Uso del análisis confocal de Xenopus laevis Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

El objetivo general de esta metodología es visualizar la secreción y difusión de ligandos marcados con fluorescencia en un epitelio intacto utilizando la expresión en xip pos lavis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el establecimiento de morfo en gradientes que se sabe que son esenciales en la especificación de linajes celulares durante el desarrollo embrionario temprano. La principal ventaja de esta técnica es que es un método sencillo para visualizar la distribución del ligando en un epitelio intacto.

Una parte esencial del protocolo es la generación de ligandos biológicamente activos que normalmente se procesan y secretan y que son capaces de provocar una respuesta en las células receptoras a pesar de tener una etiqueta fluorescente adjunta. La microscopía confocal es una forma ideal de estudiar la localización de proteínas marcadas con fluorescencia dentro de tejidos tridimensionales utilizando láseres y detectores independientes, lo que permite un análisis limpio dentro de estos tipos de tejidos complejos y permite recopilar datos sólidos. Después de generar un recubrimiento de ARNm para ligandos marcados con fluorescencia y adquirir embriones XUS lavis de acuerdo con el protocolo escrito, inyecte el ARNm junto con un trazador de linaje como RFP de membrana, en una sola célula en la etapa de 16 a 32 células si lo desea, se puede coinyectar un modulador con un ligando fluorescente y el marcador de linaje para analizar sus efectos.

A veces es útil inyectar también una célula vecina Aquí, se inyecta una segunda célula adyacente a la célula inyectada anteriormente. A una célula se le inyectan ARNm que codifican el ligando marcado con GFP y un trazador de linaje, como la RFP de membrana, mientras que a la otra célula se le inyectan ARNm que codifican el modulador y un trazador de linaje diferente, como los embriones cerúleos de membrana, se transfieren a una incubadora de 12,5 grados centígrados y se cultivan en un nuevo gallinero. En la etapa ocho de Faber, al día siguiente, cuando los embriones han alcanzado la etapa ocho, llene las placas recubiertas con 1%aros con NAM dos y transfiera los embriones usando una pipeta de vidrio cortado con agujas de tungsteno.

Diseccionar el plano circular del polo animal de los embriones inyectados y de control, teniendo cuidado de no incluir ningún mesodermo transferir el explan del animal a placas de Petri de 55 milímetros, recubiertas con 1%aros y cultivar embriones durante cuatro horas. Permitir que las proteínas fluorescentes maduren para generar relieve. Los portaobjetos aplican dos capas de cinta aislante de PVC sobre los portaobjetos del microscopio, aplanándolos por completo.

Corta un rectángulo de 14 por 10 milímetros de la cinta para montar las gorras de los animales. A continuación, pipetee dos gotas separadas de NM dos en el portaobjetos de alivio. A continuación, con una punta P 20 de corte, transfiera hasta 15 explanes de animales a cada portaobjetos y, con pinzas, oriente los explantes X de modo que el lado apical quede hacia arriba.

Con un bolígrafo de diamante, marque una cubierta de vidrio y rómpala para crear una cubierta más pequeña. Para colocar el portaobjetos de alivio, baje suavemente una cubierta de vidrio sobre el portaobjetos de alivio con una aguja doblada de calibre 19. Comprimiendo la capa apical de las células del sombrero animal.

Use esmalte de uñas para sellar el portaobjetos en la oscuridad durante 20 minutos y tome la imagen dentro de cuatro a seis horas. Para garantizar la salud de las gorras de los animales, las gorras de los animales deben estar correctamente orientadas en las correderas personalizadas y luego en las tapas. Cargue suavemente en las correderas.

Es vital no usar demasiado esmalte de uñas para sellar los portaobjetos, ya que esto hará que la cinta se arrugue y luego rompa el sello del portaobjetos más adelante. Una vez dominado, tendrás que inyectar unos 25 embriones para obtener 20 buenos gorros de animales por cada condición que te interese. Estos pueden ser analizados por microscopía confocal al día siguiente.

Para llevar a cabo la toma de imágenes, utilice un objetivo de bajo aumento para encontrar X explan. A continuación, cambie a un objetivo de aceite de 63 x 1,4 para obtener imágenes de mayor resolución. Encienda los láseres necesarios, incluidos 405 para MIAN, 488 para GFP y 561.

Para MRFP, optimice las potencias del láser para que se puedan detectar todos los cuatro fluorescentes. Usando el conjunto de 32 detectores mientras minimiza la cantidad de voltaje y ganancia requerida, luego use el modo Lambda y seleccione los láseres de 405 nanómetros, 488 y 561 nanómetros. Para permitir un campo de visión más amplio, aleje la imagen a 0,6x.

A continuación, establezca el tamaño del marco en el tamaño de imagen deseado. Esto proporciona una resolución suficiente para que el conjunto de análisis promedie de cuatro a ocho para aumentar la relación señal-ruido y optimizar el agujero de alfiler para este conjunto de datos. Una unidad de área, de acuerdo con el láser de 561 nanómetros, se utilizó 405 y 4 88 5 61.

Los espejos Diic recogen la luz emitida por la membrana Saru, GFP y la membrana RFP. En este experimento, la luz se recolectó aproximadamente cada 10 nanómetros de 415 a 720 nanómetros. Llevar a cabo el análisis de la imagen de acuerdo con el protocolo de texto que se muestra aquí es la distribución del erizo sónico marcado con GFP en una cabina de animal X explan bajo condiciones de control el erizo sónico GFP se secreta y se difunde fuera de la región expresando los ARNm inyectados.

Sin embargo, en presencia del modulador, SULF one, Sonic Hedgehog GFP es más restringido en su distribución. Y en esta muestra solo se pueden ver unos pocos focos de GFP sónico de Hedgehog a poca distancia del clon de las células que lo producen. Esta figura muestra la caracterización de dos ligandos wit marcados con fluorescencia inyectados en las células como se indica aquí, tanto el viento ocho A como el win 11 B-H-A-E-G-F-P se acumulan en la membrana de las células del sombrero animal con win ocho A-H-A-E-G-F-P acumulándose más eficientemente que el viento 11 B. Esta figura muestra la distribución del viento ocho A-H-A-E-G-F-P expresado en un clon de células marcadas con cerúleo atado a la membrana.

Se observa que el ligando marcado con fluorescencia se difunde lejos de las células fuente y hacia las células circundantes del epitelio. El software de análisis de imágenes se utiliza para extraer datos sobre la distribución de ligandos de viento marcados con fluorescencia en múltiples muestras experimentales, como se muestra aquí. Se mide la distancia desde el clon que expresa el mem Saru y el nivel de fluorescencia de GFP para determinar el rango de difusión del viento y la forma del gradiente.

Después de medir la distribución de un ligando, la salida de una vía de señalización también se puede evaluar combinando este protocolo con otro ensayo para monitorear la respuesta de las células receptoras. Y de esta manera, puede intentar determinar el rango umbral de am morfogen.