Ensayos pronta entrada virales para la identificación y evaluación de compuestos antivirales

El objetivo general de este procedimiento es determinar el efecto antiviral de los compuestos de prueba frente a etapas específicas de la entrada viral temprana. Esto se logra sembrando primero las células huésped para la infección viral. El segundo paso es realizar los tratamientos con la infección viral y el compuesto de prueba en diferentes momentos y temperaturas.

A continuación, los inóculos tratados con fármaco se lavan y las células se recubren con medio basal. El paso final es incubar las células. En última instancia, se analiza la infectividad viral para determinar la influencia de los compuestos de prueba en las etapas tempranas de entrada viral de la infección viral.

Por ejemplo, se utiliza un luminómetro para evaluar la actividad de la luciferasa en el hocico de la célula debido a la infección por un virus reportero. La principal ventaja de esta técnica es que puede permitir un enfoque más basado en mecanismos para identificar agentes antivirales, particularmente aquellos dirigidos a la entrada viral. Para comenzar, en primer lugar, prepare soluciones madre de los compuestos de prueba, ácido trilogy o CHLA y colágeno PUNIC o PUG en heparina disuelta con DMSO para un control positivo en agua estéril de doble destilación para preparar las células huésped para el cultivo de ensayo.

Hepato carcinoma humano, células HUH 7.5 durante la noche en DMAM fresco suplementado con FBS y antibióticos. Recuerde seguir los procedimientos de nivel de bioseguridad dos durante todo el experimento para probar la citotoxicidad de los compuestos de prueba. Tratar las células con concentraciones crecientes de CHLA o PUG de cero a 500 micromolares diluidos en medio basal, o 1% DMSO como control negativo, y luego incubar las células durante 72 horas a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo celular.

Retire el medio y lave las células con 200 microlitros de PBS dos veces. A continuación, agregue 100 microlitros de reactivo de ensayo XT T e incube a 37 grados centígrados durante tres horas. A continuación, utilice un lector de microplacas para determinar la absorbancia a 492 nanómetros con una longitud de onda de referencia a 690 nanómetros.

Calcule el porcentaje de viabilidad con una fórmula dada a partir de estos valores. Determine las concentraciones de citotoxicidad celular del 50% para cada compuesto. Para comenzar el ensayo de inactivación viral.

Primera placa, una por 10 a la cuarta celda por pocillo. En una placa de 96 pocillos, incube las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante la noche para que se adhieran a la infección. Prepare el reporte de luciferasa Gaia marcado con el virus de la hepatitis C o las partículas del VHC como se menciona en el protocolo de texto.

En un tubo estéril mezclar 100 microlitros de CHLA o PUG de 100 micromolares con 100 microlitros de 10 al cuarto. Unidades de formación de foco o FFU de HCV para una mezcla de control positivo. VHC con heparina a una concentración final de 1000 microgramos por mililitro.

Incubar a 37 grados centígrados durante tres horas. Después de tres horas, diluya la mezcla de compuestos virales 50 veces con 9,8 mililitros de medio basal a temperatura ambiente. A continuación, prepare una nueva mezcla de compuestos virales e inmediatamente diluya esta mezcla en medio basal para la muestra de incubación de cero horas.

Después de retirar el medio de incubación de las células, agregue 100 microlitros de la solución de fármaco viral diluida por pocillo por triplicado. La solución ahora contiene 10 a la segunda FFU por pocillo incubado a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante tres horas para permitir la infección viral de las células. Después de la incubación, retire la suspensión viral de los pocillos y lave suavemente las células con 200 microlitros de PBS. Dos veces.

Incubar las células en 100 microlitros de medio basal durante 72 horas para la replicación viral y la liberación del reportero de luciferasa en el sobrenadante. A continuación, recoja el supernat de los cultivos y microtubos y centrifuga a 17.000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Para eliminar los restos celulares, mezcle 20 microlitros de cada supernat con 50 microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa gaussi y mida la luminiscencia de la actividad reportera de luciferasa en un luminómetro.

