Una técnica-Label libre para el Imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula

El objetivo general del siguiente experimento es medir la secreción de proteínas de células individuales con alta resolución temporal y espacial. Esto se logra mediante la fabricación litográfica de nanosensores plasmónicos de oro en cubreobjetos de vidrio para la obtención de imágenes sin etiquetas de secreciones de una sola célula. Como segundo paso, el chip sensor se limpia y se recubre con la monocapa autoensamblada y luego se funcionaliza con ligandos que tienen una alta afinidad por las proteínas del analito secretadas.

Las células Next se integran en los chips sensores funcionalizados para medir sus secreciones en el espacio y el tiempo. Los resultados muestran que las secreciones de proteínas de las células individuales se pueden mapear tanto espacial como temporalmente sin necesidad de etiquetado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la comunicación intercelular, como la forma en que las vías de señalización paracrinas y autocrinas gobiernan la motilidad celular.

Para comenzar este procedimiento, deposite una película delgada de cromo de 10 nanómetros en cubreobjetos previamente limpiados por evaporación por haz de electrones para evitar efectos de carga durante el modelado y la obtención de imágenes de las nanoestructuras. Después de este giro, la primera capa de resistencia bicapa que consiste en lactato de etilo, copolímero de metilmetacrilato a 2000 RPM durante 45 segundos. Luego hornee el sustrato a 150 grados centígrados después de dejar que el sustrato se enfríe a temperatura ambiente.

Girar la segunda capa de polimetilmetacrilato a 3000 RPM durante 45 segundos y hornear el sustrato a 150 grados centígrados. La bicapa resiste el uso de litografía por haz de electrones o EBL. Desarrolle un alcohol isopropílico o IPA metil isobutil cetona, o MIBK en una proporción de dos a uno y enjuague con IPA.

Elimine el cromo del área desarrollada de las nanoestructuras mediante grabado húmedo con grabado CR seven durante 10 segundos a temperatura ambiente y luego enjuague con agua destilada destilada desionizada Deposite una película de oro y titanio en el sustrato utilizando el evaporador de haz de electrones después de la deposición de oro. Levante la bicapa de copolímero. Resiste remojando el sustrato en acetona durante cuatro horas.

A continuación, inspeccione el sustrato con un microscopio electrónico de barrido para confirmar la forma y el tamaño de la nanoestructura. Las nanoestructuras resultantes suelen estar separadas por un paso de 300 nanómetros. Las matrices de nanoestructuras de 20 por 20 están espaciadas por 30 micras de centro a centro.

Dejando un amplio espacio para la obtención de imágenes celulares, un chip típico contendrá 300 matrices. Retire el cromo restante del sustrato a través del borde húmedo con grabado CR seven durante 60 segundos a temperatura ambiente. A continuación, enjuague el sustrato con agua destilada desionizada.

A continuación, inspeccione un subconjunto de matrices utilizando el microscopio de fuerza atómica para verificar el tamaño y la uniformidad. Este cubreobjetos de vidrio estampado se puede usar varias veces, siempre que se sigan los procedimientos de limpieza adecuados para limpiar y regenerar la superficie localizada, los chips de plasma y resonancia o LSPR. Cenizas de plasma a una potencia de 40 vatios en una mezcla de 300 mili a 5% de hidrógeno y 95% de argón durante 45 segundos.

Funcionalizar la superficie de oro y las nanoestructuras inmediatamente después de la incineración del plasma. Sumergiendo el chip en una solución de etanol tiol de dos componentes que consta de una proporción de tres a uno de SPO y SPC. Después de dejar el chip en la solución de tiol durante la noche para formar una monocapa autoensamblada, enjuáguelo con etanol y seque con gas nitrógeno, cargue el chip LSPR dentro de un soporte microfluídico hecho a medida colocando el chip en una pieza inferior de aluminio.

