </li><li> Haga girar la primera capa de la bicapa resistir consiste en copolímero de metacrilato de etilo lactato de metilo (MMA_EL6) a 2.000 rpm durante 45 segundos y luego hornear a 150 ° C. Gira la segunda capa de poli-metacrilato de metilo (950PMMA_A2) a 3.000 rpm durante 45 segundos y luego hornear a 180 ° C. </li><li> Tamborileon resistir la bicapa utilizando la litografía por haz de electrones (EBL) a 25 kV con una dosis de 300 mu c área / cm 2. Desarrollar en alcohol isopropílico (IPA) / metilisobutilcetona (MIBK): 01.02 y enjuague en IPA. </li><li> Depósito Ti (5 nm) / Au (80 nm) película sobre el sustrato usando un evaporador de haz de electrones. </li><li> Después de la deposición de oro, levante la bicapa copolímero de resistir por inmersión del sustrato en acetona durante 4 hr. </li><li> Inspeccionar el sustrato usando el microscopio electrónico de barrido (SEM) para confirmar la forma y tamaño nanoestructura, remover el cromo restante del sustrato a través de grabado en húmedo usando CR-7 reactivo de ataque durante 60 segundos a TA y luego enjuague en DDW. </li><li> Diseñar un espaciamiento matriz de centro a centro de 33 micras de dejar espacio para imágenes de células entre matrices. Patrón de las nanoestructuras en 20 x 20 patrón para cada matriz con un paso de 300 nm utilizando un escritor de haz de electrones. Cada chip contiene 300 matrices de dimensión nanoestructura típica de la altura de 80 ± 2,5 nm y 70 ± 2,5 nm Diameter. </li><li> Inspeccionar un subconjunto de matrices usando el microscopio de fuerza atómica (AFM) para la verificación de tamaño y uniformidad. </li><li> Adjuntar un anillo de soporte, típicamente de silicio, a la parte posterior del cubreobjetos usando una epoxi de curado UV. </li></ol> 2. Chip de Limpieza y Aplicación de la auto-ensambladas monocapa <ol><li> Para la limpieza y la regeneración de los chips, la ceniza plasma a una potencia de 40 W en una mezcla de 300 mTorr 5% de hidrógeno, 95% de argón durante 45 segundos después de la limpieza de la cámara durante 5 min en las mismas condiciones. </li><li> Funcionalizar las nanoestructuras de oro inmediatamente tras la calcinación plasma sumergiendo el chip en una solución etanólica de tiol de dos componentes que consiste en una proporción de 3: 1 de SH- (CH 2) 8 3 -EG -OH (SPO) y un componente, ya sea con una amina o grupo funcional carboxilo, a saber, SH- (CH 2) 11 -EG 3 -NH 2 (SPN) o SH- (CH 2) 11 -EG 3 -COOH (SPC). </li><li> Deje la i de chipsn la solución de tiol O / N para formar una monocapa autoensamblada (SAM). </li><li> Enjuague el chip con etanol y se seca con gas nitrógeno. </li><li> Si es necesario, guarde el chip funcionalizado para un máximo de 2 semanas a 4 ° C. </li><li> Cuando esté listo para su uso reaccionar el SPN o componente SPC con el ligando usando una química en función del ligando de elección (véase más adelante). Nota: Los chips pueden ser regenerados y re-funcionalizado docenas de veces. Un chip dado puede ser usado por períodos que van desde 6 meses a más de un año. El espectro medido en una matriz dada se reproducen de forma fiable después de regeneraciones reiteradas incineración de plasma, seguido de biofuncionalización. 29 </li></ol> 3. La funcionalización de superficies y Kinetic Caracterización Nota: Utilice el chip funcionalizado en el instrumento SPR comercial para caracterizar las constantes de velocidad cinética entre el ligando y el analito, así como para estudiar la resistencia de SAM a no específica bncontrar. Hay una amplia gama de caudales y diseños de microfluidos que permiten funcionalización de la superficie eficiente. Puesto que tenemos una SPR disponible en el mercado nos estandarizado en torno a sus caudales recomendados. Observamos que estos caudales son típicos de todos los instrumentos SPR y así no son restrictivas. El instrumento SPR no es una necesidad ya que todos funcionalización se puede hacer directamente en el chip LSPR, pero redujo nuestra carga de trabajo, ya que es un instrumento de multiplexado mientras que nuestra configuración de microfluidos LSPR no lo es. <ol><li> Funcionalizar un chip de oro desnuda comercial con el SAM como se describe en la Sección 2. </li><li> Si se utiliza un SAM basado SPC, activar el grupo carboxilo con una mezcla 1: 1 de 133 mM de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y 33 mM de N hidroxisuccinimida (NHS) en DDW para 10 min. </li><li> Conjugar el grupo carboxilo activado con el anticuerpo / ligando de interés durante 300 segundos usando una velocidad de flujo de 30 l / min. Preparar los ligandos entampón de fosfato pH 6, típicamente, pero esto puede variar dependiendo de la molécula. </li><li> Después de la conjugación ligando, caudal 0,1 M de etanolamina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) como un paso para el desactivador 300 segundos a una velocidad de 30 l / min. Etanolamina ayuda a minimizar la unión no específica. </li><li> Introducir el analito de interés a un caudal de 100 l / min usando un intervalo de concentraciones y calcular las constantes de velocidad cinética utilizando un software de análisis de cinética. </li><li> Si la unión no específica es problemático, aumentar la proporción de SPO para SPC o SPN. </li></ol> Ajustes 4. LSPR Generales <ol><li> Ajustes del microscopio: <ol><li> Utilice una lámpara