Name: Preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de Análisis metabólico en Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprende a preparar fracciones mitocondriales enriquecidas de Drosophila melanogaster mediante homogeneización y centrifugación diferencial. Este método mejora la sensibilidad en el análisis metabolómico de cambios sutiles.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por la subvención de desarrollo docente de la Universidad Adelphi y los R15GM113156 de subvención de NIGMS otorgados a EVC, R01GM067862 de subvención de NIGMS y R01AG027849 de subvención de NIA otorgados a DMR.

1. Reactivos y Soluciones <ol><li> Preparación de alimentos con mosca y los medios de comunicación <ol><li> Calor ingredientes de la mosca 11% de azúcar, 2% de levadura autolizada, 5,2% de harina de maíz, agar 0,79% w / v en agua en una placa calefactora puesta a 90 ° C. Agitar regularmente hasta que se obtiene una mezcla ligeramente densa homogénea. Preparar un volumen final de 550 ml de la comida de la mosca para un total de 100 viales con 5 ml volar comida en cada uno. </li><li> Retirar de la fuente de calor, revuelva ocasionalmente hasta que la comida se enfría a 80 ° C y añadir 0,2% tegosept-4-hidroxibenzoato disuelto en etanol al 95%. </li><li> Divida la comida en dos volúmenes iguales. Añadir 1,1 ml de 50 mM rapamicina disolvieron en etanol a un volumen y 1,1 ml de etanol al otro volumen. Se agita la rapamicina y las soluciones de etanol en la comida. Asegúrese de que la temperatura desciende a 50 ° C antes de la adición de las drogas. </li></ol></li><li> Aislamiento Buffer <ol><li> Preparar 500 ml de Aislamiento Buffer [225 mM manitol, sacarosa 75 mM, 10 mM 3- (N &lt;/ em&gt; morfolino) propanosulfónico (MOPS) y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 2,5 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA)] en agua. </li><li> Ajustar el pH a 7,2 utilizando hidróxido de sodio. El pH inicial será ácida. </li><li> Utilice botellas de almacenamiento de filtro estériles con un tamaño de poro de 0,22 micras para esterilizar la solución y almacenarlo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Tampón de lavado <ol><li> Preparar 500 ml de tampón de lavado [225 mM manitol, sacarosa 75 mM, KCl 10 mM, Tris HCl 10 mM y 5 mM KH 2 PO 4] en agua. </li><li> Ajustar el pH a 7,2 utilizando hidróxido de sodio. El pH inicial será ácida. </li><li> Utilice botellas de almacenamiento de filtro estériles con un tamaño de poro de 0,22 micras para esterilizar la solución y almacenarlo a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Crianza de las cepas de Drosophila <ol><li> Para controlar la densidad de larvas durante el desarrollo, colocar 25 pares de los padres para una botella de cultivo y permitir que ponen huevos durante 48 horas. </li> &lt;li&gt; Eliminar padres después de 48 horas para regular la densidad de huevos. </li><li> Repita los pasos 2,1 y 2,2 mediante la descendencia F1 emergentes, por lo que dos generaciones de este control de la densidad se logra. </li><li> Para recoger los adultos, anestesiar las moscas utilizando dióxido de carbono (CO 2) y separados por sexo. <ol><li> Utilice un regulador de etapa única a entregado CO 2 puro a partir de un tanque de alta presión en un flujo continuo de 5 psi. Para evitar la electricidad estática, utilice un tubo de plástico para catalizar el CO 2 en 500 ml de filtrado matraz con agua. </li><li> Use un tapón de goma con un agujero para sellar el matraz. Utilice un tubo de plástico para conectar la abertura lateral del matraz a una almohadilla de CO 2. </li><li> Coloque las moscas en la almohadilla por no más de 10-15 minutos. Permitir a recuperarse de la anestesia durante 24 horas antes de colocarlos en condiciones experimentales. </li></ol></li><li> Para generar suficientes metabolitos de fracciones enriquecidas mitocondriales, utilice 300 moscas por muestra. En este caso, utilizar las hembras, pero Gender puede diferir en otros experimentos. Moscas de transferencia 150 a un hecho en casa 1 L demografía jaula. Permitir el acceso a 5 ml de alimentos mosca en un vial. </li><li> Transferir los 150 moscas restantes a otra jaula de 1 l. No sobrepoblar jaulas con más de 150 moscas. </li><li> Utilice seis muestras replicadas por condición experimental. Desde extractos animales enteros producen más metabolitos, para generar 1 muestra de animal entero aísla, transferir 50 hembra vuela una jaula. En cuanto a los aislamientos mitocondriales, utilizar seis muestras replicadas por condición experimental. </li><li> Coloque las jaulas a 25 ° C con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. </li><li> Proporcionar alimentos frescos cada 2 o 3 días en un vial con 5 ml de alimentos para mantener la calidad de los alimentos. </li><li> Mantener moscas en la comida durante 10 días. Este paso es necesario para el tratamiento rapamicina 7. Otros tratamientos o condiciones serán diferentes. </li></ol> 3. Aislamiento de