Name: Uso del análisis confocal de Xenopus laevis Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende a visualizar la secreción y difusión de ligandos fluorescentes en epitelio intacto de Xenopus laevis mediante microscopía confocal. Este método permite estudiar gradientes de morfógenos y su regulación en desarrollo embrionario.

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Este trabajo fue financiado por un BBSRC conceder a los MEP (BB / H010297 / 1), una cuota beca BBSRC a SAR y una beca MRC a SWF.

<ol><li>Shen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling%3A+developmental+roles+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling: developmental roles and regulation.</a> Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).</li>
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<li>Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+influences+the+Shh+morphogen+gradient+during+the+dorsal+ventral+patterning+of+the+neural+tube+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).</li>
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<li>Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+classes+and+functional+domains+of+Wnts+through+expression+of+wild-type+and+chimeric+proteins+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).</li>
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<li>Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+Smad+signaling+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MAPK and Smad signaling during early Xenopus development.</a> Development. 129 (1), 37-52 (2002).</li>
<li>Muller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336, 721-724 (2012).</li>
<li>Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461, 533-536 (2009).</li>
<li>Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Wnt+recognition+by+Frizzled%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Wnt recognition by Frizzled.</a> Science. 337, 59-64 (2012).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Una parte esencial de este protocolo es la generación de ligandos biológicamente activos que normalmente se procesan, secretadas, y capaces de provocar una respuesta en la célula receptora, a pesar de tener un resto fluorescente adjunto. Es fundamental para establecer que el producto del gen fluorescente de etiquetado es biológicamente activa mediante un ensayo apropiado. Para Shh-GFP, la capacidad de activar la expresión de ptc1 se confirmó 16. Wnt8a tiene una capacidad notablemente potente para ind...

