Name: La investigación de la regeneración funcional en organotípicos médula espinal Co-culturas cultivadas en Arrays Multi-electrodos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprende a estudiar la regeneración funcional de conexiones intramedulares en cultivos organotípicos de médula espinal usando matrices multielectrodos. Este método permite evaluar la regeneración neuronal en tiempo real.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza (n° 3100AO-120327 y 31003A_140754/1)

Cuidado de los animales estaba en conformidad con las directrices aprobadas por las autoridades locales suizos (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Berna, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, rupias de aprobación. 52/11 y 35/14). Estas directrices están de acuerdo con la Directiva de la Comunidad Europea 2010/63 / UE. Nota: El trabajo en una campana de flujo laminar con instrumentos y soluciones estériles para todos los pasos 1 - 5 incluyendo sub-etapas. 1. Preparación de los AMUMA Nota: AAM están compuestos de un sustrato de vidrio, electrodos micro-fabricados de metal y una capa de aislamiento de polímero SU-8 (también ver Tscherter et al 3.). Para el propósito de este estudio, los AMA disponibles comercialmente fueron ordenados con un diseño de matriz de electrodos a medida (Figura 1 A &amp; B). Los electrodos 68 están dispuestos en una cuadrícula rectangular que se divide en dos zonas por una ranura ancha 300 micras libre de electrodos, electrcables y aislamientos iCal. Cada electrodo es 40 x 40 m de tamaño y están separados por 200 m de centro a centro. Cuatro grandes electrodos de tierra se colocan alrededor del lugar de grabación. Se diferencian de otros acuerdos ambientales multilaterales estándar disponibles en el mercado en su tamaño (21 mm x 21 mm) y no tienen cámara de registro fijo. <ol><li> Para la desinfección MEAs de enjuague en etanol al 100% (2x), etanol al 70% (1x) y agua destilada (2x) durante al menos 30 segundos cada uno. Deje que se seque. Ponga 10 - 12 AMUMA en una placa de Petri de vidrio limpio (150 mm x 25 mm) y cierre la tapa. </li><li> AAM autoclave durante 20 minutos a 120 ° C. Guarde a temperatura ambiente. </li><li> Preparar la solución de revestimiento (véase la lista de materiales) para los AMUMA y almacenar alícuotas a -20 ° C. </li><li> Ponga cada MEA en una placa de Petri estériles individuales (35 mm x 10 mm). </li><li> Utilizar una pipeta enfriada para poner 150 l solución de revestimiento refrigerado en la parte superior de los electrodos y cierre la tapa de la placa de Petri. Después de unos 10 minutos, compruebe si hay burbujas de aire en la parte superiorlos electrodos y retire suavemente con una espátula de goma cubierta si es necesario. Deje reposar durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar residuos de la solución de revestimiento, se lavan 1x con medio optimizado para prenatal y neuronas embrionarias y 2 veces con agua destilada estéril. Si AMUMA no se utilizan hasta el día siguiente, mantenerlos en agua destilada estéril a 37 ° C en la incubadora O / N. De lo contrario, vamos directamente seca a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Los ingredientes necesarios para la preparación y el crecimiento de las Culturas organotípicos <ol><li> Prepare la solución de lavado libre de calcio (ver lista de materiales). </li><li> Reconstituir plasma pollo en solución de lavado (1: 1, agite suavemente, evitar la formación de burbujas), centrifugar a 3000 xg durante unos 20 minutos y decantar el contenido claro en un tubo estéril. Alícuota 200 l en criotubos y almacenar a -20 ° C. </li><li> Reconstituir trombina a partir de plasma bovino en consecuencia (200 U / ml) y-filtro estéril (filtro de 0,2 micras de poro). Alícuotas de 200 l en crytotubes y almacenar a -20 ° C. </li><li> Durante 30 culturas preparar 100 ml de medio nutritivo (véase la lista de materiales). </li></ol> 3. Médula Espinal Tissue Disección Nota: los rendimientos de procedimiento, en función del número de embriones, rebanadas de la médula espinal durante unos 25 - 35 co-cultivos y se prepara dentro de una campana de flujo laminar en condiciones estériles. <ol><li> Aplicar una dosis letal de pentobarbital (0,4 ml) al animal madre por inyección intramuscular. Confirme anestesia profunda comprobando el reflejo de retirada pedal. Entregar embriones de rata E14 por cesárea y el sacrificio por decapitación. </li><li> La transferencia de los cuerpos de los embriones en una placa de Petri llena de solución estéril, refrigerada, lavado. </li><li> Realizar un corte transversal completo con un bisturí por encima de las extremidades posteriores y otro por encima de las extremidades anteriores y quitar las extremidades del cuerpo. A continuación, hacer un corte en el plano frontal para separar las vísceras de la pieza de la espalda que contiene el co médulard. </li><li> Para el corte en lonchas, transferir las piezas de la espalda que contienen la médula espinal de una en una en un disco de montaje y cortar con un espesor de 225 - 250 micras con un cortador de tejidos. Ponga una gota de solución de lavado en el tejido picado y transferir las rebanadas con una espátula en x 10 mm placas de Petri llenas de solución estéril, refrigerada, lavado de 35 mm. </li><li> Para cada sector por separado, diseccionar la médula espinal lejos de tejido restante. Deja ganglios de la raíz dorsal adjunto. </li><li> Deje que las rodajas de descansar durante 1 hora a 4 ° C. </li></ol> 4. Montaje espinales Rebanadas tejido del cordón en los AMUMA <ol><li> Calentar medio nutritivo estéril en la incubadora (37 ° C, ligeramente desenroscar la tapa de oxigenación). </li><li> Posición MEA con pinzas estériles con puntas de goma cubierta a TA en la placa de Petri con un microscopio estéreo con la matriz de electrodos en el enfoque. Centrar una gotita de 6 l de plasma de pollo en la matriz de electrodos limpio, libre de polvo, y estéril. Usando una pequeña