de 100 W halógena de Koehler iluminar la muestra. Use un filtro de paso largo (normalmente 593 nm de corte) en la trayectoria de la luz para eliminar las longitudes de onda que no contribuyen al cambio de resonancia (Figura 2). </li><li> Para la recolección de datos LSPRi, utilizar un microscopio invertido con un Immersio aceite de 40Xn objetiva (1,4 NA) y una termoeléctricamente enfriaron 16 bits cámara CCD. </li><li> Coloque un divisor de haz en el puerto de salida del microscopio para obtener Imágenes y espectros simultáneamente. </li><li> Ajuste la platina del microscopio de temperatura controlada a 37 ° C y equilibrar durante 4 hr. </li><li> Incorporar un conjunto de incubación adicional en el microscopio para regular la concentración de CO 2 y humedad al 5% y 95%, respectivamente. </li></ol></li><li> Preparación Chip y montaje: <ol><li> Funcionalizar el chip LSPR como se describe en la Sección 2 con las relaciones de SAM de dos componentes óptimos determinados a partir de los experimentos de SPR. </li><li> Cargue el chip dentro de un soporte de microfluidos por encargo de la siguiente manera. Coloque el chip en una pieza inferior de aluminio. Sandwich del chip entre esta pieza inferior y una junta de silicona y una clara pieza superior de plástico. Utilice 4 tornillos para fijar el conjunto. </li><li> Para una aplicación tiol típica a base de SPC, la caída de la capa 300 l una mezcla 1: 1tura de 133 mM de EDC y 33 mM de NHS en DDW para activar los grupos carboxilo del componente tiol SPC. </li><li> Esperar 10 min y enjuagar manualmente la superficie con PBS 10 mM. </li><li> Conjugar el grupo carboxilo activado con el ligando (típicamente un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) de interés a gota recubrimiento de 300 l de solución de ligando. </li><li> Esperar 30 min y enjuagar manualmente con PBS 10 mM. </li><li> Caída de la capa 300 l de 0,1 M de etanolamina en PBS en el chip para minimizar la unión no específica. Espere 10 min. </li><li> Lavar la etanolamina con PBS que contenía 0,005% de Tween 20 (PBS-T20). </li><li> Coloque un pedazo de cuarzo por encima del chip para reducir las fluctuaciones en los datos relacionados con un menisco cambiante. </li><li> Mantenga el chip mojado con tampón PBS-T20, mientras que el montaje en microscopio. </li><li> Coloque el conjunto de chips LSPR firmemente en el soporte de la muestra etapa climatizada y conecte la tubería de microfluidos. </li><li> Conecte el tubo de microfluidos para los bu montaje y flujoffer (o medio libre de suero para estudios de células) hasta un estado de equilibrio se alcanza. </li><li> Permitir a la asamblea y el microscopio se equilibren durante al menos 2 horas. </li><li> Alinear el chip usando la palanca de mando para que la matriz central está alineada con la fibra óptica para la espectroscopia. Los datos espectroscópicos se toma utilizando un espectrómetro y software de análisis espectral. </li><li> Mantenga matrices en el foco durante todo el experimento utilizando el enfoque automático de software, Zeiss de enfoque definido o dispositivo de enfoque automático equivalente. </li></ol></li></ol> 5. LSPR Imaging de secreciones anti-c-myc 9E10 de células de hibridoma Nota: La línea celular de hibridoma utilizado para este estudio expresan anticuerpo anti-c-myc constitutivamente y por lo tanto no requieren un disparador químico <ol><li> Funcionalizar las nanoestructuras con el péptido c-myc. Esto tiene un valor K D de 1,77 nM para los anticuerpos anti-c-myc secretadas por el clon 9E10 células de hibridoma. </li><li> Cultura de las células de hibridoma en completmedio de crecimiento e con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de antibióticos en un matraz T75 a 37 ° C bajo 5% de CO 2. Mantener una densidad celular de 4 × 10 5 células / ml. </li><li> Para los estudios de secreción celular, las células de pellets desde el matraz T75 por centrifugación, se lavan dos veces con RPMI-1640 medio libre de suero (SFM) para eliminar los anticuerpos secretados y ajustar la densidad celular a 4 x 10 6 células / ml. </li><li> Recoger las células y la prueba de viabilidad antes de introducirlos a los chips LSPR. </li><li> Introducir 50 l de la solución de células manualmente en los chips LSPR con una micropipeta. Después de unos pocos minutos a 25 50 células se adhieren a la superficie de los chips LSPR. </li><li> Lavar las células restantes en solución con frescos SFM mediante el sistema de perfusión de microfluidos. </li><li> Seleccione los arrays LSPR para imágenes que están cerca, a menos de 10 m, pero no se superponen con las células. </li><li> Para asegurarse de que la señal es específica para el antib secretada anti-c-mycodies introducen el medio de cultivo celular con y sin los anticuerpos presentes, así como con los anticuerpos, pero con sus sitios de unión bloqueados por la presencia de una concentración saturante de péptido c-myc en la solución. </li><li> Calibrar los sensores al final de cada ejecución con una solución de saturación de anticuerpos anti-c-Myc (250 nm). Esto ayuda en la normalización de la respuesta de los sensores y determinar la ocupación fraccional basado en el perfil biofuncionalización de cada ejecución. </li><li> Corregir la deriva en la dirección X e Y utilizando el software de alineación de la imagen. </li></ol>

