Preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de Análisis metabólico en

El objetivo general del siguiente experimento es obtener fracciones mitocondriales enriquecidas que proporcionen suficientes metabolitos mitocondriales para estudios metabolómicos utilizando drosophila melanogaster. Esto se logra primero criando una cantidad suficiente de moscas para generar suficientes metabolitos para fracciones enriquecidas mitocondrialmente. Como segundo paso, las moscas se homogenizan en un homogenizador de vidrio-Teflón tipo Dounce, el cual rompe la membrana celular sin dañar la integridad mitocondrial.

A continuación, los homogenatos se someten a centrifugación diferencial con el fin de generar muestras enriquecidas en mitocondrias. Los resultados muestran que se detectaron cambios metabólicos mitocondriales pronunciados mediante este protocolo, los cuales no se detectaron mediante análisis metabolómicos basados enteramente en fracciones enriquecidas en mitocondrias y extractos de animales completos. La ventaja principal de este procedimiento frente al análisis metabolómico de moscas enteras es que el aislamiento de mitocondrias antes del análisis metabolómico permite una mayor sensibilidad y detección de los cambios en los metabolitos mitocondriales.

Para comenzar el experimento, caliente los ingredientes del alimento para moscas en una placa calefactora a 90 grados Celsius. Agite la mezcla regularmente hasta que esté homogénea y ligeramente densa. Retire el alimento de la fuente de calor y agítelo ocasionalmente cuando el alimento se enfríe a 80 grados Celsius; a continuación, agregue metil-4-hidroxibenzoato al 0,2 % TE disuelto en etanol al 95 %. Luego, divida el alimento en dos volúmenes iguales.

Asegúrese de que la temperatura del alimento haya disminuido a 50 grados Celsius y mezcle 1,1 mililitro de rapamicina 50 milimolar disuelta en etanol en un volumen y 1,1 mililitro de etanol no tratado en el segundo volumen. Para recolectar adultos, utilice un regulador de una sola etapa para suministrar dióxido de carbono puro desde un tanque de alta presión. Con un flujo continuo de cinco PS, evito la electricidad estática utilizando un tubo de plástico para canalizar el dióxido de carbono hacia un matraz filtrante de 500 mililitros con tubos para burbujear el dióxido de carbono a través del agua.

Para ello, utilice un tapón de goma con un orificio para sellar el matraz. Conecte un tubo de plástico desde la abertura lateral del matraz hasta una almohadilla de dióxido de carbono para controlar la densidad larval durante el desarrollo. Coloque 25 pares de progenitores en un frasco de cultivo y permita que depositen huevos durante 48 horas.

Luego retire los progenitores para regular la densidad de huevos y repita estos pasos utilizando la descendencia F1 emergente para obtener dos generaciones de este control de densidad. Después de dos generaciones bajo condiciones de densidad controlada, separe las moscas por sexo, colocándolas sobre la almohadilla durante no más de 10 a 15 minutos. Permita que las moscas se recuperen de la anestesia durante 24 horas antes de colocarlas en condiciones experimentales.

Designe 300 moscas por muestra para generar suficientes metabolitos para fracciones enriquecidas en mitocondrias. Transfiera 150 moscas a una jaula casera de un litro. Luego transfiera las 150 moscas restantes a una jaula separada de un litro y no sobrepoblar las jaulas con más de 150 moscas.

Utilice seis muestras replicadas por condición experimental y coloque las jaulas a 25 grados Celsius en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad para finalizar el cultivo de drosófila. Proporcione a las moscas alimento fresco cada dos o tres días en un vial con cinco mililitros de alimento para mantener la calidad del alimento durante un total de 10 días. Comience el aislamiento volcando las moscas de una jaula en un homogenizador de vidrio de teflón con tapón inferior lleno con un mililitro de tampón de aislamiento frío.

A continuación, coloque algo de mortero en hielo para mantener intactas las mitocondrias y homogenice las moscas con 15 movimientos. Teniendo cuidado de no girar el pistilo, transfiera el homogenato a un tubo de 1,5 mililitros y centrifugue el tubo a 300 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un tubo diferente y centrifugue el sobrenadante a 6.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para enriquecer las mitocondrias.

Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante que contiene la fracción citosólica. Resuspenda el precipitado en 300 microlitros de tampón de lavado pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Repita suavemente los pasos anteriores para el segundo giroscopio de jaula.

Luego, combine los pellet resuspendidos de ambas jaulas en un tubo microcentrífugo criogénico y centrifugue los pellet combinados a 6.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Descarte el sobrenadante y congele rápidamente el pellet en nitrógeno líquido. Finalmente, almacene las fracciones enriquecidas en mitocondrias a menos 80 grados Celsius.

Este inmunotransferencia tipo western muestra un enriquecimiento de la proteína transportadora de membrana mitocondrial poin, que sirve como indicador de la separación efectiva de mitocondrias en las fracciones mitocondriales. La proteína poin es indetectable en fracciones citosólicas, mientras que la proteína tubulina, una proteína citosólica de microtúbulos, no se detecta en la fracción mitocondrial, lo que demuestra la mínima contaminación con proteínas citosólicas. Los análisis de componentes principales, o PCA, se generaron utilizando los valores obtenidos del análisis de espectrometría de masas que fueron normalizados a la concentración de proteína por el método de Bradford, transformados al logaritmo y amputados con los valores mínimos observados para cada compuesto.

Los gráficos de PCA se generaron utilizando el metabolito completo. Los perfiles de cepas nativas y alteradas de moscas muestran diferentes metabolitos de ADN mitocondrial obtenidos con un extracto estándar de mosca entera que pueden compararse frente a un gráfico de PCA de metabolitos en extractos enriquecidos mitocondrialmente; los perfiles de metabolitos de mosca entera se separan a lo largo del eje PC dos y reflejan los efectos principales del tratamiento con rapamicina. Solo hay diferencias sutiles entre los genotipos alternativos de M-T-D-N-A.

En contraste, los perfiles de metabolitos provenientes de extractos enriquecidos en mitocondrias muestran una separación entre el genotipo nativo de ADNmt en alimento normal y las otras tres muestras: el ADNmt nativo con rapamicina, y el ADNmt alternativo con alimento normal o con rapamicina. Esto implica que el efecto del ADNmt alternativo modifica los perfiles de metabolitos de manera análoga a los efectos del tratamiento con rapamicina. Durante la realización de este protocolo, es importante —y se recomienda— realizar todas las extracciones el mismo día, para disminuir la variabilidad entre réplicas.

Recomendaré tener un plan preparado con anticipación y etiquetar los viales, así como llevar un registro de las esperas entre réplicas para mejorar la calidad de nuestra preparación de muestras.