Durante el desarrollo embrionario temprano, las células se comprometen progresivamente para seguir linajes específicos de diferenciación: esto significa un grupo de totipotente (o pluripotentes) las células se restringen gradualmente a establecer poblaciones de células progenitoras determinadas para dar lugar a un tipo de célula. Señalización de las células de la célula es fundamental para la regulación de la especificación de linaje durante el desarrollo embrionario. Se requerirá la manipulación de estas señales para dirigir las células madre hacia destinos específicos para apoyar tratamientos médicos nuevos. Un número relativamente pequeño de las vías de señalización se reiteró durante el desarrollo, incluyendo las vías que responden a la superfamilia de TGF (Nodals y BMPs) 1-2, FGFs 3, Wnts 4, 5 y erizos. Estas proteínas secretadas se unen a receptores presentes en la membrana celular para activar la transducción de señales alterando de este modo la expresión génica y / o comportamiento de la célula. La regulación estricta de la señal celularAlling es esencial para la especificación de linaje celular y el desarrollo normal. Mientras que la cruz de hablar entre estas vías es importante en la determinación del destino celular, un solo ligando puede suscitar en sí respuestas distintas a diferentes concentraciones. Gradientes morphogen fueron descritos hace más de 100 años como una teoría para explicar cómo los diferentes tipos de células pueden derivar de un campo de 6 células. Señalización moléculas producidas por un grupo de células puede difundir durante un cierto rango, la disminución en la concentración con una mayor distancia de la fuente. Las células expuestas a la señal responderán a la concentración local en su posición en el campo de las células, con las células en las posiciones distintas de responder de manera diferente a los diferentes niveles de la señal. La evidencia de la existencia de morfógenos proviene de estudios en el embrión de Drosophila 7 y el disco de ala 8, así como la extremidad de vertebrados 9 y 10 del tubo neural. Se necesitan métodos envestigate cómo gradientes morfógeno se estableció e identificar otras moléculas importantes en la regulación de estos gradientes. Elegantes experimentos utilizando inmunohistoquímica para visualizar proteínas endógenas in vivo en el contexto de diferentes orígenes genéticos se han utilizado para investigar los gradientes de morfogenes 11-12. Sin embargo, los buenos anticuerpos y mutantes específicos no siempre están disponibles, por lo que se describe aquí un protocolo mediante la sobreexpresión de ligandos fluorescentes en Xenopus, para proporcionar una alternativa, método sencillo para diseccionar cómo los productos de genes exógenos pueden influir en la distribución de ligandos a través de un campo de las células. Xenopus laevis ofrece un excelente sistema para llevar a cabo este tipo de experimentos que sus embriones se desarrollan externamente por lo que son accesibles en las primeras etapas. Su gran tamaño (1-1.5mm de diámetro) simplifica la microinyección y manipulación quirúrgica y por blástula etapas las células son fáciles de imagen, ya que todavía son relativamente grandes (alrededor de 2081; m de ancho). Estudios de sobreexpresión en Xenopus son fáciles de hacer: ARNm inyectados en el embrión temprano pueden ser dirigidos a células particulares y se traduce de manera eficiente. Las construcciones Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP fluorescencia etiquetados se generaron utilizando pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 y eGFP. El péptido HA es importante incluir, no sólo para proporcionar una etiqueta molecular adicional, pero también porque se cree que actúa como un espaciador que separa las proteínas Wnt y eGFP permitiendo que ambos productos génicos para funcionar. La construcción utilizada para la visualización de Shh fue utilizado anteriormente para generar un ratón transgénico que expresa una proteína de fusión Shh-eGFP 15; este fue proporcionado amablemente por Andy McMahon. Es importante destacar que la etiqueta GFP para todos los constructos se clona 3 &#39;a la secuencia señal de tal manera que se retiene después de procesar. También es esencial para asegurar que la proteína final incluye secuencias requeridas para modificaciones, tales el addition de los lípidos como es el caso de Shh y Wnt ligands.The ADNc se subclonaron en el vector pCS2 + expresión que está optimizado para la produción de ARNm sintético; que incluye un promotor SP6 y la señal de poliadenilación (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors). El trabajo que se describe aquí proporciona un protocolo simple para comparar la secreción y la difusión de fluorescencia etiquetada Wnt y Shh etiquetados ligandos. Mediante la inyección de cantidades definidas de mRNA sintético, el protocolo circunnavega cualquier problema asociado con la expresión variable a partir de diferentes vectores usando diferentes promotores. Estos métodos se han aplicado recientemente a investigar los efectos de la endosulfatase heparán sulfato SULF1 en Shh-eGFP y Wnt8a / secreción Wnt11b-HA-eGFP y difusión en Xenopus, 16-17.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Melford</td><td>MB 1200</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Ambion</td><td>de Megascript SP6 Kit AM 1330</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato</td><td>VWR International</td><td>RC-091</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de calcio</td><td>Sigma</td><td>C13961</td><td></td></tr><tr><td>Tapa análoga (m7G(5'))</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM 8050</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C 2432</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de L-cisteína monohidratado</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427-013</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR International</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma</td><td>F 4375</td><td></td></tr><tr><td>Fiji image J software</td><td></td><td></td><td>Descarga gratuita http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Melford</td><td>G 0124</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio, No.1.5&nbsp;</td><td>Suministros de laboratorio científico</td><td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tirador de agujas de vidrio</td><td>Narishige</td><td>Narishige PC -10</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de vidrio</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina crónica humana (HCG)</td><td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/7500/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de litio (LiCl)</td><td>Sigma</td><td>L-7026</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 y Software Zen (2008-2010)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab software</td><td>Mathworks</td><td></td><td>http://uk.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Agua de grado molecular&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 2819-10</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas&nbsp;</td><td>Botas Código de</td><td>barras 3600530 373048</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Lab.tech International</td><td>ND-1000 / ND8000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (55 mm)</td><td>VWR International</td><td>391-0865</td><td></td></tr><tr><td>Fenol-cloroformo</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Software Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.photoshop.com/products</td></tr><tr><td>ADN polimerasa de alta fidelidad y búferes&nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>M0530S&nbsp; Tampón - M0531S</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Cinta</td> aislante de PVC Fisher Scientific <td>P/4280/53</td><td></td>Kit de</tr> extracción de gel <tr><td></td><td>SH5006MPK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Onecall&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>S28704</td><td></td></tr><tr><td>Tampones de enzimas de restricción</td><td>Roche</td><td>SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse libre de ARNasa</td><td>Promega</td><td>ME10A</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de acero de un solo filo</td><td>Personna</td><td>66-0403-0000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>SP6 kit de transcripción</td><td>Ambion</td><td>AM1330</td><td></td></tr><tr><td>Diapositivas de vidrio</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHE 2505</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de</td><td></td><td></td> tungsteno <td></td></tr><tr><td>software Zen lite</td> casero <td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Descarga gratuita&nbsp; http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td></tr></tbody></table>

uso del análisis confocal de<em&gt; xenopus laevis</em&gt; encargado de investigar moduladores de wnt y shh morfógeno degradados