fracciones mitocondriales <ol><li> Dump vuela de una jaula (150 moscas) en unvidrio-teflón homogeneizador Dounce llena con 1 ml de tampón de aislamiento frío. </li><li> Homogeneizar moviendo la mano del mortero hacia arriba y abajo de 15 golpes. Mantenga el mortero sobre hielo para mantener las mitocondrias intactas. </li><li> Transferencia homogeneizado a un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Tome el sobrenadante y se centrifuga a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C para enriquecer en las mitocondrias. </li><li> A medida que el sobrenadante contiene la fracción citosólica, descartar el sobrenadante o utilizarlo para experimentos alternativos. Resuspender el precipitado en 300 l de tampón de lavado. </li><li> Repita los pasos 3,1 a 3,5 para la segunda jaula. Combinar los sedimentos resuspendidos de ambas jaulas en un tubo de microcentrífuga criogénico. </li><li> Centrifugar a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Descartar el sobrenadante y flash-congelar el sedimento en nitrógeno líquido. </li><li> Guarde las fracciones enriquecidas mitocondriales a -80 ° C o temperatura inferior. <ol><li> Alternativamente, para pre animal completamenteparation, coloque los adultos en un tubo de microcentrífuga criogénico. Flash congelar el vial en nitrógeno y almacenar adultos líquido a -80 ° C o temperatura inferior. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScheffler%2C+IE+%22Mitochondria+%28Scheffler%2C+Mitochondria%29%22">Mitochondria (Scheffler, Mitochondria)</a>. , Wiley-Liss. 484(2007).</li>
<li>Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria--a+nexus+for+aging%2C+calorie+restriction%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins.</a> Cell. 132 (2), 171-176 (2008).</li>
<li>Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology%3A+stress+signals+from+the+energy+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory.</a> Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).</li>
<li>Embley, T. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+evolution%2C+changes+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic evolution, changes and challenges.</a> Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).</li>
<li>Lane, N., , <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+N+%22Power%2C+Sex%2C+Suicide%3A+Mitochondria+and+the+Meaning+of+Life%22">Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life</a>. 368, Oxford University Press. USA. (2006).</li>
<li>Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial-nuclear+epistasis+affects+fitness+within+species+but+does+not+contribute+to+fixed+incompatibilities+between+species+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%3B+international+journal+of+organic+evolution%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila.</a> Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).</li>
<li>Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+increases+mitochondrial+efficiency+by+mtDNA-dependent+reprogramming+of+mitochondrial+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila.</a> Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).</li>
<li>Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%C3%97G%C3%97E+for+Lifespan+in+Drosophila%3A+Mitochondrial%2C+Nuclear%2C+and+Dietary+Interactions+that+Modify+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity.</a> PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).</li>
<li>Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+statistical+models+of+metabolomic+data+reveals+different+metabolite+distribution+patterns+in+isonitrosoacetophenone-elicited+Nicotiana+tabacum+and+Sorghum+bicolor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells.</a> SpringerPlus. 3, 254(2014).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+Studies+Of+Mammalian+Tissues+I+.+Isolation+Of+Intact+Mitochondria+From+Rat+Liver+Some+Biochemical+Properties+Of+Mitochondria+And+Submicroscopic+Particulate+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material.</a> Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+isolated+in+nearly+isotonic+KCl+buffer%3A+focus+on+cardiolipin+and+organelle+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).</li>
<li>Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+mitochondrial+phenotyping+by+high+resolution+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics.</a> PloS one. 7 (3), e33020(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos más críticos en este protocolo son: 1) la cría de moscas suficientes en abundante espacio. Es muy importante que no se pueblan la demografía jaulas con más de 150 moscas cada uno; 2) el cambio de la comida de las jaulas con frecuencia para evitar la competencia de alimentos y el estrés nutricional; y 3) el mantenimiento de todas las muestras a 4 ° C para garantizar la integridad durante el aislamiento de la fracción mitocondrial. También se recomienda para enfriar el tampón de aislamiento, el tampón de lavado,...

