Name: Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Aprende a generar virus infecciosos a partir de cDNA clonado de virus de ARN de cadena positiva utilizando cromosomas artificiales bacterianos. Este método permite estudiar replicación viral y desarrollar vacunas definidas genéticamente.

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Los autores desean agradecer al fondo de Ciencia, Tecnología e Investigación de Utah por su apoyo a YML y a las subvenciones de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (2009-0069679 y 2010-0010154) por su apoyo a SIY. Esta investigación fue apoyada por la Estación Experimental Agrícola de Utah, Universidad Estatal de Utah, y aprobada como artículo de revista número UAES # 8753. Además, los autores agradecen a la Dra. Deborah McClellan por su asistencia editorial.

Los autores han declarado que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El protocolo actual ha sido utilizado con éxito para generar de larga duración clones de cDNA infecciosos para dos cepas diferentes (CNU / LP2 27 y SA 14 -14-2 28) de JEV, un flavivirus cuyo cDNA funcional ha demostrado ser inherentemente difícil de construir y propagar debido a la toxicidad de la célula huésped y la inestabilidad genética del cDNA clonado 8,74-76 Este protocolo implica tres componentes principales:. primeros, maximizando la síntesis / amplificación de una copia de ADNc fieles de la ARN viral de alta fidelidad utilizando transcriptasa inversa / ADN polimerasa; segundo, la clonación de la región viral prM-E de codificación que contiene secuencias tóxicas (datos no publicados) 74,77,78 en un muy bajo número de copias del vector BAC a partir del ADNc inicial subclonación a las de longitud completa pasos finales de montaje cDNA; y tercero, la utilización de un BAC vector de clonación que puede acomodar un ADN extraño con un tamaño medio de 120 a 350 kb, 19-21 que aparentemente tolera más grande inse DNArts que hacen otros vectores de clonación. Este enfoque de clonación será generalmente aplicable a muchos otros virus de ARN de cadena positiva, particularmente aquellos con un gran genoma de ARN de ~ 10 a 32 kb. Generación de un clon de cDNA infeccioso es un paso clave en el desarrollo de un sistema de genética inversa para los virus de ARN, especialmente para los virus de ARN de cadena positiva, porque su genoma actúa como ARNm viral que se traduce en proteínas por los ribosomas de la célula huésped. Por lo tanto, la replicación viral puede ser iniciado por la introducción de un genoma de ARN de longitud molécula de ADNc derivado en una célula huésped susceptible. La disponibilidad de un clon de ADNc infeccioso JEV, cuando se combina con la tecnología de ADN recombinante, se ha incrementado nuestra comprensión de los diversos aspectos del ciclo de vida viral a nivel molecular, tales como la expresión génica y la replicación del genoma 73,79. 63,64 Además, una ADNc de longitud completa JEV clon ha demostrado ser una herramienta valiosa para el desarrollo de vacunas antivirales 28 y vectores de suministro de genes. &lt;sup&gt; 80,81 Al igual que con todos los virus de ARN de cadena positiva, hay múltiples pasos críticos en la construcción de un ADNc funcional confiable para JEV partir de la cual RNAs altamente infecciosas se pueden sintetizar in vitro. Idealmente, la secuencia de los ARN sintéticos transcritos a partir de un clon del ADNc de longitud completa debe ser idéntica a la del ARN genómico viral, en particular los 5&#39;-y 3&#39;-terminales secuencias que se requieren para la iniciación de la replicación viral RNA . de 60-62 En el protocolo actual, el auténtico 5&#39;-y 3&#39;-extremos se aseguraron mediante la colocación de la secuencia del promotor SP6 aguas arriba de la primera de nucleótidos de adenina del genoma viral y el posicionamiento de un sitio artificial única restricción Xba I aguas abajo de la última timina nucleótidos del genoma viral, respectivamente. Capsulado RNAs sintéticos con el auténtico 5 &#39;y 3&#39; se produjeron mediante transcripción run-off de un cDNA te Xba I-linealizado y tratado con MBNmplate usando SP6 ARN polimerasa cebada con la m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un análogo de tapa. Este protocolo puede ser modificado de varias maneras. Para la transcripción in vitro, otro ARN del bacteriófago polimerasa (por ejemplo, T3 o T7) se puede utilizar en conjunción con su secuencia promotora bien definido. 