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</ol>

Agradecemos a George Anderson por sus útiles comentarios y discusiones. Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Nanociencia del Laboratorio de Investigación Naval y el Premio de Asociación de Investigación del Consejo Nacional de Investigación.

La técnica de imagen LSPR descrita en este trabajo tiene numerosas ventajas sobre las metodologías más tradicionales para detectar secreciones celulares. En primer lugar, la resolución temporal de nuestra técnica es del orden de segundos, mientras que la alternativa comercial, un ensayo de inmunosand conocido como EliSpot, tiene una resolución temporal típica de 2 a 3 días. 7,32 Como resultado, pudimos resolver cambios repentinos en la tasa de secreción de proteínas, como el que se muestra en la Figura 6. En segundo lugar, tener matrices distribuidas sobre el chip permite rastrear la señal secretada en el espacio y el tiempo, lo que permite comparaciones más rigurosas con modelos de secreción celular basados en difusión. Además, las matrices como la matriz de control que se muestra en la Figura 6 se pueden usar para restar los cambios globales en la imagen que generalmente surgen de factores instrumentales como la deriva del enfoque. En tercer lugar, nuestra técnica no requiere modificación de las células. Si se desea, el experimento puede incorporar etiquetas de uso común, como proteínas fluorescentes, pero si existe la preocupación de que dichas etiquetas puedan afectar negativamente la viabilidad celular o la homeostasis, la naturaleza libre de etiquetas de nuestro enfoque no las requiere. En cuarto lugar, utilizando los datos espectroscópicos, hemos demostrado que se puede calcular información cuantitativa sobre la ocupación fraccionaria de los ligandos unidos a la superficie.
Existen numerosos métodos alternativos a EBL para fabricar nanopartículas metálicas. Sin embargo, hemos descubierto que el EBL proporciona una flexibilidad considerable para optimizar las dimensiones de la nanoestructura y la matriz para adaptarse mejor a la óptica y las células bajo investigación. También es fundamental el hecho de que los chips se pueden regenerar fácilmente mediante la incineración de plasma. De esta manera, un chip típico se puede usar docenas de veces. Los detalles de biofuncionalización deben modificarse para la aplicación específica. El protocolo presentado aquí conjugó la superficie con ligandos peptídicos c-myc relativamente pequeños. Los ligandos más grandes, como los anticuerpos completos, generalmente requieren más espacio y, por lo tanto, una mayor relación SPO a SPN / SPC. Independientemente, una capa SAM bien formada es esencial para prevenir la unión no específica en experimentos con células vivas. En general, los analitos de mayor peso molecular son detectados más fácilmente por LSPR. Por lo tanto, en su manifestación unicelular, esta técnica puede no ser apropiada para detectar la secreción de proteínas pequeñas, como las citoquinas. 
La configuración actual se ha utilizado para estudiar células individuales no adherentes. Hay un número significativo de proteínas de señalización secretadas y vesículas a las que los resultados reportados en este trabajo son directamente aplicables. Por ejemplo, el antígeno carcinoembrionario (CEA), que durante décadas ha sido un marcador de diagnóstico para el cáncer. Se sabe que las células de cáncer de colon secretan CEA a velocidades de miles de moléculas/célula/h y el peso molecular es de 180 kDa, que supera al de los anticuerpos IgG. Se cree que el CEA está involucrado en las vías de señalización autocrina y paracrina, pero nunca se ha medido la naturaleza espacio-temporal de estas secreciones. Nuestra técnica puede abordar directamente estas preguntas de señalización. Una extensión de este trabajo será medir la naturaleza espacio-temporal de la secreción de CEA de células individuales. 33 El trabajo futuro también se centrará en la integración de LSPRi con cultivos celulares bidimensionales y tridimensionales de células adherentes. Al incorporar matrices multiplexadas capaces de detectar una serie de proteínas secretadas en paralelo, esta técnica tiene el potencial de abrir una nueva ventana a las secreciones celulares y cómo influyen en las células vecinas.