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Este protocolo describe un método para visualizar ligandos distribuidos a través de un campo de células. La facilidad de expresar proteínas exógenas, junto con el gran tamaño de sus células en embriones tempranos, hacen de Xenopus laevis un modelo útil para la visualización de ligandos GFP-etiquetados. MRNAs sintéticos se traducen de manera eficiente después de la inyección en las primeras etapas de embriones de Xenopus, y las inyecciones pueden ser dirigidos a una sola célula. Cuando se combina con un trazador de linaje tales como membrana atado RFP, la célula inyectada (y sus descendientes) que están produciendo la proteína sobreexpresada fácilmente pueden ser seguidos. Este protocolo describe un método para la producción de etiquetado con fluorescencia Wnt y Shh ligandos de mRNA inyectado. Los métodos implican la micro disección de los explantes ectodérmicas (CAPS animales) y el análisis de la difusión ligando en múltiples muestras. Mediante el uso de formación de imágenes confocal, información sobre la secreción de ligando y la difusión sobre un campo de células se puede obtener. Los análisis estadísticos de imágenes confocal proporcionan datos cuantitativos sobre la forma de gradientes ligando. Estos métodos pueden ser útiles para los investigadores que quieran probar los efectos de los factores que pueden regular la forma de gradientes morfógeno.

Confocal análisis de los explantes animales tapa expresar proteínas etiquetadas con fluorescencia proporciona un sistema eficaz para la visualización de la distribución ligando bajo diferentes condiciones experimentales. En un ejemplo, la distribución de GFP etiquetada Shh se muestra (Figura 1). En la etapa de 2 células, embriones de Xenopus se inyectan en ambas células con ya sea con un ARNm de control o con el ARNm que codifica para SULF1, una enzima que modifica el heparán sulfato de la supe...