27 Como un sitio run-off, un sitio de restricción diferente se puede utilizar si no está presente en el genoma viral y si ARN sintético a partir del ADNc linealizado termina con el final auténtico 3 &#39;. La importancia de la secuencia de nucleótidos del extremo 3 &#39;se ha demostrado por una disminución de ~ 10 veces en la infectividad del ARN cuando un ARN sintético contiene tres o cuatro nucleótidos-virus no relacionado en su extremo 3&#39;. 27 En una reacción de transcripción in vitro, tanto la m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) A y m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G analógico tapa puede ser utilizado igualmente bien, aunque los últimos lugares una relación G nucleótidos extra de aguas arriba de la viral 5 &#39;-end, pero queAdemás no altera la infectividad o replicación del ARN sintético. 27 Por otra parte, la eliminación de la plantilla de ADNc a partir de los transcritos de ARN por digestión con DNasa I no es necesario para las pruebas de ARN de infectividad, porque la plantilla de cDNA en sí no es infecciosa. 27 La tecnología BAC ahora se ha aplicado a la construcción de clones de cDNA infecciosos para un puñado de virus de ARN de cadena positiva, a saber, dos JEVs, CNU / LP2 27 y SA 14 -14-2 28 (tamaño del genoma, ~ 11 kb); dos virus del dengue, BR / 90 26 y NGC 29 (~ 11 kb); la diarrea viral bovina virus, SD1 (~ 12 kb); 25 de dos virus de la peste porcina clásica, C y Paderborn (~ 12 kb); 24 el virus de la enfermedad de fronteras, Gifhorn (~ 12 kb); 24 el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 el virus de la gastroenteritis transmisible, PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 el virus de la peritonitis infecciosa felina,DF-2 (~ 29 kb); 32 el síndrome severo coronavirus respiratorio agudo, Urbani (~ 30 kb); 9 el síndrome respiratorio coronavirus Oriente Medio, EMC / 2012 (~ 30 kb); 17 y el coronavirus humano OC43 (~ 31 kb) 31 La principal ventaja de usar BAC para la construcción de ADNc es la alta estabilidad genética de los grandes, plásmidos BAC de 1 o 2 copias.; sin embargo, la naturaleza intrínseca de su número extremadamente bajo de copia es también una gran desventaja, debido a muy bajos rendimientos de ADN BAC y la consiguiente reducción en la pureza del ADN de BAC con respecto a la sede de ADN cromosómico. En el protocolo actual, el rendimiento de ADN de BAC se maximiza por el crecimiento de E. coli DH10B transformó con el pBAC BAC infeccioso / SA 14 -14-2 en un medio rico en nutrientes, 2xYT. A pesar de este esfuerzo, el rendimiento promedio es de sólo ~ 15 g de ADN BAC a partir de 500 ml de caldo 2xYT. Además, la pureza del ADN de BAC se logra mejor mediante el uso de CsCl-EtBr centrifugación en gradiente de densidad para la purificación, En lugar del plásmido aislamiento basado en columnas de uso común. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la E. BAC-transformado coli no debe crecer demasiado, ya que podría poner en peligro la estabilidad genética del cDNA clonado, y un mayor crecimiento no necesariamente conducir a mayores rendimientos o ADN BAC de mayor pureza. El protocolo descrito aquí es un optimizado, y el método aerodinámico eficiente para la construcción y propagación de una larga duración cDNA clon infeccioso genéticamente estable como un BAC de JEV, un procedimiento, una vez pensó prácticamente imposible. Esta misma estrategia de clonación se puede aplicar también a muchos otros virus de ARN de cadena positiva. En general, los clones de ADNc infecciosos nos permiten introducir una variedad de mutaciones (por ejemplo, deleciones, inserciones, y mutaciones puntuales) en un genoma de ARN viral para estudiar sus funciones biológicas en la replicación viral y la patogénesis. Este sistema de genética inversa basada en cDNA hace que sea posible desarrollar y TESt vacuna y candidatos terapéuticos dirigidos a un factor de virulencia (s) de un virus de ARN de cadena positiva particular de interés. Además, esta tecnología cDNA infeccioso también puede ser utilizado como un vector viral, capaz de expresar un gen extraño (s) de interés para muchas aplicaciones en la investigación biomédica.