espátula, deslice cuidadosamentedos secciones de la médula espinal con los lados ventrales uno frente al otro en la gotita de plasma. No toque los electrodos con la espátula. </li><li> Añadir 8 l de trombina alrededor de la gotita de plasma de pollo. Con la punta de la pipeta de la trombina, mezclar y extender la mezcla de pollo de plasma / trombina en torno a las dos rebanadas cuidadosamente. Una vez más, no toque la matriz de electrodos quebradizos directamente. Justo antes de la coagulación, aspirar el exceso de pollo de plasma / trombina. </li><li> Tapar la placa de Petri para retener la humedad alta, mientras que el conjunto de MEA / cultura se sienta durante aproximadamente 1 hora en una cámara húmeda dentro de la incubadora a 37 ° C. </li><li> Añadir con cuidado 10 l de medio nutriente a la cámara de cultivo, tapar la placa de Petri y poner de nuevo en la incubadora durante aproximadamente 30 minutos. </li><li> Coloque cada conjunto MEA / cultura con puntas estériles, cubiertas de goma en un tubo de rodillo, añadir 3 ml de medio nutritivo y cerrar herméticamente la tapa. Colocar el tubo del rodillo en el tambor rodillo giratorio con un 1 - 2 rpm en la incubadora en un 5% CO <sub&gt; 2 ambiente -Con a 37 ° C. </li><li> Cambie la mitad del medio de nutrientes después de 7 días in vitro (DIV) y después de 1 - 2 veces por semana. </li></ol> 5. Las lesiones mecánicas <ol><li> Tome la asamblea MEA / cultura con puntas estériles, de goma cubierta fuera del tubo del rodillo y colocar en una placa de Petri sin medio nutritivo bajo un microscopio estereoscópico con el tejido en el enfoque. Verifique visualmente que las dos rebanadas se fusionan. </li><li> Sostenga el MEA / cultura ensamblaje constante mediante la colocación de las pinzas con puntas de goma cubierta de la MEA. </li><li> Colocar una hoja de bisturí en la ranura de la MEA cerca de los cortes de tejido. Mantenga el bisturí en lugar horizontalmente. </li><li> Levante el bisturí manejar hasta pero dejó que la hoja de bisturí permanecer en la ranura de la MEA de tal manera que la hoja &quot;rollos&quot; de base hasta la punta y con ello corta a través del tejido que cubre la ranura. </li><li> Severas cualquier conexión de tejidos residuales con una punta de 25 G aguja si necessary. Trabajar sólo en el área dentro de la ranura y no toque los bordes de licitación. </li><li> Coloque el ensamblaje MEA / cultura en el tubo del rodillo. Proporcionar 3 ml de medio nutritivo fresco a las culturas y colocarlos de nuevo en el tambor del rodillo en la incubadora. </li></ol> 6. Registros electrofisiológicos de la actividad espontánea <ol><li> Para investigar la regeneración funcional entre las dos rebanadas de la médula espinal después del número elegido de DIV, montar el conjunto MEA / cultura en una cámara de registro en un microscopio y aplicar unos 500 solución extracelular l (véase la lista de materiales). </li><li> Esperar 10 min antes de la primera grabación para permitir que el sistema se estabilice. </li><li> Grabar 2x básicos de actividad espontánea de unos 10 minutos de cada actividad de detección de electrodo de la MEA a RT. </li><li> Para asegurar condiciones extracelulares estables, intercambiar solución extracelular después de cada sesión de grabación. </li><li> Para desinhibir la red, aplique la solución extracelular containing estricnina (1 M) y gabazine (10 mM). Espere al menos 2 minutos antes de comenzar la grabación. </li></ol> Análisis 7. Datos Nota: Para la detección de los potenciales de acción extracelularmente grabadas utilizar para cada electrodo de un detector basado en las desviaciones estándar y un discriminador subsiguiente. Este procedimiento se describe en detalle en Tscherter et al. 3. <ol><li> Visualizar la actividad neuronal detectado de cada electrodo en una parcela de trama de acuerdo con procedimientos estándar 3 (Figura 1f). </li><li> Determinar y visualizar la actividad de la red total para cada rebanada sumando el número de eventos en los canales de acuerdo dentro de una ventana deslizante de 10 ms, desplazado por los pasos de 1 ms (Figura 1G y ver Tscherter et al. 3). </li><li> Detectar en cada rebanada ráfagas individuales (clusters de actividad que aparecen en varios electrodos). Por lo tanto, Establecer un umbral mínimo de actividad máxima en el correspondiente actividad total de la red y definir cada inicio de ráfaga y al final estallar. Por ejemplo, un umbral adecuado es 25% de la amplitud media de rotura y de inicio de ráfaga puede ser definido por ser el primer evento en una ventana de tiempo de al menos 5 mseg, un extremo estallar por ser el último evento en una ventana de tiempo de al menos de 25 ms (véase Heidemann et al. 10). </li><li> Para cuantificar la regeneración funcional calcular el porcentaje de explosiones sincronizadas entre las dos rebanadas. Para ello, el cálculo de la latencia entre una explosión en uno de los sectores y la siguiente explosión en la otra rebanada. Nota: Un par de ráfaga se denomina &quot;sincronizado&quot; cuando la latencia es menor que la longitud media de ráfaga. Especialmente en co-cultivos con mucha actividad, existe la posibilidad de que ambas partes inicien casualmente una explosión en la ventana de latencia elegido. Este hecho ha de tenerse en cuenta en la cuantificación del porcentaje de syexplosiones nchronized. Para una descripción detallada de los cálculos ver Heidemann et al. 10. </li></ol> 8. Fijación de las Culturas y la inmunohistoquímica <ol><li> Para todas las medidas que incluyen el lavado o la incubación asegúrese de poner las culturas en una mesa basculante para garantizar la difusión adecuada de la solución a través del tejido. </li><li> Inmediatamente después de la sesión de grabación se termina tome la asamblea MEA / cultura fuera de la instalación, lo puso en una placa de Petri (35 mm x 10 mm) y añadir unos 2 ml de solución extracelular. </li><li> Para separar las rodajas de las capas de células que rodean que se