El objetivo de este procedimiento es desarrollar fracciones enriquecidas mitocondriales que producen metabolitos mitocondriales suficientes para estudios de metabolómica utilizando Drosophila melanogaster. En nuestra experiencia, la metabolómica análisis utilizando métodos de extracción celular enteros son incapaces de detectar sutiles cambios de metabolitos mitocondriales en Drosophila. Sin embargo, fraccionamiento mitocondrial antes del análisis metabolómica aumenta la sensibilidad para identificar los cambios de metabolitos mitocondriales. Las mitocondrias son orgánulos celulares responsables para proporcionar 90% de la energía que las células necesitan para la función normal 1. En los últimos años se ha reconocido que las mitocondrias juegan un papel mucho más dinámico en la función celular y del organismo que simplemente la producción de trifosfato de adenosina (ATP), y ahora son reconocidos como centros para la regulación de la homeostasis metabólica 2,3. Las mitocondrias son el resultado de un proceso en el que endosimbiótica dislinajes microbianos Tinct fusionaron ~ Hace 1,5 millones de años 4. Como las mitocondrias evolucionaron hasta convertirse en verdaderos orgánulos, genes de la endosymbiont fueron incorporados en el genoma nuclear emergente. En los animales hoy en día, aproximadamente 1.500 proteínas mitocondriales son codificada en el núcleo, mientras que 37 genes permanecen en el ADNmt, 13 de los cuales codifican proteínas mitocondriales que son subunidades de los complejos de enzimas de la fosforilación oxidativa 5. Es necesaria la coordinación entre las mitocondrias y compartimentos nucleares para mantener la función mitocondrial adecuada. Utilizando los métodos descritos aquí hemos sido capaces de detectar cambios metabólicos mitocondriales en Drosophila que resultan de la manipulación de la coordinación entre los genomas mitocondriales y nucleares. Se utilizó una cepa de Drosophila en el que el ADNmt de su especie hermana D. simulans se colocó en una sola D. melanogaster fondo nucleares 6. Este mitonuclear &#39;perturbado&#39;genotipo se comparó con el genotipo mitonuclear &#39;nativa&#39;, o co-evolucionado de D. melanogaster que lleva el mismo genoma nuclear con su D. nativa melanogaster ADNmt. El D. melanogaster y D. simulans ADNmts difieren de ~ 100 aminoácidos y&gt; 500 sinónimo sustituciones que afectan a 7,8 comunicación mitonuclear. Hemos generado extractos de moscas enteras y extractos enriquecidos mitocondriales para estudiar los cambios de metabolitos en respuesta al estrés farmacológico. Aquí nos muestran que al utilizar fracciones mitocondriales enriquecida detectamos cambios pronunciados en metabolitos mitocondriales entre el genotipo co-evolucionado nativo que lleva el D. ADNmts melanogaster y el genotipo perturbado llevan D. simulans ADNmt. En contraste, los cambios de metabolitos entre estos dos genotipos son sutiles utilizando métodos normales que utilizan extracto de mosca conjunto. Por lo tanto, este método proporciona un camino para entender cómo ADNmts median cambios mitocondriales enrespuesta a diferentes fármacos.

<table><tbody><tr><td>0,2% tegosept-metil 4-hidroxibenzoato</td><td>VWR</td><td>AAA14289</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792799</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) ácido propanosulfónico (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38057&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T-B7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>almohadillas de CO2 para anestesiar moscas</td><td>Investigación</td> <td>TritechMINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>jaula de 1 L</td><td>Tienda de restaurante web</td><td>999RD32</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de jaula de 1 L</td><td>Tienda de restaurante web</td><td>999LRD</td><td></td></tr><tr><td>un homogeneizador de rebote de vidrio-teflón&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9661231</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>rapamicina&nbsp;</td><td>Laboratorios LC&nbsp;</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>anti-porina</td><td>MitoSciences</td><td>MSA03</td><td></td></tr><tr><td>anti-alfa tubulina</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>12G10</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Kit &nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>CO2 almohadilla</td><td>Tritech Research, Inc</td><td>Matraz filtrante MINJ-DROS-FP ENASCO</td><td></td></tr><tr><td>tapón de goma</td><td></td> <td>SB08184M</td> enasco S08512M <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de análisis metabólico en<em&gt; drosophila</em