Comunicación entre celular es crucial para la regulación de muchas actividades fisiológicas dentro y fuera de la célula. Una variedad de proteínas y vesículas puede ser secretada que, posteriormente, activar procesos celulares complejos, tales como la diferenciación, la curación de heridas, la respuesta inmune, la migración, y la proliferación. 1-5 de fallos de funcionamiento de las vías de señalización inter-celulares han sido implicados en numerosos trastornos, incluyendo el cáncer, la aterosclerosis , y la diabetes, para nombrar unos pocos. El ensayo óptima secreción celular debe ser capaz de mapear espacialmente y temporalmente la proteína secretada de interés sin interrumpir las vías de señalización pertinentes. De esta manera las relaciones causales entre los perfiles de concentración y la respuesta de las células receptoras se pueden deducir. Por desgracia, muchas de las técnicas a base de fluorescentes más comúnmente utilizados no cumplen con estos criterios. Proteínas de fusión fluorescentes se pueden utilizar para etiquetar el analito wentro de la célula, pero puede interrumpir la vía secretora, o si secretada, resulta en una luz difusa fuera de la célula, que es difícil de cuantificar. Ensayos basados ​​en immunosandwich fluorescentes son las técnicas más comúnmente utilizadas para la detección de secreciones celulares pero típicamente requieren el aislamiento de células individuales 6-11. Además, la introducción del anticuerpo de detección típicamente se detiene o termina el experimento y el tamaño de las etiquetas de anticuerpos, 150 kDa para la IgG, es un impedimento para la señalización corriente abajo. Debido a estos obstáculos es preferible que una técnica de etiqueta libre de ser utilizado para las secreciones de proteínas imagen y entre las tecnologías existentes de etiqueta libre, resonancia de plasmón superficial (SPR) y localizada resonancia de plasmón superficial (LSPR) sensores son excelentes candidatos 12-17. Estos sensores han sido ampliamente utilizados para estudios de unión de analito de proteínas, exosomas y otros biomarcadores. 18-24 de En el caso de LSPR, la nanostr plasmónicauctures pueden ser modelados litográficamente en cubreobjetos de vidrio y emocionado usando la luz visible a través de las configuraciones estándar de microscopía de campo amplio. Debido a su huella de nanoescala, la mayoría del sustrato de vidrio está disponible para las técnicas de imagen comunes como de campo brillante y microscopía de fluorescencia haciendo así estas sondas adecuado para la integración con la microscopía de células vivas 25-28. Hemos demostrado la medición en tiempo real de las secreciones de anticuerpos a partir de células de hibridoma utilizando nanoestructuras plasmónicas oro funcionalizado con resoluciones espaciales y temporales de 225 ms y 10 m, respectivamente. La configuración básica de chip se ilustra en la Figura 1. 28 La trayectoria de la luz de salida del microscopio se divide entre una cámara CCD utilizada para las imágenes y un espectrómetro junto fibra óptica para la determinación cuantitativa de ocupación fraccional de una matriz dada de nanoestructuras (Figura 2 ). El protocol se presenta en este artículo se describe el diseño experimental para la medición en tiempo real de las secreciones de células individuales y al mismo tiempo el control de la respuesta de las células por medio de la microscopía de campo claro estándar. El enfoque multidisciplinario incluye la fabricación de nanoestructuras, la funcionalización de las nanoestructuras para la alta afinidad de unión de analitos, la optimización de la superficie tanto para minimizar la unión no específica y la caracterización de las constantes cinéticas uso de una superficie comercial Plasmon Resonance (SPR) instrumento, la integración de las líneas celulares sobre el sustrato, y el análisis de imágenes y datos espectrales. Anticipamos que esta técnica es una tecnología que permite la asignación de espacio-temporal de las secreciones celulares y sus relaciones causales con las células receptoras.