han formado durante el tiempo in vitro, tener una punta de pipeta 10 l y el círculo de las rebanadas. Preste atención a no dañar los cultivos. Es posible omitir este paso, pero la incorporación de más adelante es más fácil cuando se realiza. </li><li> Use una aguja delgada jeringa no metálico (ver materiales de lista) en combinación con una jeringa de 1 ml lleno de soluti extracelulara soplar suavemente la cultura de la MEA. </li><li> Retire la punta de una pipeta Pasteur y adaptarse a la pera de goma en el extremo slivered. Use la parte de atrás de transferir la cultura en fijador (4% de paraformaldehído con tampón fosfato salino (PBS, 0,1 M)). No utilice la punta estándar de la pipeta Pasteur para la transferencia, ya que es demasiado pequeño y las culturas se pliega y probablemente dañado. Arreglo para el 1 - 2 horas a 4 ° C. Enjuague el MEA con agua destilada y eliminar los residuos de tejido con los dedos, pero no rayar con la uña. AAM Tienda en agua destilada a 4 ° C. </li><li> Lávese las culturas 3x en PBS durante al menos 10 minutos cada uno. Almacenar en PBS a 4 ° C o iniciar directamente con el procedimiento de tinción. </li><li> Incubar los cultivos durante al menos 90 min en solución de bloqueo (5% de suero de cabra, 1% de albúmina de suero bovino, detergente 0,3% en PBS). </li><li> Añadir el primer anticuerpo diluido en solución de bloqueo y se incuba durante 3 noches en el 4 ° C. </li><li> Lave 3x en PBS durante al leste 30 min cada uno. </li><li> Añadir el segundo anticuerpo diluido en PBS durante 2 horas a RT. </li><li> Lavar 3x en PBS durante al menos 30 min cada uno. </li><li> Transfiera las rebanadas con una pipeta Pasteur con punta eliminado en un portaobjetos. Retire el exceso de PBS y embeber con medio de montaje. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Varios elementos en el procedimiento presentado son fundamentales para la realización de experimentos precisos y reproducibles. Todas las etapas durante la preparación de los AMMA, soluciones y la producción de los cultivos de cortes se realizan bajo condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Los antibióticos no se aplican al medio nutriente, ya que pueden afectar a la actividad espontánea 14. Durante el recubrimiento MEA, la parte más importante es asegurarse de que la solución de gel de matriz extracelular se mantiene fría en todo momento. Descongelar en la nevera y mantenerlo en hielo durante todo el procedimiento para asegurar una temperatura máxima cercana a 0 ° C. Durante la preparación de la rebanadas aislamiento rápido y seccionamiento, así como prestar atención a una baja temperatura mediante el uso de hielo buffers de disección en frío aumenta el porcentaje de cultivos sanos. Por otra parte, el plasma / trombina coagulación es uno de los pasos más críticos. En primer lugar, asegúrese de que el plasma es propiamente mixed con la trombina. En segundo lugar, prestar especial atención a la eliminación de la mayor cantidad de residuos posible para asegurar la fijación correcta de los cortes a los acuerdos ambientales multilaterales. Este paso es muy sensible al tiempo; si el plazo es demasiado corto, demasiado de la mezcla de plasma / trombina se retira. Si el marco de tiempo es demasiado largo, la coagulación ya ha ocurrido, aumentando el riesgo de la eliminación de las rodajas junto con el plasma residual / trombina. Si se han previsto las lesiones mecánicas, es importante utilizar MEAs con un diseño preciso. La zona donde se pretende la lesión tiene que estar libre de electrodos, cables y aislamiento. De lo contrario, el sistema eléctrico de la MEA van a ser dañado y por lo tanto, no hay grabaciones se pueden realizar más. Otro paso crucial se refiere el tamaño de la lesión. Se ha demostrado previamente que volver a conectar dos rebanadas jóvenes después de la lesión toma alrededor de dos día 10. Para todos los experimentos, se utilizó la regla de oro que el betwe espacioen las rodajas después de la lesión no debe ser más grande que la anchura de la ranura MEA (300 micras). Un tamaño de la lesión más grande podría dar lugar a un plazo más largo para la reconexión o, si la lesión es demasiado grande, sin reconexión en absoluto. Para anotar, ex experimentos revelaron que una colocación inicial de las dos rebanadas más lejos que los resultados de 1 mm en una velocidad de conexión muy bajo. Antes del inicio de las grabaciones, un tiempo de ajuste de al menos 10 min a RT, en lugar de 37 ° C de la incubadora, y a la solución extracelular, en lugar del medio de nutrición se recomienda. Cerrar la observación del patrón de actividad durante estos minutos iniciales se asegura de que los datos medidos representan el patrón de estallido de la cultura apropiadamente después de que se inició la grabación. Para la detección de la actividad, adquisición de datos y procesamiento adicional, hardware casera (cámara de grabación, las conexiones a los amplificadores y amplificadores), los programas en LabVISTA, se utilizan C ++ y IgorPro. Configuraciones MEA comerciales y otros paquetes de software son adecuados también para estas operaciones. Aquí, las señales vistas por los electrodos se amplifican 1001 veces y, a continuación, digitalizaron a una velocidad de 6 kHz. El modelo presentado puede ser una herramienta útil para examinar las conexiones propioespinal porque in vivo, que son difíciles de estudiar sin la interferencia de ascenso y descenso tractos de fibras. El co-cultivo de dos rebanadas de la médula espinal puede eludir elegantemente este problema. Los cultivos proporcionan un microambiente que puede ser estrechamente controlada y manipulada fácilmente. Por otro lado, la entrada sensorial y supraespinal es, por supuesto faltante. Además, el proceso de la preparación de cultivo representa una situación de daño en el SNC. Las células gliales como astrocitos y microglia son conocidos para responder a lesiones con aumento de la proliferación y, por tanto, el tejido es hasta