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Dado que las mitocondrias desempeñan un papel en el metabolismo de los aminoácidos, el metabolismo de los carbohidratos y la oxidación de los ácidos grasos, los defectos en la función mitocondrial a menudo comprometen la vida de quienes padecen estas enfermedades complejas. La detección de cambios metabólicos mitocondriales es vital para la comprensión de los trastornos mitocondriales y las respuestas mitocondriales a los agentes farmacológicos. Aunque el metabolismo mitocondrial es el núcleo de la regulación metabólica, la detección de cambios sutiles en el metabolismo mitocondrial puede verse obstaculizada por la sobrerrepresentación de otros metabolitos citosólicos obtenidos mediante extracciones de todo el organismo o de todo el tejido. 
Aquí describimos un método de aislamiento que detectó cambios metabólicos mitocondriales pronunciados en Drosophila que eran distintos entre las preparaciones enriquecidas con mosca entera y mitocondrial. Para ilustrar la sensibilidad de este método, utilizamos un conjunto de Drosophila que albergaba ADN mitocondrial (ADNmt) genéticamente diverso y los expusimos al fármaco rapamicina. Con este método, demostramos que la rapamicina modifica el metabolismo mitocondrial de una manera dependiente del genotipo mitocondrial. Sin embargo, estos cambios son mucho más distintivos en los estudios metabolómicos cuando los metabolitos se extrajeron de fracciones enriquecidas mitocondriales. Por el contrario, los extractos de tejido entero solo detectaron cambios metabólicos mediados por el fármaco rapamicina, independientemente de los ADNmt.

Utilizando el protocolo explicado anteriormente, se realizó un análisis metabolomic en fracciones enriquecidas mitocondriales y extractos animales enteros para probar el efecto de la droga rapamicina sobre ADNmts divergentes 7. Hemos entregado 200 M de rapamicina disolviendo el fármaco en la comida de la mosca. Las moscas se expusieron a la rapamicina durante 10 días. Los metabolitos a partir de extractos de moscas enteras y a partir de extractos mitocondriales se obtuvie...

Las mitocondrias desempeñan un papel central en la regulación del metabolismo y la homeostasis. Los cambios sutiles en el metabolismo mitocondrial que afectan a la fisiología del organismo podrían ser difíciles de detectar en los estudios metabolómicos de todo el organismo. Aquí describimos un método de aislamiento que mejora la detección de cambios metabólicos sutiles en Drosophila melanogaster.

Preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de Análisis metabólico en<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