<table><tbody><tr><td>25&#160; cubreobjetos de vidrio de mm de diámetro</td><td>Bioscience Tools&nbsp;</td><td>CSHP-No1.5-25&</td><td>nbsp; 170&plusmn; 5 y micro; m es óptimo</td></tr><tr><td>Poli-metacrilato de metilo</td><td>Microchem</td><td>PMMA 950 A4</td><td></td></tr><tr><td>Lactato de etilo metacrilato de metilo</td><td>Microchem</td><td>MMA EL6</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador de haz de electrones</td><td>Temescal</td><td>FC-2000</td><td></td></tr><tr><td>Litografía por haz de electrones</td><td>Raith</td><td>Series 150</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320110</td><td></td></tr><tr><td>CR-7 Grabador de cromo</td><td>Cyantek</td><td>CR-7</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fuerza atómica</td><td>Veeco</td><td>Nanoscope III</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de incineración por plasma Technics</td><td></td><td>Series 85 RIE</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)</td><td>Prochimia</td><td>TH 001-m8.n3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)</td><td>Prochimia</td><td>TH 003m11n3-0.1</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)</td><td>Prochimia</td><td>TH 002-m11.n3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de resonancia de plasmones de superficie</td><td>Biorad</td><td>XPR36</td><td></td></tr><tr><td>Chip de oro desnudo</td><td>Biorad</td><td>GLC</td><td>chip Plasma ashed para eliminar la</td></tr><tr><td>monocapa 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida</td><td>Thermo</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Thermo</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Pentilamina-Biotina&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21345</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Neutraavidina</td><td>Thermo</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Thermo</td><td>28374</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td>El microscopio está equipado con un objetivo de inmersión en aceite 40X; Incubación 2 y humedad de la cámara CCD de Pecon GmbH</td></tr><tr><td></td><td>Espectrómetro Hamamatsu</td><td>Orca R2</td><td>refrigerado termoeléctricamente (16 bits)</td></tr> <tr><td>Ocean Optics</td><td>QE65Pro</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Spectrasuite</td><td>Ocean Optics</td><td>versión1.4</td><td></td></tr><tr><td>péptido c-myc HyNic Tag</td><td>Solulink</td><td>SP-E003</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo</td> <td>monoclonal anti-c-mycSigma-Aldrich</td><td>M4439</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular de hibridoma</td>, <td>ATCC</td><td>CRL-1729</td><td></td></tr>, <tr><td>solución antibiótica antimicótica (100&times;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Medios libres de suero RPMI 1640&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11835-030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine DHPE</td><td>Life Technologies</td><td>L-1392</td><td></td></tr></tbody></table>

una técnica-label libre para el imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

La comunicación intercelular es una parte integral de un sistema complejo que ayuda a mantener las actividades celulares básicas. Como resultado, el mal funcionamiento de dicha señalización puede provocar muchos trastornos. Para comprender la señalización de célula a célula, es esencial estudiar la naturaleza espacial y temporal de las moléculas secretadas por la célula sin perturbar el entorno local. Se han desarrollado varios ensayos para estudiar la secreción de proteínas, sin embargo, estos métodos suelen basarse en sondas fluorescentes que interrumpen las vías de señalización relevantes. Para superar esta limitación, se requiere una técnica sin etiquetas.
En este artículo, describimos la fabricación y aplicación de una tecnología de imágenes de resonancia de plasmón de superficie localizada sin marcadores (LSPRi) capaz de detectar secreciones de proteínas de una sola célula. Las nanoestructuras plasmónicas se modelan litográficamente en un cubreobjetos de vidrio estándar y se pueden excitar utilizando luz visible en microscopios ópticos disponibles en el mercado. Solo una pequeña fracción del cubreobjetos está cubierta por las nanoestructuras y, por lo tanto, esta técnica es muy adecuada para combinar técnicas comunes como la fluorescencia y las imágenes de campo claro.
En este protocolo se utiliza un enfoque multidisciplinario que incorpora la nanofabricación de sensores y la posterior biofuncionalización, la caracterización cinética de unión del ligando y el analito, la integración del chip y las células vivas, y el análisis de la señal medida. En su conjunto, esta tecnología permite un enfoque general sin etiquetas para mapear las secreciones celulares y correlacionarlas con las respuestas de las células cercanas.

