Name: Uso del análisis confocal de Xenopus laevis Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende a visualizar la secreción y difusión de ligandos fluorescentes en epitelio intacto de Xenopus laevis mediante microscopía confocal. Este método permite estudiar gradientes de morfógenos y su regulación en desarrollo embrionario.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue financiado por un BBSRC conceder a los MEP (BB / H010297 / 1), una cuota beca BBSRC a SAR y una beca MRC a SWF.

<ol><li>Shen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling%3A+developmental+roles+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling: developmental roles and regulation.</a> Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).</li>
<li>Shimmi, O., Newfeld, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+extracellular+and+post-translational+regulation+of+TGF-beta+family+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways.</a> J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Pownall, M. E., Isaacs, H. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPownall%2C+ME+%22FGF+Signalling+in+Vertebrate+Development%22">FGF Signalling in Vertebrate Development</a>. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127 (3), 469-480 (2006).</li>
<li>Ingham, P. W., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+in+animal+development%3A+paradigms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles.</a> Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).</li>
<li>Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+hundred+years+of+positional+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">One hundred years of positional information.</a> Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).</li>
<li>Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics%2C+spatial+range%2C+and+transcriptional+interpretation+of+the+Dorsal+morphogen+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).</li>
<li>Erickson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+morphogen+gradients%3A+an+essential+role+for+the+endomembrane+system+in+Drosophila+melanogaster+wing+development%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development.</a> Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).</li>
<li>Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+signalling+in+the+developing+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gradients of signalling in the developing limb.</a> Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).</li>
<li>Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+vertebrate+neural+tube%3A+a+sonic+hedgehog+morphogen-regulated+transcriptional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network.</a> Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).</li>
<li>Briscoe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx2.2+and+specification+of+neuronal+identity+by+graded+Sonic+hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling.</a> Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).</li>
<li>Ribes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sonic+Hedgehog+signaling+dynamics+specify+floor+plate+and+ventral+neuronal+progenitors+in+the+vertebrate+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube.</a> Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).</li>
<li>Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+regulation+of+developmental+cell+signaling+by+XtSulf1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1.</a> Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).</li>
<li>Tao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+wnt11+activates+the+canonical+wnt+signaling+pathway+required+for+axis+formation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos.</a> Cell. 120 (6), 857-871 (2005).</li>
<li>Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord-derived+Shh+concentrates+in+close+association+with+the+apically+positioned+basal+body+in+neural+target+cells+and+forms+a+dynamic+gradient+during+neural+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning.</a> Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).</li>
<li>Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+influences+the+Shh+morphogen+gradient+during+the+dorsal+ventral+patterning+of+the+neural+tube+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).</li>
<li>Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+has+ligand+dependent+effects+on+canonical+and+non-canonical+WNT+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling.</a> Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).</li>
<li>Dytham, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDytham%2C+C+%22Choosing+and+using+statistics+%3A+A+biologist%27s+guide%22">Choosing and using statistics : A biologist's guide</a>. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).</li>
<li>Fay, M. P., Proschan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wilcoxon-Mann-Whitney+or+t-test%3F+On+assumptions+for+hypothesis+tests+and+multiple+interpretations+of+decision+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Surveys%22%5BJournal%5D)">Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules.</a> Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).</li>
<li>Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xwnt-8%2C+a+Xenopus+Wnt-1+%2Fint-1-related+gene+responsive+to+mesoderm-inducing+growth+factors%2C+may+play+a+role+in+ventral+mesodermal+patterning+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis.</a> Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).</li>
<li>Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+classes+and+functional+domains+of+Wnts+through+expression+of+wild-type+and+chimeric+proteins+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).</li>
<li>Tada, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xwnt11+is+a+target+of+Xenopus+Brachyury%3A+regulation+of+gastrulation+movements+via+Dishevelled%2C+but+not+through+the+canonical+Wnt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway.</a> Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).</li>
<li>Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+long-range+movement+of+the+morphogen+Xnr2+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo.</a> Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).</li>
<li>McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+has+direct+long-range+signalling+activity+and+can+form+a+concentration+gradient+by+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion.</a> Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).</li>
<li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li>
<li>Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos+coincides+with+the+dorsal+enrichment+of+dishevelled+that+is+dependent+on+cortical+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation.</a> Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).</li>
<li>Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+Smad+signaling+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MAPK and Smad signaling during early Xenopus development.</a> Development. 129 (1), 37-52 (2002).</li>
<li>Muller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336, 721-724 (2012).</li>
<li>Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461, 533-536 (2009).</li>
<li>Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Wnt+recognition+by+Frizzled%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Wnt recognition by Frizzled.</a> Science. 337, 59-64 (2012).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Una parte esencial de este protocolo es la generación de ligandos biológicamente activos que normalmente se procesan, secretadas, y capaces de provocar una respuesta en la célula receptora, a pesar de tener un resto fluorescente adjunto. Es fundamental para establecer que el producto del gen fluorescente de etiquetado es biológicamente activa mediante un ensayo apropiado. Para Shh-GFP, la capacidad de activar la expresión de ptc1 se confirmó 16. Wnt8a tiene una capacidad notablemente potente para ind...