De acuerdo con las instrucciones del fabricante para la placa de ensayo de unión viral, una vez de 10 a la cuarta célula por pocillo. En una placa de 96 pocillos e incubar durante la noche para la fijación de células a la mañana siguiente. Primero, la placa de 96 pocillos que contiene la monocapa celular a cuatro grados centígrados durante una hora.

Prepare los compuestos de prueba y la mezcla de virus en hielo. Por ejemplo, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1%DMSO o soluciones de heparina HCV de control positivo con 10 al segundo virus FFU. Para cada tratamiento, aspire suavemente el medio de los pocillos de cultivo celular.

Luego agregue inmediatamente 100 microlitros de la mezcla de compuestos de prueba de virus en pocillos triplicados, teniendo cuidado de no aumentar la temperatura. Incubar la placa en un refrigerador mantenido a cuatro grados centígrados durante tres horas. Las partículas del virus se adherirán al servicio celular a cuatro grados centígrados, pero no se internalizarán.

A continuación, aspire los sobrenadantes. Lave suavemente las células dos veces con 200 microlitros de agua fría. PBS agregue 100 microlitros de medio basal a cada pocillo y luego incube a 37 grados Celsius durante 72 horas.

Por último, para cuantificar la liberación de luciferasa reportera de las células infectadas. Recoja el supernat de cada pocillo de muestra y realice el ensayo de luciferasa gaussiana para analizar la fusión y entrada viral. Enfríe previamente la placa de cultivo celular a cuatro grados centígrados durante una hora.

Después de la incubación nocturna para la unión de las células, retire el medio existente de los pocillos e infecte las células con 10 al segundo F-F-U-H-C-V en hielo. Incubar la placa a cuatro grados centígrados durante tres horas. Lave suavemente las células dos veces con 200 microlitros de PBS helado para eliminar el virus no adherido a la publicidad.

A continuación, en hielo, tratar las células con los compuestos de prueba disueltos en medio basal o medio basal con 1% de DMSO como control e incubar la placa a 37 grados centígrados durante tres horas. Esto permite la evaluación de los compuestos de prueba en la entrada del virus, que se produce a 37 grados centígrados. Aspirar el medio y lavar los virus no internalizados dos veces con 200 microlitros de tampón de citrato o PBS.

Agregue 100 microlitros de medio basal por pocillo e incube a 37 grados centígrados durante otras 72 horas. Recoja el supernat y realice el ensayo de luciferasa gaussiana como se demostró anteriormente para detectar el indicador de luciferasa liberado que se muestra A continuación se muestran los efectos de los compuestos de prueba sobre el VHC. En la activación, el virus se incubó con los compuestos de prueba durante cero o tres horas antes de la infección.

El porcentaje de inhibición de la infección viral se traza para cada tratamiento. El DMSO controlado negativo no muestra inhibición. CHLA exhibe una alta inhibición al contacto, después de la incubación de cero horas, así como después de la incubación más larga durante tres horas.

Resultados adicionales con otra prueba. Aquí se muestran los PUG compuestos, adaptando este diseño experimental general, se muestra que CHLA y PUG inhiben adicionalmente la infectividad del citomegalovirus humano o HCMV en fibroblastos pulmonares embrionarios. Aquí se muestra el efecto de CHLA y PUG en la adhesión del VHC.

Recordemos que las células se incubaron con el virus en presencia o ausencia de los compuestos de prueba a cuatro grados centígrados, y luego, al eliminar las células virales no unidas, se incubaron a 37 grados centígrados para la infección por el virus. Las barras sombreadas demuestran el efecto de C-H-L-A-P-U-G o heparina en la entrada del VHC en las células. Tenga en cuenta que en este caso, la unión viral se llevó a cabo por primera vez a cuatro grados centígrados.

Luego, después de eliminar el virus no unido, las células se incubaron con compuestos de prueba a 37 grados Celsius para la entrada viral. De manera similar, en el caso del HCMV, la infección de los fibroblastos pulmonares embrionarios tratados con CHLA o PUG muestra una fuerte inhibición de la unión viral y la entrada viral. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar los pasos a la temperatura indicada, lo que influirá en la precisión de los resultados.