cierto punto reorganizado. En relación con el modo presentadol la formación de una cicatriz glial después de realizar las lesiones mecánicas no se observó. Una explicación podría ser que los mecanismos de adaptación de los astrocitos que ya se activaron durante el proceso de preparación y que las lesiones de las culturas no dio lugar a una respuesta aún más. Además, no hay pruebas de la participación de los inhibidores de mielina asociados, por ejemplo., Nogo-A, en el bajo potencial de regeneración de las culturas lesionadas a una edad avanzada. Sin embargo, se demostró que el tratamiento con el inhibidor de la fosfodiesterasa 4 Rolipram, empezando directamente después de la realización de las lesiones a los 23 DIV aumenta la regeneración funcional entre las lonchas 10. Estos resultados demuestran que la recuperación funcional se puede aumentar en las culturas antiguas. Notablemente, al contar el número de axones que cruzan el sitio de la lesión, se descubrió ninguna diferencia entre las culturas lesionadas a una edad temprana y culturas lesionadas a una edad avanzada. Estos hallazgos sugieren que la falta de regeneración axonal no es la razón principal fo la pérdida de la recuperación después de las lesiones tardías en la cultura y, por tanto, hacen hincapié en la necesidad de un modelo que permite el análisis funcional de la regeneración. Formación sináptica y la plasticidad sináptica podrían desempeñar un papel importante en el proceso de recuperación 10. Estos mecanismos ganaron mucha atención durante los últimos años y hoy en día es ampliamente aceptado que tienen un impacto importante en el resultado después de la lesión de la médula espinal. Por lo tanto, un modelo que proporciona condiciones estables para investigar estos procesos en aislamiento y en gran detalle sin duda puede ayudar a obtener una visión acerca de la regeneración funcional en la médula espinal.

Cultivos de cortes organotípicos del sistema nervioso central (SNC) se han utilizado ampliamente para estudiar diversos fenómenos fisiológicos y patológicos que llegan desde el desarrollo neuronal a la neurodegeneración. En comparación con los cultivos de células disociadas, rebanadas organotípicos ofrecen la ventaja de una mayor complejidad con una citoarquitectura intacto y circuitos sinápticos local. Al mismo tiempo, el tejido puede ser analizada de forma aislada sin la necesidad de implicar a la complejidad de la totalidad en contexto vivo. Por otra parte, el acceso fácil y repetida a las células de elección se justifica, el medio extracelular se puede controlar con precisión y por lo general, los modelos in vitro son menos costosos que sus homólogos en vivo. En los últimos años, diversos estudios presentan similitudes sorprendentes entre los perfiles de desarrollo de los cultivos a largo plazo en comparación con los animales correspondientes viven 1,2. Se ha demostrado que los circuitos neuronales del CNS diferentes regions expresan actividad de la red espontánea durante el desarrollo y que las rebanadas organotípicos mantienen parcialmente este fenómeno 3 -7. Preparaciones aisladas de la médula espinal se han utilizado particularmente para investigar la generación de ritmo 6 y la formación de circuitos neuronales 1. Una manera de registrar la actividad espontánea de las rebanadas organotípicos es a la cultura en la parte superior de las matrices multi-electrodo (MEA). Estos dispositivos contienen múltiples electrodos que pueden monitorear los potenciales extracelulares generados por potenciales de acción de numerosas células de forma simultánea (grabación multi-unidad). La alta resolución temporal de las grabaciones de MEA se puede utilizar para reconstruir la dinámica de actividad precisas dentro de un circuito neuronal dado. Además, en contraste con parche de sujeción de la técnica es no invasiva, que permite mediciones y resultados a largo plazo en el hecho de que las neuronas no se ven afectados en su comportamiento. Fo el propósito de este estudio, se utilizó la combinación de la médula espinal co-cultivos organotípicos y grabaciones de múltiples sitios para investigar la regeneración funcional dentro de la médula espinal. Desde adultos vertebrados superiores han potencial para recuperarse del daño de la médula espinal limitado, diferentes estrategias han sido estudiados para promover la regeneración después de lesión de la médula espinal. Hasta el momento, el tracto corticoespinal ha sido por lo general el modelo de sistema de elección para este tipo de investigaciones. Estos experimentos son típicamente mucho tiempo, costoso y requieren grandes cohortes de animales debido a la alta variabilidad dentro de los grupos individuales. Por otra parte, la evidencia sugiere que las conexiones propioespinal (neuronas que están limitados en su totalidad dentro de la médula espinal) pueden jugar un papel fundamental en el proceso de recuperación después de las lesiones de la médula espinal 8. Estas fibras son difíciles de estudiar in vivo sin la interferencia de ascenso y descenso tractos de fibras. Bonnici y Kapfhammer 9 utilizan longitudinal de la médula espinalcultivos de cortes de ratones postnatales como un enfoque alternativo. Después de realizar las lesiones mecánicas analizaron semi-cuantitativamente la regeneración de los axones morfológica entre los segmentos de la médula espinal. Observaron menos pero no axones ninguno que cruzan el sitio de la lesión en las culturas de corte a una edad madura. En contraste, las culturas que fueron lesionadas en una etapa más joven muestran una alta cantidad de regeneración axonal 5 - 7 días después de los daños. Sin embargo, no se presentó prueba para las conexiones funcionales. Por lo tanto, el desarrollo de un representante en el modelo in vitro de fibras propioespinal que permite la investigación de la regeneración funcional puede ser una herramienta valiosa para ampliar nuestros conocimientos acerca de los procesos regenerativos en la médula espinal.