Durante el desarrollo embrionario temprano, las células se comprometen progresivamente para seguir linajes específicos de diferenciación: esto significa un grupo de totipotente (o pluripotentes) las células se restringen gradualmente a establecer poblaciones de células progenitoras determinadas para dar lugar a un tipo de célula. Señalización de las células de la célula es fundamental para la regulación de la especificación de linaje durante el desarrollo embrionario. Se requerirá la manipulación de estas señales para dirigir las células madre hacia destinos específicos para apoyar tratamientos médicos nuevos. Un número relativamente pequeño de las vías de señalización se reiteró durante el desarrollo, incluyendo las vías que responden a la superfamilia de TGF (Nodals y BMPs) 1-2, FGFs 3, Wnts 4, 5 y erizos. Estas proteínas secretadas se unen a receptores presentes en la membrana celular para activar la transducción de señales alterando de este modo la expresión génica y / o comportamiento de la célula. La regulación estricta de la señal celularAlling es esencial para la especificación de linaje celular y el desarrollo normal. Mientras que la cruz de hablar entre estas vías es importante en la determinación del destino celular, un solo ligando puede suscitar en sí respuestas distintas a diferentes concentraciones. Gradientes morphogen fueron descritos hace más de 100 años como una teoría para explicar cómo los diferentes tipos de células pueden derivar de un campo de 6 células. Señalización moléculas producidas por un grupo de células puede difundir durante un cierto rango, la disminución en la concentración con una mayor distancia de la fuente. Las células expuestas a la señal responderán a la concentración local en su posición en el campo de las células, con las células en las posiciones distintas de responder de manera diferente a los diferentes niveles de la señal. La evidencia de la existencia de morfógenos proviene de estudios en el embrión de Drosophila 7 y el disco de ala 8, así como la extremidad de vertebrados 9 y 10 del tubo neural. Se necesitan métodos envestigate cómo gradientes morfógeno se estableció e identificar otras moléculas importantes en la regulación de estos gradientes. Elegantes experimentos utilizando inmunohistoquímica para visualizar proteínas endógenas in vivo en el contexto de diferentes orígenes genéticos se han utilizado para investigar los gradientes de morfogenes 11-12. Sin embargo, los buenos anticuerpos y mutantes específicos no siempre están disponibles, por lo que se describe aquí un protocolo mediante la sobreexpresión de ligandos fluorescentes en Xenopus, para proporcionar una alternativa, método sencillo para diseccionar cómo los productos de genes exógenos pueden influir en la distribución de ligandos a través de un campo de las células. Xenopus laevis ofrece un excelente sistema para llevar a cabo este tipo de experimentos que sus embriones se desarrollan externamente por lo que son accesibles en las primeras etapas. Su gran tamaño (1-1.5mm de diámetro) simplifica la microinyección y manipulación quirúrgica y por blástula etapas las células son fáciles de imagen, ya que todavía son relativamente grandes (alrededor de 2081; m de ancho). Estudios de sobreexpresión en Xenopus son fáciles de hacer: ARNm inyectados en el embrión temprano pueden ser dirigidos a células particulares y se traduce de manera eficiente. Las construcciones Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP fluorescencia etiquetados se generaron utilizando pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 y eGFP. El péptido HA es importante incluir, no sólo para proporcionar una etiqueta molecular adicional, pero también porque se cree que actúa como un espaciador que separa las proteínas Wnt y eGFP permitiendo que ambos productos génicos para funcionar. La construcción utilizada para la visualización de Shh fue utilizado anteriormente para generar un ratón transgénico que expresa una proteína de fusión Shh-eGFP 15; este fue proporcionado amablemente por Andy McMahon. Es importante destacar que la etiqueta GFP para todos los constructos se clona 3 &#39;a la secuencia señal de tal manera que se retiene después de procesar. También es esencial para asegurar que la proteína final incluye secuencias requeridas para modificaciones, tales el addition de los lípidos como es el caso de Shh y Wnt ligands.The ADNc se subclonaron en el vector pCS2 + expresión que está optimizado para la produción de ARNm sintético; que incluye un promotor SP6 y la señal de poliadenilación (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors). El trabajo que se describe aquí proporciona un protocolo simple para comparar la secreción y la difusión de fluorescencia etiquetada Wnt y Shh etiquetados ligandos. Mediante la inyección de cantidades definidas de mRNA sintético, el protocolo circunnavega cualquier problema asociado con la expresión variable a partir de diferentes vectores usando diferentes promotores. Estos métodos se han aplicado recientemente a investigar los efectos de la endosulfatase heparán sulfato SULF1 en Shh-eGFP y Wnt8a / secreción Wnt11b-HA-eGFP y difusión en Xenopus, 16-17.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Melford</td><td>MB 1200</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Ambion</td><td>de Megascript SP6 Kit AM 1330</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato</td><td>VWR International</td><td>RC-091</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de calcio</td><td>Sigma</td><td>C13961</td><td></td></tr><tr><td>Tapa análoga (m7G(5'))</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM 8050</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C 2432</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de L-cisteína monohidratado</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427-013</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR International</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma</td><td>F 4375</td><td></td></tr><tr><td>Fiji image J software</td><td></td><td></td><td>Descarga gratuita http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Melford</td><td>G 0124</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio, No.1.5&nbsp;</td><td>Suministros de laboratorio científico</td><td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tirador de agujas de vidrio</td><td>Narishige</td><td>Narishige PC -10</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de vidrio</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina crónica humana (HCG)</td><td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/7500/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de litio (LiCl)</td><td>Sigma</td><td>L-7026</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 y Software Zen (2008-2010)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab software</td><td>Mathworks</td><td></td><td>http://uk.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Agua de grado molecular&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 2819-10</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas&nbsp;</td><td>Botas Código de</td><td>barras 3600530 373048</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Lab.tech International</td><td>ND-1000 / ND8000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (55 mm)</td><td>VWR International</td><td>391-0865</td><td></td></tr><tr><td>Fenol-cloroformo</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Software Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.photoshop.com/products</td></tr><tr><td>ADN polimerasa de alta fidelidad y búferes&nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>M0530S&nbsp; Tampón - M0531S</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Cinta</td> aislante de PVC Fisher Scientific <td>P/4280/53</td><td></td>Kit de</tr> extracción de gel <tr><td></td><td>SH5006MPK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Onecall&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>S28704</td><td></td></tr><tr><td>Tampones de enzimas de restricción</td><td>Roche</td><td>SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse libre de ARNasa</td><td>Promega</td><td>ME10A</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de acero de un solo filo</td><td>Personna</td><td>66-0403-0000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>SP6 kit de transcripción</td><td>Ambion</td><td>AM1330</td><td></td></tr><tr><td>Diapositivas de vidrio</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHE 2505</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de</td><td></td><td></td> tungsteno <td></td></tr><tr><td>software Zen lite</td> casero <td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Descarga gratuita&nbsp; http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td></tr></tbody></table>