Para virólogos de ARN, el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante a finales de 1970 hizo posible convertir genomas de ARN viral en los clones de ADNc, que luego podrían ser propagan como plásmidos en bacterias para la manipulación genética de los virus de ARN. 1 La primera virus de ARN para ser molecularmente clonado se Qß bacteriófago, un virus de ARN de cadena positiva que infecta a Escherichia coli. Un plásmido que contiene una copia completa de ADNc del ARN genómico Qß dio lugar a fagos Qß infecciosas cuando se introduce en E. coli. 2 Poco después, esta técnica se aplicó a poliovirus, un virus de ARN de cadena positiva de los seres humanos y animales. Un plásmido que lleva un ADNc de longitud completa del ARN genómico poliovirus se infecciosas cuando se transfecta en células de mamífero y capaz de producir viriones infecciosos 3 En este enfoque &quot;DNA-puesto en marcha&quot;, los ADNc clonados deben ser transcritas intracelularmente para iniciar la replicación del ARN viral.;Sin embargo, no está claro cómo se inicia la transcripción y cómo las transcripciones se procesan a la secuencia viral correcta. Esta preocupación ha llevado al desarrollo de un &quot;RNA-lanzado&quot; enfoque alternativo, en el que se clona una copia completa de ADNc del genoma de ARN viral bajo un promotor reconocido por una E. coli o ARN polimerasa del fago para la producción de RNAs sintéticos in vitro con definido 5 &#39;y 3&#39;, que se someten al ciclo de replicación viral completa cuando se introduce en células huésped. 4,5 El primer éxito con este enfoque se informó para el virus del mosaico del bromo 6,7, un virus de ARN de cadena positiva de las plantas. Desde entonces, el enfoque de ARN-lanzado ha sido desarrollado para una amplia gama de virus de ARN de cadena positiva, incluyendo calicivirus, flavivirus, alfavirus, arterivirus y coronavirus. 1,4,5,8 Tanto en el ADN y ARN-lanzado sistemas de genética inversa, la construcción de un full de longitud clon de ADNc es la clave para la generación de ADN o ARN infecciosa de los virus de ARN de cadena positiva, pero se convierte en un considerable reto técnico como el tamaño de los aumentos del genoma viral. 9-17 En particular, un gran genoma de ARN de ~ 10 -32 kb presenta tres principales obstáculos para la clonación de un ADNc funcional de cuerpo entero. 18 La primera dificultad es la síntesis de una fiel copia de ADNc, ya que la fidelidad de RT-PCR es inversamente proporcional a la longitud del ARN viral. El segundo obstáculo es la presencia de secuencias potencialmente tóxicos, ya que las moléculas de ARN largas son más propensas a contener secuencias inesperadas capaces de hacer que el fragmento de ADNc en los plásmidos inestables en E. coli. La tercera y más importante problema es la disponibilidad de un vector adecuado, ya que es difícil encontrar un vector de clonación que puede albergar un inserto de ADNc viral de&gt; 10 kb. Durante las últimas tres décadas, estas barreras han sido superadas por varios avances en enzimología, la metodología, un. d vectorología 1,4,5,8 De éstos, el desarrollo más prometedor e innovador es la clonación de grandes virus de ARN de cadena positiva cromosomas artificiales bacterianos (BAC como infecciosas). El vector de BAC es un plásmido de bajo copia clonación (1-2 copias / célula) basado en el E. factor de fertilidad coli, con un tamaño medio de inserto de ADN de ~ 120-350 kb 19 a 21 Un fragmento de ADN se inserta en el vector de BAC en una manera similar a la clonación en vectores de clonación generales.; los clones BAC resultantes son estables a lo largo de muchas generaciones en E. . coli 22,23 Hasta la fecha, la tecnología BAC se ha utilizado para crear clones de cDNA infecciosos para&gt; 10 miembros de tres familias de virus de ARN de cadena positiva, es decir, Flaviviridae, 24-29 de Arteriviridae, 30 y Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32 El uso de virus de la encefalitis japonesa (JEV) como ejemplo, el presente trabajo presenta los procedimientos detallados que pueden serutilizado para construir un integral BAC infeccioso genéticamente estable para una variedad de virus de ARN de cadena positiva. JEV es un flavivirus zoonótica 33 que se transmite en la naturaleza entre las aves, cerdos y otros huéspedes vertebrados por mosquitos vectores 34,35. En los seres humanos, la infección por JEV puede causar la enfermedad neurológica encefalitis japonesa a menudo fatal grave (JE), 36 que se produce en Asia y partes del Pacífico occidental, 37,38, con una incidencia anual estimada de ~ 50,000-175,000 casos clínicos. 39,40 El genoma de JEV es un ~ 11 kb, de sentido positivo molécula de ARN de cadena simple y consiste en termina un solo marco de lectura abierto (ORF) flanqueada por dos regiones no codificantes (NCR) en los extremos 5 &#39;y 3&#39;. 41,42 El ORF codifica una poliproteína que se escinde por el anfitrión y proteasas virales para generar 10 proteínas individuales, designada C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5 en el N- a la dirección C-terminal. 34,43,44 Además, un correoforma Xtended de NS1 (NS1) se expresa por -1 frameshifting ribosomal en los codones 8-9 de NS2A. 45,46 De estas 11 proteínas, las tres proteínas estructurales (C, prM y E) son esenciales para la formación de infecciosa viriones, 47,48 y los restantes ocho proteínas no estructurales (NS1 a NS5 y NS1 &#39;) son cruciales para la replicación viral ARN, ensamblaje de partículas 49-51, 52-56 y evasión de la inmunidad innata. 57-59 Tanto el 5&#39; y 3 &#39;NCR contienen conservan secuencias primarias y las estructuras de forma de ARN secundarias / terciarias, 60-62, que son importantes para la modulación de la replicación del ARN viral. 63,64 Este protocolo describe las herramientas, métodos y estrategias para la generación de un larga duración infecciosa BAC de JEV SA 14 -14-2. 28 Este clon BAC funcional contiene una copia completa de ADNc del ARN genómico JEV, 65 que está rodeada por un promotor para la ARN polimerasa SP6 aguas arribadel viral extremo 5 &#39;y un sitio de restricción Xba I único aguas abajo del extremo 3&#39; viral para la transcripción in vitro de escorrentía. Esta tecnología BAC es aplicable a la construcción de un clon de ADNc molecular totalmente funcional para una gran variedad de virus de ARN de cadena positiva.