En un estudio típico de secreción de células vivas existen múltiples modos de recogida de datos que tiene lugar. La figura 3 muestra una superposición de una imagen LSPRi, lo que pone de relieve las matrices cuadradas, y una imagen iluminada de luz transmitida que pone de relieve la célula abajo a la izquierda. Los datos se recogen típicamente durante un período de 3 horas, seguido por la introducción de una solución saturante de analito para el cálculo de normalización se describe a continuación. Las imágenes de fluorescencia también se puede integrar en la rutina de recopilación de datos por la conmutación automática de un cubo de filtro. En la figura 4 una célula teñida con el colorante fluorescente membrana rodamina DHPE exhibe extensiones lamellipodia como (flechas). Si estas extensiones fueron a solaparse con los arreglos que les dan un falso positivo para la secreción de proteínas. Tener múltiples modos de imágenes puede ayudar a identificar estos hechos. La Figura 5 muestra datos de espectrometría de antes y de popaer la introducción de una solución de saturación (400 nM) de adquirirse comercialmente anticuerpos anti-c-myc a los arrays funcionalizados c-myc. No hay células estaban presentes en este experimento. El espectro muestra tanto un desplazamiento hacia el rojo y un aumento en la intensidad. La diferencia entre las áreas bajo las dos curvas se traduce en un aumento en la intensidad de la imagen en el modo de matriz LSPRi en la cámara CCD. Un enfoque menos el análisis de datos cuadrados no lineales ha sido desarrollado para inferir la ocupación fraccional de ligandos unidos a la superficie de los espectros. 30,31 Al final del experimento, los valores de intensidad saturado (es decir, fraccionada ≈ ocupación 1) se utilizan para calcular una respuesta normalizada para cada matriz mediante la siguiente fórmula: ¿Dónde están la intensidad normalizada en el tiempo t punto, la intensidad inicial al comienzo del experimento, intensidad final saturada, y se mide la intensidad de la matriz en el momento t punto </em&gt; respectivamente. Los valores normalizados de dos matrices se muestran en la Figura 6. Una matriz estaba dentro de 10 micras de la célula bajo investigación mientras que el otro, utilizado como control, era una distancia de 130 m de la célula. El aumento repentino en la respuesta normalizada de la matriz más cerca de la celda respecto a la respuesta plana de la matriz de control es indicativo de una ráfaga localizada de anticuerpos secretados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig1.jpg" /> Figura 1. Diseño del sensor. Un dibujo que representa la geometría de un experimento típico de la secreción de células vivas. La célula (esferoide azul) se deposita sobre al chip LSPR que contiene matrices de nanoestructuras de oro biofuncionalizadas. En la vista ampliada-in, la secreción celular de interés, en este caso los anticuerpos mostrados como moléculas en forma de Y, se mide como se unen a la superficiede las nanoestructuras funcionalizados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig2.jpg" /> Figura 2. Configuración óptica. La luz iluminada por una lámpara halógena es primero filtrada por un filtro de paso largo (LP). La luz está polarizada linealmente (P1) y se ilumina la muestra a través de un objetivo de 40X / 1.4 NA. La luz dispersada es recogida por el objetivo y se pasa a través de un polarizador cruzado (P2). Un divisor del haz 50/50 (BS) se inserta en la trayectoria de la luz recogida para espectroscópico simultánea y análisis de imágenes. Arriba a la derecha:. Una imagen microscopía de fuerza atómica de 9 nanoestructuras individuales separadas por un lanzamiento de 300 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí</a>para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig3.jpg" /> Figura 3. Vivo Cell LSPRi Estudio. Un fusionó imagen LSPRi luz transmitida y que muestra una sola célula de hibridoma (abajo a la izquierda), rodeada de 12 matrices. Esta es una imagen de contraste mejorado. La barra de escala es de 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig4.jpg" /> Figura 4. Estudio de fluorescencia de células vivas. Una imagen en color falso fluorescente de una sola célula de hibridoma se tiñeron con rodamina DHPE, que es un colorante de la membrana. En el modo de imágenes fluorescentes las matrices generalmente no son visibles, sin embargo, una matriz cercano es observable aquí como abcarecer de plaza en la esquina inferior derecha. La célula puede ser visto para ser separados de la matriz aunque extensiones como tentáculos (posiblemente filopodios o lamellipodia) se extiende hacia el exterior de las células (flechas). La barra de escala es de 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig4large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig5.jpg" /> Figura 5. espectral modalidad. Los espectros obtenidos a partir de una matriz funcionalizado c-myc antes y después de la introducción de 400 nM solución de anticuerpos anti-c-myc. No hay células estaban presentes en este estudio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig5large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src= &quot;/ files / ftp_upload / 53120 / 53120fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6. Secreción sola célula. La respuesta de una matriz situada dentro de 15 micras de una sola célula y una situada 130 m de distancia (Control). La barra de escala es de 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig6large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La comunicación entre celulares es fundamental para el control de diversas actividades fisiológicas dentro y fuera de la célula. En este trabajo se describe un protocolo para la medición de la naturaleza espacio-temporal de las secreciones de células individuales. Para ello, se utiliza un enfoque multidisciplinario que integra nanoplasmonic etiqueta libre de detección con imágenes de células vivas.