uso del análisis confocal de<em&gt; xenopus laevis</em&gt; encargado de investigar moduladores de wnt y shh morfógeno degradados

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Este protocolo describe un método para visualizar ligandos distribuidos a través de un campo de células. La facilidad de expresar proteínas exógenas, junto con el gran tamaño de sus células en embriones tempranos, hacen de Xenopus laevis un modelo útil para la visualización de ligandos GFP-etiquetados. MRNAs sintéticos se traducen de manera eficiente después de la inyección en las primeras etapas de embriones de Xenopus, y las inyecciones pueden ser dirigidos a una sola célula. Cuando se combina con un trazador de linaje tales como membrana atado RFP, la célula inyectada (y sus descendientes) que están produciendo la proteína sobreexpresada fácilmente pueden ser seguidos. Este protocolo describe un método para la producción de etiquetado con fluorescencia Wnt y Shh ligandos de mRNA inyectado. Los métodos implican la micro disección de los explantes ectodérmicas (CAPS animales) y el análisis de la difusión ligando en múltiples muestras. Mediante el uso de formación de imágenes confocal, información sobre la secreción de ligando y la difusión sobre un campo de células se puede obtener. Los análisis estadísticos de imágenes confocal proporcionan datos cuantitativos sobre la forma de gradientes ligando. Estos métodos pueden ser útiles para los investigadores que quieran probar los efectos de los factores que pueden regular la forma de gradientes morfógeno.