<table><tbody><tr><td><fuerte>1. Clonación molecular</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Caldo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[3H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>Radioactivo</td></tr><tr><td>50 ml Tubo</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>Botella de 250 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa (bajo punto de fusión)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New Inglaterra BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro DE-81</td> cancerígeno <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH10B&nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td> Columna de filtro <td>tóxica y altamente mutagénica</td></tr><tr><td>(Kit de Maxiprep de plásmido)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Glucosa irritante</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl Alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol inflamable&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td></td></tr><tr><td>Caldo LB</td> inflamable <td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de litio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Lisozyme</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Transcripcióna inversa</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Nucleasa de frijol mungo</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>Aguja (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>Biopeligroso (residuos punzantes)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S Tecnologías de</td><td></td></tr><tr><td>ADN integrado</td><td>de oligonucleótidos</td><td>Síntesis</td><td></td>personalizada de oligonucleótidos</tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Fenol (saturado con tampón)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>Tóxico y altamente corrosivo</td></tr><tr><td>Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>Tóxico y altamente corrosivo</td></tr><tr><td>Fenol:Guanidina Isotiocianato</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>Tóxico, corrosivo e irritante</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de potasio</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ARNasa</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP Set</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno sellable (16 y veces; 76 mm)& nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 ARN polimerasa</td> Columna de centrifugación <td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td> (kit de minipreparación de <td></td></tr><tr><td>plásmidos)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (levadura)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>2. Cultivo celular</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alfa Minimal Essential</td><td>Medium Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo (150 mm)&nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta (espacio de 2 mm)</td><td>Aparato Harvard</td><td>450125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Glutamina tóxica y cancerígena</td></tr><tr><td>Life</td><td>Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Placa de seis pocillos</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies ( Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vitaminas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>3. Equipo</fuerte>Sistema de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>electroforesis de gel de agarosa</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador</td><td>Harvard Apparatus ECM</td><td>830</td><td></td></tr><tr><td>Lámparas ultravioleta de onda larga (de mano)</td><td>Centrífuga de sobremesa UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Industrias Científicas</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de genómica funcional para el estudio de cadena positiva virus de arn

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

La genética inversa, un enfoque para rescatar virus infecciosos completamente de un ADNc clonado, ha revolucionado el campo de los virus de ARN de cadena positiva, cuyos genomas tienen la misma polaridad que el ARNm celular. El sistema de genética inversa basado en ADNc es un método seminal que permite la manipulación directa del ARN genómico viral, generando así virus recombinantes para estudios moleculares y genéticos tanto de elementos de ARN viral como de productos génicos en la replicación y patogénesis viral. También proporciona una valiosa plataforma que permite el desarrollo de vacunas genéticamente definidas y vectores virales para la entrega de genes extraños. Sin embargo, para muchos virus de ARN de cadena positiva, como el virus de la encefalitis japonesa (JEV), los ADNc clonados son inestables, lo que representa un obstáculo importante para la construcción y propagación del ADNc funcional. En el presente informe se describen las consideraciones estratégicas para crear y amplificar un ADNc infeccioso JEV de longitud completa genéticamente estable como cromosoma artificial (BAC) bacteriano utilizando los siguientes procedimientos experimentales generales: aislamiento de ARN viral, síntesis de ADNc, subclonación y modificación de ADNc, ensamblaje de un ADNc de longitud completa, linealización de ADNc, in vitro Síntesis de ARN y recuperación de virus. Este protocolo proporciona una metodología general aplicable a la clonación de ADNc de longitud completa para una variedad de virus de ARN de cadena positiva, particularmente aquellos con un genoma de >10 kb de longitud, en un vector BAC, a partir del cual se pueden transcribir ARN infecciosos in vitro con una ARN polimerasa bacteriófago.