El objetivo general del siguiente experimento es obtener fracciones mitocondriales enriquecidas que proporcionen suficientes metabolitos mitocondriales para estudios metabolómicos utilizando drosophila melanogaster. Esto se logra primero criando una cantidad suficiente de moscas para generar suficientes metabolitos para fracciones enriquecidas mitocondrialmente. Como segundo paso, las moscas se homogenizan en un homogenizador de vidrio-Teflón tipo Dounce, el cual rompe la membrana celular sin dañar la integridad mitocondrial.A continuación, los homogenatos se someten a centrifugación diferencial con el fin de generar muestras enriquecidas en mitocondrias. Los resultados muestran que se detectaron cambios metabólicos mitocondriales pronunciados mediante este protocolo, los cuales no se detectaron mediante análisis metabolómicos basados enteramente en fracciones enriquecidas en mitocondrias y extractos de animales completos. La ventaja principal de este procedimiento frente al análisis metabolómico de moscas enteras es que el aislamiento de mitocondrias antes del análisis metabolómico permite una mayor sensibilidad y detección de los cambios en los metabolitos mitocondriales.Para comenzar el experimento, caliente los ingredientes del alimento para moscas en una placa calefactora a 90 grados Celsius. Agite la mezcla regularmente hasta que esté homogénea y ligeramente densa. Retire el alimento de la fuente de calor y agítelo ocasionalmente cuando el alimento se enfríe a 80 grados Celsius; a continuación, agregue metil-4-hidroxibenzoato al 0,2 % TE disuelto en etanol al 95 %. Luego, divida el alimento en dos volúmenes iguales.Asegúrese de que la temperatura del alimento haya disminuido a 50 grados Celsius y mezcle 1,1 mililitro de rapamicina 50 milimolar disuelta en etanol en un volumen y 1,1 mililitro de etanol no tratado en el segundo volumen. Para recolectar adultos, utilice un regulador de una sola etapa para suministrar dióxido de carbono puro desde un tanque de alta presión. Con un flujo continuo de cinco PS, evito la electricidad estática utilizando un tubo de plástico para canalizar el dióxido de carbono hacia un matraz filtrante de 500 mililitros con tubos para burbujear el dióxido de carbono a través del agua.Para ello, utilice un tapón de goma con un orificio para sellar el matraz. Conecte un tubo de plástico desde la abertura lateral del matraz hasta una almohadilla de dióxido de carbono para controlar la densidad larval durante el desarrollo. Coloque 25 pares de progenitores en un frasco de cultivo y permita que depositen huevos durante 48 horas.Luego retire los progenitores para regular la densidad de huevos y repita estos pasos utilizando la descendencia F1 emergente para obtener dos generaciones de este control de densidad. Después de dos generaciones bajo condiciones de densidad controlada, separe las moscas por sexo, colocándolas sobre la almohadilla durante no más de 10 a 15 minutos. Permita que las moscas se recuperen de la anestesia durante 24 horas antes de colocarlas en condiciones experimentales.Designe 300 moscas por muestra para generar suficientes metabolitos para fracciones enriquecidas en mitocondrias. Transfiera 150 moscas a una jaula casera de un litro. Luego transfiera las 150 moscas restantes a una jaula separada de un litro y no sobrepoblar las jaulas con más de 150 moscas.Utilice seis muestras replicadas por condición experimental y coloque las jaulas a 25 grados Celsius en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad para finalizar el cultivo de drosófila. Proporcione a las moscas alimento fresco cada dos o tres días en un vial con cinco mililitros de alimento para mantener la calidad del alimento durante un total de 10 días. Comience el aislamiento volcando las moscas de una jaula en un homogenizador de vidrio de teflón con tapón inferior lleno con un mililitro de tampón de aislamiento frío.A continuación, coloque algo de mortero en hielo para mantener intactas las mitocondrias y homogenice las moscas con 15 movimientos. Teniendo cuidado de no girar el pistilo, transfiera el homogenato a un tubo de 1,5 mililitros y centrifugue el tubo a 300 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un tubo diferente y centrifugue el sobrenadante a 6.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para enriquecer las mitocondrias.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante que contiene la fracción citosólica. Resuspenda el precipitado en 300 microlitros de tampón de lavado pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Repita suavemente los pasos anteriores para el segundo giroscopio de jaula.Luego, combine los pellet resuspendidos de ambas jaulas en un tubo microcentrífugo criogénico y centrifugue los pellet combinados a 6.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Descarte el sobrenadante y congele rápidamente el pellet en nitrógeno líquido. Finalmente, almacene las fracciones enriquecidas en mitocondrias a menos 80 grados Celsius.Este inmunotransferencia tipo western muestra un enriquecimiento de la proteína transportadora de membrana mitocondrial poin, que sirve como indicador de la separación efectiva de mitocondrias en las fracciones mitocondriales. La proteína poin es indetectable en fracciones citosólicas, mientras que la proteína tubulina, una proteína citosólica de microtúbulos, no se detecta en la fracción mitocondrial, lo que demuestra la mínima contaminación con proteínas citosólicas. Los análisis de componentes principales, o PCA, se generaron utilizando los valores obtenidos del análisis de espectrometría de masas que fueron normalizados a la concentración de proteína por el método de Bradford, transformados al logaritmo y amputados con los valores mínimos observados para cada compuesto.Los gráficos de PCA se generaron utilizando el metabolito completo. Los perfiles de cepas nativas y alteradas de moscas muestran diferentes metabolitos de ADN mitocondrial obtenidos con un extracto estándar de mosca entera que pueden compararse frente a un gráfico de PCA de metabolitos en extractos enriquecidos mitocondrialmente; los perfiles de metabolitos de mosca entera se separan a lo largo del eje PC dos y reflejan los efectos principales del tratamiento con rapamicina. Solo hay diferencias sutiles entre los genotipos alternativos de M-T-D-N-A.En contraste, los perfiles de metabolitos provenientes de extractos enriquecidos en mitocondrias muestran una separación entre el genotipo nativo de ADNmt en alimento normal y las otras tres muestras: el ADNmt nativo con rapamicina, y el ADNmt alternativo con alimento normal o con rapamicina. Esto implica que el efecto del ADNmt alternativo modifica los perfiles de metabolitos de manera análoga a los efectos del tratamiento con rapamicina. Durante la realización de este protocolo, es importante —y se recomienda— realizar todas las extracciones el mismo día, para disminuir la variabilidad entre réplicas.Recomendaré tener un plan preparado con anticipación y etiquetar los viales, así como llevar un registro de las esperas entre réplicas para mejorar la calidad de nuestra preparación de muestras.