Una técnica-Label libre para el Imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

El objetivo general del siguiente experimento es medir la secreción de proteínas a partir de células individuales con alta resolución temporal y espacial. Esto se logra mediante la fabricación litográfica de nanosensores plasmónicos de oro sobre cubreobjetos de vidrio para la obtención de imágenes sin marcadores de secreciones celulares individuales. Como segundo paso, el chip sensor se limpia y recubre con una monocapa autoensamblada, y luego se funcionaliza con ligandos que tienen una alta afinidad por las proteínas analito secretadas.A continuación, las células se integran en los chips de sensor funcionalizados para medir sus secreciones en el espacio y el tiempo. Los resultados muestran que las secreciones proteicas de células individuales pueden mapearse tanto espacial como temporalmente sin necesidad de etiquetado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la comunicación intercelular, como la manera en que las vías de señalización paracrina y autocrina regulan la motilidad celular.Para comenzar este procedimiento, deposite una película delgada de cromo de 10 nanómetros sobre cubreobjetos previamente limpios mediante evaporación por haz de electrones para evitar efectos de carga durante el trazado y la visualización de nanoestructuras. A continuación, gire la primera capa de resist de doble capa que consiste en etil lactato, copolímero de metilmetacrilato a 2000 RPM durante 45 segundos. Luego, caliente el sustrato a 150 grados Celsius tras permitir que el sustrato se enfríe a temperatura ambiente.Centrifugue la segunda capa de polimetacrilato de metilo a 3000 RPM durante 45 segundos y hornee el sustrato a 150 grados Celsius. Patronee el resist de doble capa utilizando litografía por haz de electrones o EBL. Revele en una mezcla de alcohol isopropílico o IPA y metil isobutil cetona, o MIBK, en una proporción de dos a uno y enjuague con IPA.Elimine el cromo del área desarrollada de nanoestructuras mediante ataque húmedo utilizando CR Seven durante 10 segundos a temperatura ambiente y luego enjuague con agua desionizada, agua destilada. Depósito una película de titanio y oro sobre el sustrato utilizando el evaporador por haz de electrones tras la deposición de oro. Retire la bicapa de copolímero mediante resistencia al sumergir el sustrato en acetona durante cuatro horas.A continuación, inspeccione el sustrato utilizando un microscopio electrónico de barrido para confirmar la forma y el tamaño de la nanoestructura. Las nanoestructuras resultantes están típicamente separadas por un paso de 300 nanómetros. Las matrices de 20 por 20 nanoestructuras están espaciadas 30 micrones de centro a centro.Dejando suficiente espacio para la imagen de células, un chip típico contendrá 300 matrices. Elimine el cromo restante del sustrato mediante ataque húmedo utilizando CR seven como agente de grabado durante 60 segundos a temperatura ambiente. Luego enjuague el sustrato con agua destilada desionizada.Luego, inspeccione un subconjunto de matrices utilizando el microscopio de fuerza atómica para verificar el tamaño y la uniformidad. Este cubreobjetos de vidrio con patrón puede utilizarse varias veces, siempre que se sigan los procedimientos adecuados de limpieza y regeneración de los chips de resonancia de plasmones superficiales localizados o LSPR. Realice la limpieza por plasma a una potencia de 40 vatios en una mezcla de 300 mililitros de 5% de hidrógeno y 95% de argón durante 45 segundos.Funcionalice la superficie de oro y las nanoestructuras inmediatamente después de la limpieza con plasma. Sumerja el chip en una solución etanólica de tiol de dos componentes que consiste en una proporción de tres a uno de SPO y SPC. Después de dejar el chip en la solución de tiol durante la noche para formar una monocapa autoensamblada, enjuáguelo con etanol y séquelo con gas de nitrógeno. Coloque el chip de LSPR dentro de un soporte microfluídico personalizado colocando el chip sobre una pieza inferior de aluminio.Luego, coloque el chip entre esta pieza inferior y una junta de silicona, y una pieza superior de plástico transparente, utilizando cuatro tornillos para sujetar el conjunto. Para una aplicación típica de tiol basada en SPC, aplique por goteo 300 microlitros de una mezcla uno a uno de EDC 133 milimolar y NHS 33 milimolar en agua destilada desionizada para activar los grupos carboxilo del componente de tiol SPC. Después de esperar 10 minutos, enjuague manualmente la superficie con PBS 10 milimolar y, a continuación, conjuge el grupo carboxilo activado con el ligando de interés aplicando por goteo 300 microlitros de la solución del ligando.Después de esperar una hora y enjuagar la superficie con PBS de 10 milimolar gota a gota, añadir 300 microlitros de etanolamina 0,1 molar en PBS sobre el chip para minimizar la unión no específica. Después de esperar 10 minutos, lavar la etanolamina con PBS que contiene 0,005 % de Tween 20 o PBST 20. A continuación, colocar