Para todos los virus de ARN de cadena positiva, la fiabilidad y la eficiencia de un sistema de genética inversa dependen de la estabilidad genética de un ADNc de longitud completa clonado, cuya secuencia es equivalente a la secuencia consenso de ARN genómico viral. 27 La figura 1 muestra un anillo de cinco estrategia de paso para la construcción de un cDNA infeccioso de longitud completa como un BAC para JEV SA 14 -14-2 28: Paso 1, la purificación de ARN viral a partir del sobrenadante de cultivo celular de células BHK-21 infectadas por el JEV (Figura 1A); Paso 2, la síntesis de cuatro amplicones de ADNc superpuestas (F1 a F4) que abarcan todo el genoma viral (Figura 1B); Paso 3, la subclonación de cada uno de los cuatro fragmentos de ADNc contiguas en un vector BAC, creando pBAC / F1 a pBAC / F4 (Figura 1C); Paso 4, la modificación de los ADNc clonados para la transcripción in vitro el escurrimiento con SP6 ARN polimerasa, es decir, la colocación de un SP6secuencia del promotor inmediatamente corriente arriba del extremo 5 &#39;viral (pBAC / F1 SP6), la eliminación de una pre-existente sitio interno Xba I en el nucleótido 9131 mediante la introducción de una mutación puntual silenciosa, A 9134 → T (pBAC / F3 KO), y la inserción de un sitio de escorrentía nueva Xba artificial inmediatamente aguas abajo de la viral extremo 3 &#39;(pBAC / F4 RO) (Figura 1 D); y el Paso 5, el montaje de un álbum SA 14 -14-2 ADNc BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (Figura 1E) Tabla. 1 se enumeran los oligonucleótidos utilizados en este procedimiento de clonación. 28 Para la construcción de un ADNc JEV funcional, el primer paso importante es la síntesis de los cuatro fragmentos de ADNc solapados utilizando el ARN viral purificado como molde para la RT-PCR. La Figura 2 proporciona un resultado representativo para los cuatro productos de RT-PCR que eran electroforesis en un 0,8%gel de agarosa. Este gel demuestra claramente que un ADNc de longitud completa JEV se amplifica en cuatro fragmentos de ADNc que se solapan. Ocasionalmente, las reacciones de RT-PCR podrían producir uno o más productos específicos del virus o no específicos que son en su mayoría más pequeño que el producto esperado, debido a la hibridación no específica de los cebadores durante la síntesis de ADNc / amplificación. Por otro lado, poca o ninguna espera que el producto de RT-PCR se amplificó debido a la contaminación accidental RNasa durante el aislamiento de ARN viral o impropio rendimiento RT-PCR. El siguiente paso clave es la clonación y la modificación de una de longitud completa parcial- o ADNc JEV en BAC, que es un procedimiento relativamente sencillo que utiliza técnicas estándar de ADN recombinante. 69 Figura 3 presenta un resultado representativo para la purificación del clon BAC que contiene un ADNc de longitud completa de JEV SA 14 -14-2 por bandas en un gradiente de CsCl-EtBr.En este experimento, después de centrifugación durante 16 horas a 401.700 xg, dos bandas distintas, es decir, el E. coli ADN cromosómico anterior y el plásmido de ADN superenrollado BAC a continuación, son visibles en el centro del tubo bajo luz ultravioleta de onda larga. Un volumen mínimo (~ 400 l) de la banda de ADN BAC inferior se recogió cuidadosamente por hacer un agujero con una jeringa en el lado del tubo. Posteriormente, el EtBr se extrajo a partir del ADN de BAC por extracción butanol, y el ADN BAC-EtBr libre se concentró por precipitación con etanol. El paso final es la determinación de la infectividad específica de los RNAs sintéticos transcritas in vitro a partir de longitud completa SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) después de transfección de ARN en las células permisivas (Figura 4). Este paso consiste en tres pasos secuenciales: Paso 1, linealización de los de larga duración SA 14 -14-2 cDNA en el 3 &#39;-end del genoma viral (Figura 4A); Paso 2, la producción de los ARN sintéticos a partir del ADNc linealizado por escorrentía de transcripción (Figura 4B); y el Paso 3, rescate de los virus recombinantes en células BHK-21 transfectadas con los ARN sintéticos (Figura 4C). Experimentalmente, dos clones independientes de pBAC / SA 14 -14-2 fueron linealizados con la digestión XbaI y tratados con MBN para quitar los cuatro-base 5 &#39;saliente generado por la digestión XbaI. Los BAC linealizadas se limpiaron mediante extracción con fenol-cloroformo, seguido de precipitación con etanol. La linealización de los dos BAC purificados se demostró en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 5A). La extracción con fenol-cloroformo debe hacerse con cuidado para asegurarse de que la BAC linealizadas son RNasa libre. Cada uno de los dos BAC linealizadas sirvió como molde de ADNc para la transcripción run-off usando SP6 RNA polimerasa en presencia de la m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un análogo de tapa. La integridad de los ARN sintéticos se demostró mediante la ejecución de partes alícuotas de las dos mezclas de reacción de transcripción en un gel de agarosa al 0,6%, junto con una referencia 1 kb escalera de ADN (Figura 5B). En este sencillo ensayo, la banda principal de ARN prominente siempre migra justo