El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

El objetivo general de esta metodología es visualizar la secreción y difusión de ligandos marcados con fluorescencia en un epitelio intacto mediante la expresión en xip pos lavis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el establecimiento de gradientes morfo que se sabe son esenciales en la especificación de linajes celulares durante el desarrollo embrionario temprano. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un método sencillo para visualizar la distribución de ligandos en un epitelio intacto.Una parte esencial del protocolo consiste en generar ligandos biológicamente activos que sean normalmente procesados y secretados, y que sean capaces de provocar una respuesta en las células receptoras a pesar de tener una etiqueta fluorescente unida. La microscopía confocal es una manera ideal para estudiar la localización de proteínas marcadas fluorescentemente dentro de tejidos tridimensionales, ya que el uso de láseres y detectores independientes permite un análisis limpio dentro de estos tipos de tejidos complejos y posibilita la obtención de datos robustos. Después de generar el recubrimiento de ARNm para ligandos marcados fluorescentemente y obtener embriones XUS lavis según el protocolo escrito, inyecte el ARNm junto con un marcador de linaje, como RFP de membrana, en una sola célula en la etapa de 16 a 32 células; si se desea, se puede inyectar simultáneamente un modulador junto con el ligando fluorescente y el marcador de linaje para analizar sus efectos.A veces también es útil inyectar una célula vecina. Aquí, se inyecta una segunda célula adyacente a la célula previamente inyectada. Una célula se inyecta con ARNm que codifican para el ligando marcado con GFP y un marcador de linaje como la RFP de membrana, mientras que la otra célula se inyecta con ARNm que codifican para el modulador y un marcador de linaje diferente, como la ceruleana de membrana. Transfiera los embriones a una incubadora de 12,5 grados Celsius y cultívelos hasta el nuevo estadio. En el estadio Faber ocho, al día siguiente, cuando los embriones hayan alcanzado el estadio ocho, llene las placas recubiertas con 1% aros con NAM dos y transfiera los embriones utilizando una pipeta de vidrio cortada, empleando agujas de tungsteno.Disecar el explante circular desde el polo animal de embriones inyectados y controles, teniendo cuidado de no incluir ningún mesodermo; transferir el explante animal a placas de Petri de 55 milímetros, recubiertas con 1% aros y cultivar los embriones durante cuatro horas. Para permitir que las proteínas fluorescentes maduren y generen relieve. En los portaobjetos, aplicar dos capas de cinta aislante de PVC sobre los portaobjetos, alisándolas completamente.Corte un rectángulo de 14 por 10 milímetros de la cinta para montar las tapas animales. A continuación, pipetee dos gotas separadas de NM dos en la portaobjeto de relieve. Luego, utilizando una punta cortada de P 20, transfiera hasta 15 explantes animales a cada portaobjeto y, con pinzas, oriente los explantes X de modo que el lado apical quede hacia arriba.Utilice un lápiz de diamante para marcar un cubreobjetos de vidrio y romperlo a fin de crear un cubreobjetos más pequeño. Para adaptarlo al portaobjetos de relieve, coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio sobre el portaobjetos de relieve utilizando una aguja doblada de calibre 19, comprimiendo así la capa apical de las células del casquete animal.Utilice barniz de uñas para sellar la preparación en seco en la oscuridad durante 20 minutos e imágenes dentro de las cuatro a seis horas siguientes. Para asegurar tapones animales sanos, los tapones animales deben orientarse correctamente en las preparaciones personalizadas y luego en las laminillas. Colóquelos suavemente sobre las preparaciones.Es fundamental no usar demasiado esmalte de uñas para sellar los portaobjetos, ya que esto provocará que la cinta se arrugue y luego rompa el sello del portaobjeto más adelante. Una vez dominado, será necesario inyectar aproximadamente 25 embriones para obtener 20 bonetes animales adecuados por cada condición de interés. Estos pueden analizarse posteriormente mediante microscopía confocal al día siguiente.Para realizar la imagen, utilice un objetivo de baja magnificación para encontrar X explan. Luego cambie a un objetivo de 63 x 1,4 con aceite para obtener imágenes de mayor resolución. Encienda los láseres necesarios, incluyendo 405 para MIAN, 488 para GFP y 561.Para el MRFP, optimice las potencias del láser de modo que se puedan detectar todos los fluoróforos. Utilice la matriz de detectores de 32 mientras minimiza la cantidad de voltaje y ganancia necesarios, luego use el modo Lambda y seleccione los láseres de 405 nanómetros, 488 y 561 nanómetros. Para permitir un campo de visión más amplio, aleje la imagen hasta 0,6 x.A continuación, ajuste el tamaño del cuadro al tamaño de imagen deseado. Esto proporciona una resolución suficiente para el promedio del conjunto de análisis, aumentando de cuatro a ocho para incrementar la relación señal-ruido y optimizar el diafragma para este conjunto de datos. Se utilizó una unidad de área, según el láser de 561 nanómetros, empleando 405 y 4 88 5 61.Los espejos dicróicos recogen la luz emitida por la membrana Saru, GFP y la membrana RFP. En este experimento, se recogió luz aproximadamente cada 10 nanómetros desde 415 hasta 720 nanómetros. Realice el análisis de imágenes según el protocolo descrito aquí: se muestra la distribución de sonic hedgehog marcado con GFP en un explante de animal de tipo salvaje bajo condiciones control. Sonic hedgehog GFP es secretado y se difunde fuera de la región que expresa los ARNm inyectados.Sin embargo, en presencia del modulador, SULF uno, Sonic Hedgehog GFP tiene una distribución más restringida. Y en esta muestra solo se observan unos pocos focos de Sonic Hedgehog GFP a corta distancia del clon de células que lo produce. Esta figura muestra la caracterización de dos ligandos marcados con fluoróforos inyectados en células, como se indica aquí; tanto wind eight A como win 11 B-H-A-E-G-F-P se acumulan en la membrana de células del copete animal, siendo la acumulación de wind eight A-H-A-E-G-F-P más eficiente que la de wind 11 B. Esta figura muestra la distribución de wind eight A-H-A-E-G-F-P expresado en un clon de células marcado con ceruleano anclado a la membrana.Se observa que el ligando marcado con fluorescencia se difunde desde las células fuente hacia las células circundantes del epitelio. Se utiliza un software de análisis de imágenes para extraer datos sobre la distribución de los ligandos wind marcados con fluorescencia en múltiples muestras experimentales como se muestra aquí. Se mide la distancia desde el clon que expresa mem Saru y el nivel de fluorescencia de GFP para determinar el alcance de la difusión de wind y la forma del gradiente.Después de medir la distribución de un ligando, la actividad de una vía de señalización también se puede evaluar combinando este protocolo con otro ensayo para monitorear la respuesta de las células receptoras. Y de esta manera, se puede intentar determinar el rango umbral de un morfógeno.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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