<table><tbody><tr><td>Mazo multielectrodo planar</td><td>Qwane Biosciences</td><td></td><td>hecho a medida según el diseño de nuestro laboratorio</td></tr><tr><td>Medio nutritivo</td><td></td><td></td><td>Para 100 ml</td></tr><tr><td>Dulbeccos modificado Medio de Eagle</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>80 ml</td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Gibco</td><td>26050-070</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>agua destilada y</td><td></td><td></td> estéril <td>10 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento nervioso-7S [5 ng/ml]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0513</td><td>200 &micro; l</td></tr><tr><td colspan="4">reconstituido en solución de lavado con 1% de BSA</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td><td></td>de recubrimiento</tr><tr><td>Gel de matriz extracelular</td><td>BD Biosciences</td><td>356230</td><td>Debe permanecer frío en todo momento; diluir 1:50 con medio optimizado para neuronas prenatales y embrionarias</td></tr><tr><td>medio optimizado para neuronas prenatales y embrionarias</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Solución</td><td></td> <td>de lavado</td><td>[mg/L]</td></tr><tr><td>MgCl2-6H2O</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>400</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>60</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>8.000</td></tr><tr><td>Na2HPO4 anhidro</td><td></td><td></td><td>48</td></tr><tr><td>D-Glucosa (Dextrosa)</td><td></td><td></td><td>1,000</td></tr><tr><td colspan="4">Según el protocolo en http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html</td></tr><tr><td>Solución extracelular (pH 7.4)</td><td></td><td></td><td>[mM]</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>4</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td></td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>Na-piruvato</td><td></td><td></td><td>2</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>Disolvente en solución</td><td></td><td></td><td></td>bloqueadora</tr><tr><td>: Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0,3%, perjudicial si se ingiere</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td>1%</td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td>5%</td></tr><tr><td>Plasma de pollo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2366</td><td>Liofilizado, reconstituido con solución de lavado</td></tr><tr><td>Gabazina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SR-95531</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de mecamilamina</td><td>Tocris</td><td>2843</td><td>tóxico si se ingiere</td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td></td><td></td><td>nocivo, 4%</td></tr><tr><td>SMI-31</td><td>Covance</td><td>SMI-31P</td><td></td></tr><tr><td>SMI-32</td><td>Covance</td><td>SMI-32R-500</td><td></td></tr><tr><td>Estricnina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>tóxico Trombina</td><td>Merck Millipore</td><td>1123740001</td><td>irritante, sensibilizante, reconstituye con solución de lavado</td></tr><tr><td>Tubo plano de cultivo de tejidos 10 (= tubo de rodillo)</td><td>Techno Plastic Products AG</td><td>91243</td><td></td></tr></tbody></table>

la investigación de la regeneración funcional en organotípicos médula espinal co-culturas cultivadas en arrays multi-electrodos

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Los vertebrados superiores adultos tienen un potencial limitado para recuperarse de una lesión de la médula espinal. Recientemente, ha surgido evidencia de que las conexiones propioespinales son un objetivo prometedor para la intervención con el fin de mejorar la regeneración funcional. Hasta el momento, no existe ningún modelo in vitro que otorgue la posibilidad de examinar la recuperación funcional de las fibras propioespinales. Por lo tanto, se desarrolló un modelo representativo que se basa en dos secciones organotípicas de la médula espinal de ratas embrionarias, cultivadas una al lado de la otra en matrices de electrodos múltiples (MEAs). Estas rodajas crecen y, en unos pocos días in vitro, se fusionan a lo largo de los lados enfrentados entre sí. El diseño de los MEAs utilizados permite la realización de lesiones con una hoja de bisturí a través de este sitio de fusión sin infligir daño a los MEAs. Los segmentos muestran actividad espontánea, generalmente organizada en ráfagas de actividad de red, y se pueden caracterizar parámetros de actividad espacial y temporal, como la ubicación de los orígenes de las ráfagas, la velocidad y la dirección de su propagación y las latencias entre ráfagas. Con estas características, también es posible evaluar la conexión funcional de los segmentos calculando la cantidad de ráfagas sincronizadas entre los dos lados. Además, los cortes se pueden analizar morfológicamente mediante la realización de tinciones inmunohistoquímicas después de los registros. 
En este modelo se combinan varias ventajas de las técnicas utilizadas: los cortes conservan en gran medida la arquitectura original del tejido con circuitos sinápticos locales intactos, el tejido es fácil y repetidamente accesible y la actividad neuronal puede detectarse de forma simultánea y no invasiva en un gran número de puntos a alta resolución temporal. Estas características permiten investigar la regeneración funcional de las conexiones intraespinales de forma aislada in vitro de una manera sofisticada y eficiente.