por debajo de los 3 kb referencia banda de ADN y que parecía ser agudo. Sin embargo, la degradación de ARN tendría una apariencia manchada en el mismo gel. Un ensayo de centro infeccioso es el estándar de oro para determinar la infectividad específica de los ARN sintéticos. Este ensayo se realizó por electroporación células BHK-21 con muestras de ARN, la siembra de la igualdad de alícuotas de las 10 veces las células diluidas en serie a electroporación en placas de 6 pocillos que contienen células ingenuas BHK-21 (3 × 10 5 células / pocillo), y la superposición de agarosa sobre las monocapas de células. Después de la incubación durante 4 días, las células supervivientes se fijaron con formaldehído y se tiñeron con cristal violeta s unaolución para cuantificar el número de centros infecciosas (placas), que corresponde al número de moléculas de ARN infecciosos entregado en las células (Figura 6A). Puesto que el molde de cDNA usado para la transcripción in vitro se ha demostrado ser no infecciosa, 27 una parte alícuota de la mezcla de reacción de transcripción se usó directamente para la electroporación. La electroporación es el método preferido para la transfección de ARN; Alternativamente, los ARN se pueden transfectar por otros métodos que utilizan liposomas DEAE-dextrano y catiónicos. RNA electroporación es muy eficaz, pero &quot;arco&quot; del pulso eléctrico se produce raramente, si sales están presentes en la reacción de electroporación o si la cubeta de electroporación se reutiliza. La expresión de proteínas virales en las células transfectadas con ARN se examinó mediante ensayos de inmunofluorescencia utilizando un antisuero de conejo anti-NS1 (Figura 6B). La producción de partículas virales acumulados en los sobrenadantes de células transfectadas con ARN fue unaalyzed por ensayos de placa (Figura 6C). Los resultados de estos experimentos muestran claramente que los RNAs sintéticos derivados de cDNA son infecciosos en células permisivas BHK-21, generando un alto título de virus recombinantes. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonucleótido </td><td> Secuencia A (5 &#39;a 3&#39;) </td><td> Posición b </td><td> Polaridad </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1.22 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> HormigaIntuyo </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10952-10977 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956 a 10977 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac ejército de reserva </td><td></td><td> Sentido </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 01.14 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisentido </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10670 hasta 10694 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10954 hasta 10.977 </td><td> Antisentido </td></tr><tr><td colspan="4"> unas secuencias JEV se muestran en letras mayúsculas, y las secuencias de BAC se indican en letras minúsculas. posición b nucleótidos se refiere a la secuencia completa del genoma de JEV SA 14 -14-2 (número de acceso GenBank JN604986). </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Los oligonucleótidos utilizados para la síntesis de ADNc, amplificación por PCR, y mutagénesis de BAC. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figura 1.0; Estrategia para la construcción de un ADNc de longitud completa de JEV SA 14 -14-2 como BAC (A) Aislamiento de ARN viral de partículas JEV.. Se muestra un diagrama esquemático del ARN genómico de JEV SA 14 -14-2. (B) Síntesis de cuatro fragmentos de ADNc superpuestas (F1 a F4) que cubre la totalidad del genoma viral. (C) Subclonación de cuatro fragmentos de ADNc solapados en un vector BAC, creando pBAC / F1 a pBAC / F4. (D) La modificación de los ADNc clonados para la transcripción de escorrentía in vitro. pBAC / F1 SP6 es un derivado de pBAC / F1 que contiene la secuencia del promotor SP6 aguas arriba del extremo 5 &#39;viral. pBAC / F3 KO es un derivado de pBAC / F3 que contiene una mutación silenciosa punto (A → T 9134, asterisco). pBAC / F4 RO es un derivado de pBAC / F4 que contiene un sitio Xba I artificial escorrentía de aguas abajo del extremo 3 &#39;viral. (E </<html> strong&gt;) Asamblea de un álbum SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> Figura 2. Síntesis de cuatro fragmentos de ADNc superpuestas (F1 a F4) que abarca la longitud completa de ARN genómico de JEV SA 14 -14-2. Los cuatro productos de RT-PCR se evaluaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. M, escalera de ADN de 1 kb. Los tamaños esperados de los cuatro fragmentos de ADNc se indican en la parte inferior de la imagen de gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. La purificación del BAC que contiene un ADNc de longitud completa de JEV SA 14 -14-2. El plásmido BAC está aislado de E. coli DH10B por el método de lisis alcalina y SDS-purificó adicionalmente por bandas en un gradiente de CsCl-EtBr. Se presenta un ejemplo de la gradiente de CsCl-EtBr usando un tubo de polipropileno sellable 16 × 76 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> Figura 4. Visión general de la recuperación de los virus infecciosos de un álbum JEV SA 14 -14-2 ADNc montado en un BAC. (A) Linealización de la plantilla de cDNA. La larga duración JEV BAC se corta conXba I y se trató con MBN. (B) Síntesis de los transcritos de ARN. El ADNc linealizado se transcribe por la ARN polimerasa SP6 en presencia del 7 m G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un análogo de tapa. (C) La recuperación de la JEVs sintético. Los in vitro ARN transcritos se transfectaron en células BHK-21 mediante electroporación, que genera un alto título de virus sintético. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Figura 5. Síntesis de los ARN por transcripción in vitro utilizando un JEV BAC de longitud completa como una plantilla de ADNc. (A) Generación de los de larga duración linealizado JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. Dos clones independientes de pBAC/ SA 14 -14-2 (CL.1 y CL.2) se linealizadas por digestión con Xba I y posterior tratamiento con MBN. Los BAC linealizadas se examinan por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. (B) Producción de los ARN sintéticos mediante transcripción escorrentía. Cada uno de los dos BAC linealizadas se usa como una plantilla para la transcripción de ARN polimerasa SP6 escorrentía. Las alícuotas de las dos reacciones de transcripción se ejecutan en un gel de agarosa al 0,6%. M, 1 kb escalera del ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Figura 6. infectividad específica de los RNAs sintéticos transcritos a partir de un BAC JEV de longitud completa y la recuperación de virus sintético. Células BHK-21 son de forma simulada a electroporación (Mock) o electroporación con los transcritos de ARN derivados from cada uno de los dos clones independientes de los de larga duración JEV BAC (CL.1 y CL.2). (A) la infectividad del ARN. Las células se recubrieron con agarosa y se tiñeron con violeta cristal a los 4 días después de la transfección. RNA infectividad se determina mediante ensayos de centro infecciosas para estimar la cantidad de ARN infecciosa electroporación en las células (panel izquierdo). Además, se muestran imágenes representativas de centros infecciosos (panel derecho). (B) Expresión de proteínas. Las células se cultivan en portaobjetos de cámara de 4 pocillos. Expresión de la proteína viral en células de ARN-a electroporación en 20 horas después de la transfección (hpt) se analizó mediante ensayos de inmunofluorescencia utilizando un antisuero de conejo anti-NS1 primaria y una cabra conjugado con Cy3 secundario IgG anti-conejo (rojo). Los núcleos se contratiñeron con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (azul). Las imágenes de inmunofluorescencia se superponen en sus diferenciales correspondientes imágenes de contraste de interferencia. (C) de rendimiento Virus. Las células se cultivaron en 150 mm cultura platos. La producción de viriones infecciosos acumulados en los sobrenadantes de cultivo de células de ARN-electroporación en 22 y 40 hpt es examinado por ensayos de placa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, se presenta un protocolo para crear un cromosoma artificial bacteriano infeccioso que contiene un ADNc de longitud completa del ARN genómico de cadena positiva del virus de la encefalitis japonesa. Este protocolo se puede utilizar para construir un ADNc funcional de otros virus de ARN de cadena positiva, lo que lo convierte en una poderosa herramienta genómica para estudiar la biología del virus.

Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

El objetivo general de este procedimiento es recuperar partículas de virus infecciosos producidas completamente a partir de un cDNA clonado de virus de ARN de cadena positiva, cuyos genomas presentan la misma polaridad que el ARNm celular, como el virus de la encefalitis japonesa. Esta genética inversa basada en cDNA es un método fundamental que permite la manipulación directa del ARN genómico viral, generando así virus recombinantes para el estudio molecular y genético de la replicación y la patogénesis virales. Esta técnica también proporciona una plataforma valiosa que permite el desarrollo de vectores virales del virus vaccinia genéticamente definidos para la entrega de genes foráneos.Estos métodos son aplicables para la clonación de ADNc de longitud completa de virus de ARN de cadena negativa o positiva, particularmente aquellos con genomas mayores de 10 kb. Demostrando el procedimiento estarán varios miembros de mi laboratorio: la asistente de investigación Sang-Im Yun, los becarios postdoctorales Byung-Hak Song y Jin-Kyoung Kim, y el estudiante de pregrado Jordan Frank.La parte del video de esta publicación abarca la preparación del cromosoma bacteriano artificial que contiene las secuencias de interés, la síntesis de ARN transcrito a partir del plásmido inverso y cómo medir la infectividad del ARN y el rendimiento del virus. Todos los procedimientos utilizados antes de generar el plásmido BAC se proporcionan en el protocolo escrito con gran detalle. Para este procedimiento, primero cultive una colonia individual de E. coli DH10B, que porta el plásmido BAC, en tres mililitros de caldo 2X YT con cloranfenicol. Incube el cultivo durante 10 horas a 35 grados Celsius con agitación a 225-250 