una pieza de cuarzo encima del chip para reducir las fluctuaciones en los datos relacionadas con un menisco cambiante.Mantenga el chip húmedo con tampón PBST 20 mientras lo coloca en el microscopio. Conecte la tubería microfluídica al ensamblaje y haga fluir el tampón hasta alcanzar un estado estacionario. Luego, coloque firmemente el ensamblaje del chip LSPR en el soporte de muestra del estadio calentado.La configuración óptica para este método se muestra aquí. La luz de la lámpara de halógeno pasa a través de un filtro de paso largo de 593 nanómetros para eliminar las longitudes de onda que no contribuyen a la respuesta nano plasmónica. Luego, la luz se polariza linealmente y la muestra se ilumina mediante un objetivo de 40 x 1,4 de apertura numérica para la excitación de las nanoestructuras plasmónicas de oro.La luz dispersada se recoge mediante el objetivo y se hace pasar a través de un polarizador cruzado para reducir la señal de fondo proveniente del sustrato de vidrio. Se inserta un divisor de haz 50/50 en la trayectoria de la luz recogida para permitir un análisis espectroscópico e imagenológico simultáneo. Después de permitir que el montaje y el microscopio se equilibren durante al menos dos horas, alinee el chip utilizando la palanca de control para que la matriz central quede alineada con la fibra óptica para espectroscopia.Después de cultivar y pelotar las células híbridas DOMA mediante centrifugación, recójales y luego evalúe su viabilidad antes de introducirlas en los chips LSPR. A continuación, introduzca manualmente 50 microlitros de la solución celular en los chips LSPR con una micropipeta. Finalmente, lave las células restantes en solución con medio fresco sin suero utilizando un sistema de perfusión microfluídico para preparar los chips LSPR para la obtención de imágenes.Se muestra aquí una superposición de una imagen de microscopía de resonancia de plasmón superficial localizado (LSPR), que resalta los arreglos cuadrados, y una imagen iluminada por luz transmitida, que resalta la célula en la parte inferior izquierda. Una célula teñida con el colorante fluorescente de membrana rod Domine, DHPE exhibe extensiones similares a filopodios. Si tales extensiones se superpusieran con los arreglos, darían un falso positivo en los datos de espectrometría de secreción proteica antes y después de la introducción de una solución saturante de anticuerpos antis cmic a los arreglos funcionalizados con cmic, lo cual se muestra aquí.Este método se utiliza para calibrar los arreglos. La calibración de los arreglos ayuda a normalizar la respuesta de los sensores y a determinar la ocupación fraccional basándose en el perfil de biofuncionalización de cada ensayo. Se utiliza un instrumento SPR comercial para determinar la constante de disociación, así como para estudiar la resistencia a la unión no específica utilizando el mismo protocolo descrito para el chip LSPR.Se muestran aquí los valores normalizados de dos matrices. Una matriz estaba a menos de 10 micrómetros de la célula, mientras que el control estaba a 130 micrómetros de la célula. El aumento repentino en la respuesta normalizada de la matriz más cercana a la célula, en comparación con la respuesta plana de la matriz de control, indica una ráfaga localizada de anticuerpos secretados.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir las secreciones de proteínas de células individuales con alta resolución espacial y temporal.

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Cuantificación de parámetros espaciotemporales de la exocitostosis celular en células micropatr babeadas

Presentamos un método para la adquisición de cursos de tiempo reportero de fluorescencia de células individuales utilizando matrices micropatterned. El protocolo describe la preparación de matrices unicelulares, la configuración y el funcionamiento de la microscopía de lapso de tiempo de barrido de células vivas y una herramienta de análisis de imágenes de código abierto para la preselección automatizada, el control visual y el seguimiento de los cursos de tiempo de fluorescencia integrados en...

Imágenes de células vivas de matrices unicelulares (LISCA) - una técnica versátil para cuantificar la cinética celular

El método de imágenes intravitales descrito aquí utiliza la segunda generación armónica de colágeno y la fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H para segmentar de forma no invasiva un microambiente tumoral no etiquetado en compartimentos tumorales, estromales y vasculares para un análisis en profundidad de imágenes intravitales 4D.

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

Aprende a medir secreciones proteicas de células individuales con alta resolución espacio-temporal usando nanosensores plasmónicos de oro sin etiquetado. Este método permite mapear dinámicas de secreción celular en tiempo real.

Una técnica-Label libre para el Imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula

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