Confocal análisis de los explantes animales tapa expresar proteínas etiquetadas con fluorescencia proporciona un sistema eficaz para la visualización de la distribución ligando bajo diferentes condiciones experimentales. En un ejemplo, la distribución de GFP etiquetada Shh se muestra (Figura 1). En la etapa de 2 células, embriones de Xenopus se inyectan en ambas células con ya sea con un ARNm de control o con el ARNm que codifica para SULF1, una enzima que modifica el heparán sulfato de la supe...

El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

El objetivo general de esta metodología es visualizar la secreción y difusión de ligandos marcados con fluorescencia en un epitelio intacto mediante la expresión en xip pos lavis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el establecimiento de gradientes morfo que se sabe son esenciales en la especificación de linajes celulares durante el desarrollo embrionario temprano. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un método sencillo para visualizar la distribución de ligandos en un epitelio intacto.Una parte esencial del protocolo consiste en generar ligandos biológicamente activos que sean normalmente procesados y secretados, y que sean capaces de provocar una respuesta en las células receptoras a pesar de tener una etiqueta fluorescente unida. La microscopía confocal es una manera ideal para estudiar la localización de proteínas marcadas fluorescentemente dentro de tejidos tridimensionales, ya que el uso de láseres y detectores independientes permite un análisis limpio dentro de estos tipos de tejidos complejos y posibilita la obtención de datos robustos. Después de generar el recubrimiento de ARNm para ligandos marcados fluorescentemente y obtener emb

using-confocal-analysis-xenopus-laevis-to-investigate-modulators-wnt

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Ectodermo embrionario de Xenopus se ha convertido en un atractivo modelo para el estudio de la polaridad celular. Un ensayo se describe, en el que la distribución subcelular de las proteínas fluorescentes se evalúa en las células de ectodermo. Este protocolo ayudará a contestar preguntas relacionadas con el control espacial de la señalización.

Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en Xenopus Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt

Los procesos de desarrollo tales como la proliferación, el patrón, la diferenciación, y guía de axones se pueden modelar fácilmente en la médula espinal pez cebra. En este artículo se describe un procedimiento de montaje para los embriones de pez cebra, que optimiza la visualización de estos eventos.

La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

En los embriones de Xenopus, las células del techo del blastocelo son pluripotentes y pueden programarse para generar varios tejidos. Aquí, describimos los protocolos para usar explantes de techo de blastocoel de anfibios como un sistema de ensayo para investigar las características clave in vivo e in vitro del desarrollo neuronal temprano.

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Este artículo de vídeo detalla una sencilla metodología vivo que se puede utilizar para caracterizar de manera sistemática y eficiente los componentes de las vías de señalización complejos y las redes de regulación en muchos embriones de invertebrados en.

El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelos de desarrollo para el estudio celular de la célula-a-complejo de señalización de red Interacciones

Este protocolo tiene como objetivo demostrar cómo microinyectar una mezcla de ADN/DOTAP en los auriculares de embriones Xenopus laevis de un día de edad, y cómo imagen y reconstrucción de proteínafluorescentes verdes individuales (GFP) expresando árboles axonales ópticos en intactos, los renacuajos vivos de Xenopus.

Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos

Presentamos un protocolo de dos partes que combina imágenes fluorescentes de calcio con hibridación in situ, permitiendo al experimentador correlacionar patrones de actividad de calcio con perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Aquí, describimos herramientas y métodos computacionales que permiten la visualización y el análisis de datos de imágenes tridimensionales y cuatridimensionales de embriones de ratón en el contexto de la elongación y segmentación axial, obtenidos por tomografía de proyección óptica in toto, y por imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo mediante microscopía multifotónica.

Enfoques de visualización y análisis tridimensionales y de cuatro dimensiones para estudiar la elongación y segmentación axial de vertebrados

Aquí, se proporciona un protocolo optimizado paso a paso para la fijación, inmunotinción y seccionamiento de embriones para detectar filopodias de señalización especializada llamadas citonemas en tejidos de ratón en desarrollo.

Fijación de tejido embrionario de ratón para análisis citonémico

El embrión de Xenopus laevis sigue siendo excepcionalmente útil en el estudio del desarrollo temprano debido a su gran tamaño y facilidad de manipulación.   Se proporciona un protocolo simplificado para el protocolo de hibridación in situ de montaje completo que se puede utilizar en la identificación de órganos específicos en este sistema modelo.

La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación en<em&gt; Xenopus</em

Aprende a visualizar la secreción y difusión de ligandos fluorescentes en epitelio intacto de Xenopus laevis mediante microscopía confocal. Este método permite estudiar gradientes de morfógenos y su regulación en desarrollo embrionario.

Uso del análisis confocal de

Explorar más videos