Para investigar el potencial de la recuperación funcional de los co-cultivos derivados de la médula espinal de embriones de rata E14, las lesiones se realizaron en una ventana de tiempo de 8 a 28 DIV. 2 a 3 semanas más tarde, la actividad neuronal espontánea fue grabado con los acuerdos ambientales multilaterales (Figura 1 C y D). Los potenciales de acción extracelular registrados fueron identificados sin conexión para cada electrodo individual (Figura 1E). A partir de estos datos se generaron parcelas de trama (Figura 1F), seguido por parcelas actividad de la red para visualizar la actividad total por separado por cada lado (Figura 1G). En cada sector de la actividad espontánea se organiza generalmente en ráfagas. Si las rodajas están conectados funcionalmente, estas ráfagas se pueden propagar a partir de una rebanada a la otra. Por lo tanto, se calculó la cantidad de ráfagas sincronizadas entre las dos rebanadas para medir cuantitativamente la regeneración funcional. Para una descripción detallada de cómo el int transformacióno las diferentes parcelas se realiza y cómo se deriva la fórmula para calcular el porcentaje de actividad sincronizada, consulte Heidemann et al. 10. En todos los experimentos, la actividad se registró primero bajo condiciones estándar. En un segundo paso, la inhibición sináptica se bloqueó mediante la adición de estricnina (1 M) y gabazine (10 mM) a la solución del baño extracelular. Esta desinhibición conduce por lo general a un patrón de actividad más regular con ráfagas prolongados y los intervalos de ráfaga, lo cual facilita la definición de ráfagas y por lo tanto la determinación de la sincronización de la ráfaga entre las rebanadas. Culturas lesionadas a una edad temprana (7-9 DIV) muestran una alta cantidad de actividad sincronizada 2-3 semanas después de la lesión mientras que los cultivos lesionaron en etapas posteriores (&gt; 19 DIV) mostraron una clara reducción en la capacidad de regenerarse (Figura 2 A - F). Estos hallazgos indican que la capacidad de regeneraciónde conexiones funcionales en cultivos de corte de la médula espinal disminuye desde un nivel alto, que representa el estado embrionario in vivo, a un nivel bajo, que representa el estado más desarrollado in vivo, dentro de tres semanas en la cultura. ¿Qué tipos de conexiones son en realidad participan en la sincronización de estallar entre las dos rebanadas? Además de las conexiones propioespinal, las fibras también podrían surgir de las motoneuronas o dorsal neuronas ganglionares de la raíz. Se ha demostrado previamente que las neuronas del ganglio de la raíz dorsal no son relevantes para la conectividad funcional entre la médula espinal 10 rebanadas. Sin embargo, la implicación de las neuronas motoras se mantuvo una posibilidad. Desde motoneuronas son conocidos para formar conexiones colinérgicas a las neuronas de la médula espinal a través de los receptores nicotínicos de 13, la actividad de la médula co-cultivos espinales se registró a 8 DIV, un momento en que los cultivos muestran una actividad de 10 altamente sincronizados, y el antagonista nicotínico Mecamilamina (MEC, 100 mM) se añadió a la solución del baño extracelular. A la participación de las motoneuronas en la conexión entre las dos rebanadas daría lugar a una disminución en el porcentaje de la actividad sincronizada. Sin embargo, este no fue el caso (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; de control: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p&gt; 0,05, Wilcoxon prueba de pares). Estos resultados sugieren que las sinapsis colinérgicas no contribuyen a la conexión funcional entre las rebanadas. Sin embargo, ya que también se ha demostrado que las neuronas motoras a la liberación de glutamato en las sinapsis en el SNC 11, 15, estos experimentos no excluyen por completo su participación. Para identificar las motoneuronas coloraciones de inmunohistoquímica contra el neurofilamento no fosforilada H con se realizaron SMI-32. Revelaron varios cuerpos etiquetados grandes célula típica para las motoneuronas, distribuidos sobre las rebanadas (Figura 3A). El anticuerpo SMI-32 ha sido reportado para etiquetar los cuerpos celulares de motoneurons 12 y este hallazgo sostiene también cierto para los cultivos utilizados 13. También, tinciones de cuerpos celulares neuronales en general, por ejemplo, contra b-III-tubulina o NeuN, así como cuerpos de las células gliales, por ejemplo., Astrocitos con anticuerpos GFAP están en línea con otros informes y coinciden con las descripciones morfológicas de estos tipos de células ( Figura 3 B - D). Sin embargo, el etiquetado de los axones con el anticuerpo SMI-32 es preocupante (Figura 3E). Contra las expectativas, una enorme red de fibras aparece al utilizar este anticuerpo y parece similar a la tinción SMI-31 que etiqueta neurofilamento H fosforilada (Figura 3F). Una interpretación de este resultado podría ser que el reglamento de desarrollo de la fosforilación neurofilamento / desfosforilación no es tan fuerte en los cultivos utilizados en comparación con la situación in vivo. Una ocurrencia mixto de neurofilamentos fosforilados y no fosforilados en la misma axón podría Explain este hallazgo. Otra posibilidad es que los SMI-32 axones marcados surgen de las neuronas de proyección. Tsang y colegas 16 han demostrado que, por ejemplo, de columna y columna celular intermediolateral neuronas de Clark están manchadas por SMI-32, además de las motoneuronas. La proliferación de las neuritas pronunciada de tales neuronas también podría explicar la abundancia de SMI-32 fibras positivas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" /> Figura 1. Visualización y Análisis de la actividad espontánea. (A) Diagrama de un MEA. Los electrodos de platino cubierta se representan en, los cables transparentes negros en rojo y la ranura en el centro de la MEA en amarillo. (B) Primer plano de la matriz de electrodos situados en el centro de la MEA. Los diagramas son amablemente proporcionados por el Dr. M. Heuschkel. Imagen brillante de campo de