preparation-mitochondrial-enriched-fractions-for-metabolic-analysis

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este video, te mostramos cómo los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial de las células madre embrionarias humanas pueden ser analizadas utilizando en ensayos de actividad gel.

Sondeo de la actividad mitocondrial complejo en células estaminales embrionarias humanas

Se describe un método rápido y eficaz para la purificación de las mitocondrias de la...

Purificación de las mitocondrias de las células de levadura

Este procedimiento muestra cómo aislar del cerebro del ratón adulto las membranas de las mitocondrias ER-asociados o mams y los glucoesfingolípidos fracciones enriquecidas microdominio de MAM y preparaciones mitocondriales.

Las mitocondrias asociadas ER membranas (MAM) y glicoesfingolípidos microdominios enriquecidos (GEMS): Aislamiento de cerebro de ratón

El análisis de la relación estructura-función mitocondrial es necesario para una comprensión profunda de los mecanismos reguladores de la funcionalidad mitocondrial. En este trabajo se describen y demuestran métodos específicos para estudiar la estructura y función mitocondrial en ovarios vivos y fijos de Drosophila.

Estudiar mitocondrial Estructura y función en Drosophila Los ovarios

En este protocolo, demostramos la aplicación de la tomografía electrónica serie-sección para dilucidar la estructura mitocondrial en músculo de vuelo indirecto de Drosophila .

3D ultraestructura mitocondrial del músculo de vuelo indirecto de Drosophila revelado por tomografía electrónica serie-sección

En este artículo se describe un método para medir el consumo de oxígeno mediante respirometría de alta resolución de tórax permeabilized de Drosophila. Esta técnica requiere una cantidad mínima de tejido en comparación con la técnica de aislamiento mitocondrial clásica y los resultados obtenidos son más fisiológicamente relevantes.

Medición de consumo de oxígeno mitocondrial en las fibras Permeabilized de Drosophila utilizando cantidades mínimas de tejido

Este protocolo describe cómo preparar larvas de Drosophila para análisis metabolómicos basadas en GC-MS.

Preparación de muestras de larvas de Drosophila para cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)-base metabolómica

Presentamos un protocolo para la medición de consumo de oxígeno y la acidificación extracelular en el cerebro de larvas y adultos de Drosophila melanogaster . Se utiliza un analizador metabólico con un protocolo adaptado y optimizado. Micro-tejido restricciones son un componente fundamental de este protocolo y fueron diseñadas y creadas específicamente para su uso en este análisis.

Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

A pesar de los avances recientes, muchas proteínas mitocondriales de levadura aún permanecen con sus funciones completamente desconocidas. Este protocolo proporciona un método sencillo y fiable para determinar la localización submitocondrial de proteínas, que ha sido fundamental para la elucidación de sus funciones moleculares.

Evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes Saccharomyces cerevisiae

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

En este trabajo presentamos un protocolo de respirometría de alta resolución para analizar la bioenergética en moscas de la fruta mutantes PINK1B9-nulas. El método utiliza el protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Análisis de la función mitocondrial en un mutante PINK1B9-nulo de Drosophila melanogaster mediante respirometría de alta resolución

Aprende a preparar fracciones mitocondriales enriquecidas de Drosophila melanogaster mediante homogeneización y centrifugación diferencial. Este método mejora la sensibilidad en el análisis metabolómico de cambios sutiles.

Preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de Análisis metabólico en

Explorar más videos