Uso del análisis confocal de

El objetivo general de esta metodología es visualizar la secreción y difusión de ligandos marcados con fluorescencia en un epitelio intacto mediante la expresión en xip pos lavis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el establecimiento de gradientes morfo que se sabe son esenciales en la especificación de linajes celulares durante el desarrollo embrionario temprano. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un método sencillo para visualizar la distribución de ligandos en un epitelio intacto.

Una parte esencial del protocolo consiste en generar ligandos biológicamente activos que sean normalmente procesados y secretados, y que sean capaces de provocar una respuesta en las células receptoras a pesar de tener una etiqueta fluorescente unida. La microscopía confocal es una manera ideal para estudiar la localización de proteínas marcadas fluorescentemente dentro de tejidos tridimensionales, ya que el uso de láseres y detectores independientes permite un análisis limpio dentro de estos tipos de tejidos complejos y posibilita la obtención de datos robustos. Después de generar el recubrimiento de ARNm para ligandos marcados fluorescentemente y obtener embriones XUS lavis según el protocolo escrito, inyecte el ARNm junto con un marcador de linaje, como RFP de membrana, en una sola célula en la etapa de 16 a 32 células; si se desea, se puede inyectar simultáneamente un modulador junto con el ligando fluorescente y el marcador de linaje para analizar sus efectos.

A veces también es útil inyectar una célula vecina. Aquí, se inyecta una segunda célula adyacente a la célula previamente inyectada. Una célula se inyecta con ARNm que codifican para el ligando marcado con GFP y un marcador de linaje como la RFP de membrana, mientras que la otra célula se inyecta con ARNm que codifican para el modulador y un marcador de linaje diferente, como la ceruleana de membrana. Transfiera los embriones a una incubadora de 12,5 grados Celsius y cultívelos hasta el nuevo estadio. En el estadio Faber ocho, al día siguiente, cuando los embriones hayan alcanzado el estadio ocho, llene las placas recubiertas con 1% aros con NAM dos y transfiera los embriones utilizando una pipeta de vidrio cortada, empleando agujas de tungsteno.

Disecar el explante circular desde el polo animal de embriones inyectados y controles, teniendo cuidado de no incluir ningún mesodermo; transferir el explante animal a placas de Petri de 55 milímetros, recubiertas con 1% aros y cultivar los embriones durante cuatro horas. Para permitir que las proteínas fluorescentes maduren y generen relieve. En los portaobjetos, aplicar dos capas de cinta aislante de PVC sobre los portaobjetos, alisándolas completamente.

Corte un rectángulo de 14 por 10 milímetros de la cinta para montar las tapas animales. A continuación, pipetee dos gotas separadas de NM dos en la portaobjeto de relieve. Luego, utilizando una punta cortada de P 20, transfiera hasta 15 explantes animales a cada portaobjeto y, con pinzas, oriente los explantes X de modo que el lado apical quede hacia arriba.

Utilice un lápiz de diamante para marcar un cubreobjetos de vidrio y romperlo a fin de crear un cubreobjetos más pequeño. Para adaptarlo al portaobjetos de relieve, coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio sobre el portaobjetos de relieve utilizando una aguja doblada de calibre 19, comprimiendo así la capa apical de las células del casquete animal.

Utilice barniz de uñas para sellar la preparación en seco en la oscuridad durante 20 minutos e imágenes dentro de las cuatro a seis horas siguientes. Para asegurar tapones animales sanos, los tapones animales deben orientarse correctamente en las preparaciones personalizadas y luego en las laminillas. Colóquelos suavemente sobre las preparaciones.

Es fundamental no usar demasiado esmalte de uñas para sellar los portaobjetos, ya que esto provocará que la cinta se arrugue y luego rompa el sello del portaobjeto más adelante. Una vez dominado, será necesario inyectar aproximadamente 25 embriones para obtener 20 bonetes animales adecuados por cada condición de interés. Estos pueden analizarse posteriormente mediante microscopía confocal al día siguiente.

Para realizar la imagen, utilice un objetivo de baja magnificación para encontrar X explan. Luego cambie a un objetivo de 63 x 1,4 con aceite para obtener imágenes de mayor resolución. Encienda los láseres necesarios, incluyendo 405 para MIAN, 488 para GFP y 561.

Para el MRFP, optimice las potencias del láser de modo que se puedan detectar todos los fluoróforos. Utilice la matriz de detectores de 32 mientras minimiza la cantidad de voltaje y ganancia necesarios, luego use el modo Lambda y seleccione los láseres de 405 nanómetros, 488 y 561 nanómetros. Para permitir un campo de visión más amplio, aleje la imagen hasta 0,6 x.

A continuación, ajuste el tamaño del cuadro al tamaño de imagen deseado. Esto proporciona una resolución suficiente para el promedio del conjunto de análisis, aumentando de cuatro a ocho para incrementar la relación señal-ruido y optimizar el diafragma para este conjunto de datos. Se utilizó una unidad de área, según el láser de 561 nanómetros, empleando 405 y 4 88 5 61.

Los espejos dicróicos recogen la luz emitida por la membrana Saru, GFP y la membrana RFP. En este experimento, se recogió luz aproximadamente cada 10 nanómetros desde 415 hasta 720 nanómetros. Realice el análisis de imágenes según el protocolo descrito aquí: se muestra la distribución de sonic hedgehog marcado con GFP en un explante de animal de tipo salvaje bajo condiciones control. Sonic hedgehog GFP es secretado y se difunde fuera de la región que expresa los ARNm inyectados.

Sin embargo, en presencia del modulador, SULF uno, Sonic Hedgehog GFP tiene una distribución más restringida. Y en esta muestra solo se observan unos pocos focos de Sonic Hedgehog GFP a corta distancia del clon de células que lo produce. Esta figura muestra la caracterización de dos ligandos marcados con fluoróforos inyectados en células, como se indica aquí; tanto wind eight A como win 11 B-H-A-E-G-F-P se acumulan en la membrana de células del copete animal, siendo la acumulación de wind eight A-H-A-E-G-F-P más eficiente que la de wind 11 B. Esta figura muestra la distribución de wind eight A-H-A-E-G-F-P expresado en un clon de células marcado con ceruleano anclado a la membrana.

Se observa que el ligando marcado con fluorescencia se difunde desde las células fuente hacia las células circundantes del epitelio. Se utiliza un software de análisis de imágenes para extraer datos sobre la distribución de los ligandos wind marcados con fluorescencia en múltiples muestras experimentales como se muestra aquí. Se mide la distancia desde el clon que expresa mem Saru y el nivel de fluorescencia de GFP para determinar el alcance de la difusión de wind y la forma del gradiente.

Después de medir la distribución de un ligando, la actividad de una vía de señalización también se puede evaluar combinando este protocolo con otro ensayo para monitorear la respuesta de las células receptoras. Y de esta manera, se puede intentar determinar el rango umbral de un morfógeno.