un viejo cultur 8 DIV (C)e. Las lonchas han crecido y se fusionan a lo largo de los lados uno frente al otro. La barra amarilla representa la ranura electrodo-y-aislamiento libre de la MEA. Barra de escala = 400 micras (D) Línea de tiempo de los experimentos. Dos rebanadas de la médula espinal de embriones de rata E14 se colocan uno al lado del otro sobre los acuerdos ambientales multilaterales. A los pocos días, los cortes crecen y se fusionan a lo largo de los lados enfrentados entre sí. En un plazo de 8-28 DIV, lesiones completas se realizan a través del sitio de fusión. Dos a tres semanas más tarde la actividad espontánea se registra y los cultivos son fijos para tinciones inmunohistoquímicas. (E) los rastros de actividad espontánea de cada electrodo individual de una vieja cultura 23 DIV. Para la visualización más clara, sólo cada segundo trazo se ilustra. Orange trazas representan la actividad que se ha grabado desde la rebanada en el lado derecho, trazas de color azul desde el lado izquierdo. La mayoría de las ráfagas están sincronizados entre los dos. La flecha señala una ráfaga que ocurren en el segmento de la izquierda que sólo partially propagado a la división derecha. La actividad en el segmento de la derecha sin embargo no alcanzó el umbral elegido de por lo menos 25% de la actividad pico máximo promediado del lado de acuerdo y por lo tanto, no se detecta como una ráfaga. Aumentos de la derecha representan el último par explosión sincronizada. (F) de la trama parcela de la actividad se muestra en (E). (G) la actividad de red parcela con ráfagas definidos (barras por debajo de línea de base) de la actividad se muestra en (E). Adaptado de Heidemann et al., 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" /> Figura 2. Sincronizado frente Actividad No sincronizada. (A, B) parcelas de mapa de bits de las culturas lesioned a una edad temprana (en 7-9 DIV), que muestra la actividad sincronizada en condiciones estándar (A) y en virtud de desinhibición (B). (C, D) parcelas de mapa de bits de las culturas lesionadas a una edad avanzada (en&gt; 19 DIV), que muestran actividad no sincronizado en condiciones estándar (C) y bajo la desinhibición (D). (E, F) Porcentaje medio de la actividad sincronizada trazan para cada día lesión individual registrado bajo condiciones estándar (E) y en virtud de desinhibición (F). Grabaciones se tomaron 2 - 3 semanas después del día de la lesión. Adaptado de Heidemann et al., 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterización inmunohistoquímica. (A) La tinción de cuerpos celulares motoneuronal con SMI-32. (B) el etiquetado tubulina β-III de cuerpos celulares neuronales maduras y sus procesos. (C) La identificación de los astrocitos con GFAP. (D) El etiquetado de madura cuerpo celular neuronal con NeuN. (E) SMI-32 tinción de no fosforilada H. neurofilamentos (F) neurofilamentos fosforilados H identificado por SMI-31. Adaptado de Heidemann et al., 10. Tenga en cuenta que con ambos, SMI-31 y SMI-32, una gran red de fibras es visible en los cultivos. Bares AD = 20 m, H &amp; F = 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí se presenta un protocolo que se basa en rebanadas de la médula espinal cultivadas en matrices de electrodos múltiples para estudiar la regeneración funcional de conexiones propioespinal in vitro.

La investigación de la regeneración funcional en organotípicos médula espinal Co-culturas cultivadas en Arrays Multi-electrodos

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar la regeneración funcional de conexiones intrarraquídeas en cultivos co-organotípicos de médula espinal mediante matrices multielectrodo, llamadas comúnmente meas. Esto se logra cultivando dos cortes transversales de médula espinal uno al lado del otro sobre meas para imitar conexiones intrarraquídeas entre diferentes segmentos de la médula espinal. In vitro, los cortes crecen y, dentro de unos pocos días en cultivo, se fusionan entre sí por los bordes que quedan enfrentados. Como segundo paso, se realizan lesiones tras diferentes intervalos de tiempo en cultivo, lo que provoca la separación completa de las secciones. A continuación, los cultivos se dejan en el incubador durante al menos dos semanas.Con el fin de dar tiempo a las redes espinales para que regeneren, el brote de actividad entre los dos cortes muestra que los cultivos lesionados a una edad temprana presentan un alto potencial de regeneración funcional, mientras que esta capacidad se reduce claramente en los cultivos lesionados a edades posteriores. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como cortes tisulares, cultivos sobre membranas, cultivos disociados o en sueros de albúmina bovina (BSA), es que la combinación de cultivos típicos Ergon con matrices de electrodos múltiples nos permite evaluar los aspectos funcionales de la regeneración en el microentorno de la médula espinal con acceso experimental directo. Para comenzar, fabrique o adquiera matrices de electrodos múltiples prefabricadas como la que se muestra aquí, esterilice las matrices de electrodos múltiples enjuagándolas durante 30 segundos, dos veces en etanol al 100 %, una vez en etanol al 70 % y luego dos veces en agua destilada. Una vez secas, coloque de 10 a 12 matrices en una placa de Petri de vidrio y cierre la tapa después de autoclavar las matrices durante 20 minutos a 120 grados Celsius.Coloque cada matriz de microelectrodos en una placa de Petri estéril separada de 35 milímetros. Saque una pipeta enfriada del congelador. Utilícela para colocar 150 microlitros de solución fría de recubrimiento de matriz extracelular encima del electrodo.Cierre la tapa de la placa de Petri e incube la matriz durante una hora a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 10 minutos, revise la presencia de burbujas de aire sobre los electrodos y retírelas suavemente con una espátula recubierta de goma. Si es necesario, verifique la desaparición de todas las burbujas.A continuación, aspire la solución de recubrimiento. Lave el portaobjetos con medio optimizado