A continuación, intercala el chip entre esta pieza inferior y una junta de silicona y una pieza superior de plástico transparente con cuatro tornillos para sujetar el conjunto. Para una aplicación típica de tiol basada en SPC, aplique una capa de 300 microlitros de una mezcla uno a uno de 133 milimolares de EDC y 33 milimolares de NHS en agua destilada desionizada para activar los grupos carboxilo del componente tiol de SPC. Después de esperar 10 minutos, enjuague manualmente la superficie con PBS 10 milimolar, luego conjugará el grupo carboxilo activado con el ligando de interés mediante una capa de caída de 300 microlitros de la solución del ligando.

Después de esperar una hora y enjuagar la superficie con un código de gota de PBS de 10 milimolares, 300 microlitros de etanolamina 0,1 molar en PBS en el chip para minimizar la unión inespecífica. Después de esperar 10 minutos, lavar la etanolamina con PBS que contenga 0,005% entre 20 o PBST 20. A continuación, coloque una pieza de cuarzo sobre el chip para reducir las fluctuaciones en los datos relacionados con un menisco cambiante.

Mantenga el chip mojado con el tampón PBST 20 mientras lo monta en el microscopio. Conecte el tubo microfluídico al conjunto y al tampón de flujo hasta que se alcance un estado estacionario. A continuación, coloque el conjunto de chips LSPR firmemente en el portamuestras de la etapa calentada.

La configuración óptica para este método se muestra aquí. La luz de la lámpara halógena pasa a través de un filtro de paso largo de 593 nanómetros para eliminar las longitudes de onda, que no contribuyen a la respuesta nanoplasmónica. A continuación, la luz se polariza linealmente y la muestra se ilumina a través de un objetivo de apertura numérica de 40 x 1,4 para la excitación de las nanoestructuras de oro plasmónico.

La luz dispersada es recogida por el objetivo y pasa a través de un polarizador cruzado para reducir la señal de fondo del sustrato de vidrio. Se inserta un divisor de haz 50 50 en la trayectoria de luz recolectada para el análisis espectroscópico y de imágenes simultáneo. Después de permitir que el ensamblaje y el microscopio se equilibren durante al menos dos horas, alinee el chip con el joystick para que la matriz central esté alineada con la fibra óptica para la espectroscopia.

Después de cultivar y peletizar células DOMA híbridas por centrifugación, recoseche y luego pruebe la viabilidad antes de introducirlas en los chips LSPR. A continuación, introduzca 50 microlitros de la solución celular manualmente en los chips LSPR con una micropipeta. Finalmente, lave las células restantes en solución con medios frescos sin suero utilizando un sistema de profusión microfluídica para preparar los chips LSPR para la obtención de imágenes.

Aquí se muestra una superposición de una imagen de imagen LSPR, que resalta las matrices cuadradas y una imagen iluminada por luz transmitida, que resalta la celda en la parte inferior izquierda. El DHPE, una célula teñida con la varilla de tinte de membrana fluorescente Domine, exhibe extensiones similares a las de los filopodios. Si tales extensiones se superpusieran con las matrices, darían un falso positivo para los datos de espectrometría de secreción de proteínas antes y después de la introducción de una solución saturante de anticuerpos antis CMIC a las matrices funcionalizadas de CMIC.

Este método se utiliza para calibrar las matrices. La calibración de las matrices ayuda a normalizar la respuesta de los sensores y a determinar la ocupación fraccional en función del perfil de biofuncionalización de cada ejecución. Se utiliza un instrumento SPR comercial para determinar la constante de disociación, así como para estudiar la resistencia a la unión no específica utilizando el mismo protocolo que se describe para el chip LSPR.

Aquí se muestran los valores normalizados de dos matrices. Una matriz estaba a menos de 10 micrómetros de la célula, mientras que el control estaba a 130 micrómetros de la célula. El aumento repentino en la respuesta normalizada de la matriz más cercana a la célula en relación con la respuesta plana de la matriz de control es indicativo de una ráfaga localizada de anticuerpos secretados.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir las secreciones de proteínas de células individuales con alta resolución espacial y temporal.