para neuronas prenatales y embrionarias, y luego enjuáguelo dos veces con agua estéril destilada. Tras el enjuague, déjelo reposar a temperatura ambiente hasta que se seque.Inmediatamente después de la extracción de la madre, transfiera los embriones de rata E14 decapitados a una placa de Petri llena con solución de lavado estéril fría. Realice un corte transversal completo con un escalpelo por encima de las extremidades posteriores y otro por encima de las cuatro extremidades, y retire las extremidades del cuerpo. A continuación, realice un corte en el plano frontal para separar las vísceras de la porción dorsal que contiene la médula espinal.A continuación, transfiera las piezas posteriores que contienen la médula espinal, una a la vez, sobre un disco de montaje. Corte la médula a un grosor de 225 a 250 micrones utilizando un cortador de tejidos. Luego, coloque una gota de solución de lavado sobre el tejido cortado y transfiera las secciones a placas de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros llenas con solución de lavado estéril y fría.Disecar la médula espinal de cualquier tejido restante en cada una de las secciones, teniendo cuidado de dejar los ganglios de la raíz dorsal adheridos. Transferir las secciones a una placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros llena con solución de lavado estéril y fría.Luego, deje reposar las secciones durante una hora a cuatro grados Celsius. Coloque una placa de Petri con un matriz de microelectrodos recubierta en su interior bajo un microscopio estereoscópico. Enfoque la matriz y colóquela en el centro.Una gota de seis microlitros de plasma de pollo sobre la matriz de electrodos. Con una espátula pequeña, deslice cuidadosamente dos secciones de médula espinal con sus caras ventrales enfrentadas dentro de la gota de plasma de pollo. A continuación, agregue ocho microlitros de trombina alrededor de la gota de plasma de pollo.Luego, use la punta de pipeta para mezclar y extender cuidadosamente la mezcla de plasma de pollo, trombina y tejido de pollo. Justo antes de que la mezcla de plasma de pollo y trombina se vuelva demasiado filamentosa y comience a coagularse, aspire el exceso de líquido, tape la placa de Petri y colóquela en una cámara humidificada. Coloque la cámara dentro de un incubador a 37 grados Celsius durante aproximadamente una hora. Después de la incubación, agregue cuidadosamente 10 microlitros de medio nutriente a la muestra.Tape la placa de Petri y colóquela nuevamente en el incubador durante 45 minutos adicionales. A continuación, coloque cada uno de los ensamblajes de cultivo de matriz de electrodos múltiples en un tubo rotatorio y agregue tres mililitros de medio nutriente. Cierre bien la tapa y coloque el tubo rotatorio en el tambor rotatorio.Gire el tambor a una o dos RPM en el incubador a 37 grados Celsius utilizando pinzas estériles con punta de goma. Retire los ensamblajes de cultivo de matriz multielectrodo del tubo giratorio y colóquelos en una placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico. Enfoque el tejido y verifique que las dos secciones estén fusionadas.A continuación, mantenga el ensamblaje estable y coloque la hoja de bisturí en la ranura de la matriz de electrodos múltiples, cerca de las secciones de tejido. Sostenga el bisturí de forma bastante horizontal y luego levante la empuñadura del bisturí hacia arriba.Pero mantenga la hoja del escalpelo dentro del surco de la matriz de manera que la hoja gire desde la base hasta la punta, cortando el tejido y cubriendo el surco. Corte cualquier conexión residual de tejido con la punta de una aguja de calibre 25 si es necesario, trabajando únicamente en el área dentro del surco y sin tocar los bordes delicados. Devuelva los ensambles de cultivo de matriz de electrodos múltiples al tubo giratorio y agregue tres mililitros de medio nutriente fresco a los cultivos.Luego, coloque nuevamente el tubo de rodillo sobre el tambor giratorio en el incubador a 37 grados Celsius. Monte un ensamblaje de cultivo con matriz de múltiples electrodos en una cámara de registro y aplique aproximadamente 500 microlitros de solución extracelular sobre la matriz. A continuación, monte el ensamblaje en el microscopio.Espere 10 minutos para que el sistema se estabilice, y luego registre la actividad espontánea básica de cada uno de los electrodos detectores de actividad durante 10 minutos. Repita las grabaciones un total de dos veces para asegurar condiciones extracelulares estables. Cambie la solución extracelular después de cada sesión de grabación si se desea.Desinhiba la red aplicando una solución extracelular que contenga un micromolar de strict nine y 10 micromolares de gazin, y espere al menos dos minutos antes de registrar la actividad eléctrica para investigar el potencial de recuperación funcional de los cultivos co derivados de la médula espinal de embriones de rata E 14. Las lesiones se realizaron en una ventana temporal de ocho a 28 días in vitro. Dos o tres semanas después, se registró la actividad neuronal espontánea.Utilizando la matriz de electrodos múltiples, los datos brutos se transforman luego en gráficos de raster, seguidos por gráficos de actividad de red para visualizar la actividad total por separado en cada lado de cada corte. La actividad espontánea generalmente se organiza en ráfagas, mostradas aquí bajo desinhibición; los cortes que se separaron a una edad temprana aparecen aquí como funcionalmente conectados. Sin embargo, aquellos separados a una edad más avanzada aparecen asincrónicos.Utilizando esta información, se puede determinar y visualizar la cantidad de ráfagas sincronizadas entre cortes a diversas edades, tal como se muestra aquí siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la tinción inmunohistoquímica, para responder preguntas adicionales, como qué tipos celulares contribuyen a la conexión funcional entre los dos cortes longitudinales de la médula espinal.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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