rpm.Después de 10 horas, aumente la escala del cultivo. A continuación, inocule 500 microlitros de crecimiento en 500 mililitros de medio y cultive el inóculo durante seis horas con agitación vigorosa. Después de seis horas, centrifugue el cultivo bacteriano en 2 botellas de 250 mililitros a 3.100 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, re suspenda cada pellet en 30 mililitros de solución GTE.Añada 500 microlitros de lisozima e incube las suspensiones en hielo durante 10 minutos. Mientras tanto, prepare una solución de lisis fresca para el siguiente paso. Después de 10 minutos, añada 60 mililitros de la solución de lisis y mezcle girando suavemente hasta que la solución aparezca clara.Deje que las reacciones transcurran a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, agregue 45 mililitros de solución neutralizante a cada frasco e inviértalos hasta que estén completamente mezclados. Luego, colóquelos en hielo durante 10 minutos.Recolecte los lisados neutralizados mediante centrifugación refrigerada a alta velocidad. Luego, recoja los sobrenadantes en dos nuevos frascos de 250 mililitros. Añada 0,6 volúmenes de isopropanol al 100 % a cada uno y colóquelos en hielo durante 20 minutos.A continuación, centrifugue los precipitados, deseche los sobrenadantes y disuelva los pellet en cinco mililitros de tampón TE. Combine los dos volúmenes en un solo tubo de 50 mililitros y precipite el ARN añadiendo un volumen igual de cloruro de litio 5 M e incubando la mezcla en hielo durante 10 minutos. Utilice una centrifugación fría de 20 minutos para recoger el precipitado de ARN.Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 250 mililitros, agregue dos volúmenes de isopropanol al 100 % y coloque el tubo en hielo para que se forme el precipitado de ADN. Después de 20 minutos, centrifugue para sedimentar el precipitado, aspire el sobrenadante, re suspenda el botón de ADN en 9,5 mililitros de tampón TE y transfiera la solución de ADN a un tubo de 50 mililitros.Continúe la preparación estableciendo el gradiente de cloruro de cesio con bromuro de etidio. Cargue la mezcla en un tubo de polipropileno sellable utilizando una jeringa con una aguja de calibre 18 y selle el tubo. Gire el tubo sellado durante la noche en una ultracentrífuga para formar un gradiente de cloruro de cesio.Al día siguiente, recolecte una banda de ADN del plásmido BAC a partir del gradiente de cloruro de cesio. Utilice una aguja de calibre 18 para crear una ventilación de aire en la parte superior del gradiente y una aguja de calibre 20 con jeringa para recolectar el ADN BAC desde el lateral del gradiente, y luego transfiera la recolección a un tubo microcentrífugo de 1,7 mililitros. Realice un lavado, agregue 2,5 volúmenes de butanol saturado con agua y mezcle mediante vortexado normal.Luego, centrifugue la mezcla a temperatura ambiente y transfiera la fase acuosa inferior a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,7 mililitros. Repita este lavado un total de seis veces para eliminar todo el bromuro de etidio. Ahora, precipite el ADN BAC. Agregue un décimo de volumen de acetato de sodio tres molar y 2,5 volúmenes de etanol al 100% al tubo. Incube la mezcla en hielo durante 10 minutos. Luego, centrifugue el precipitado a temperatura ambiente y lave el botón de ADN con un mililitro de etanol al 70%. Repita la centrifugación y recupere el botón nuevamente. Finalmente, seque al aire el ADN en botón durante 10 minutos y elúyalo en 200 microlitros de tampón TE.Comience con una digestión a gran escala con enzima de restricción del plásmido BAC con Xba-uno en un volumen total de 100 microlitros. Realice esta digestión a 37 grados Celsius durante 12 a 15 horas. A continuación, incube adicionalmente la digestión con 25 unidades adicionales de nucelasa de frijol mungo a 30 grados Celsius durante dos horas.Después de la incubación, aforar el volumen hasta 300 microlitros con agua destilada. A continuación, realice una extracción con fenol agregando un volumen igual de fenol-cloroformo, alcohol isoamílico a la muestra diluida, vortexeando vigorosamente durante un minuto, centrifugando el tubo y transfiriendo la fase acuosa superior a un tubo nuevo.A continuación, repita la extracción con cloroformo. Luego, recupere el ADN de BAC linealizado mediante precipitación con etanol. Recoja el pellet de ADN por centrifugación, deseche el sobrenadante y lave el pellet con un mililitro de etanol al 70 %. Repita el paso de centrifugación y seque el pellet al aire. Tras 10 minutos de secado, disuelva el pellet de ADN en 30 microlitros de agua destilada. A continuación, analice un microlitro del BAC recuperado en un gel de agarosa al 0,8 %.A continuación, prepare una transcripción por runoff de 25 microlitros del ADN del BAC linealizado, incluyendo UTP tritiado para la cuantificación de ARN. Realice la reacción a 37 grados Celsius durante una hora. Luego, examine uno o dos microlitros de la reacción de transcripción por runoff en un gel de agarosa al 0,6 %.Comience con células BHK-21 cultivadas durante 24 horas en placas de 150 milímetros sembradas a 3 millones de células por placa. Lave la monocapa celular con la solución fría A y luego desprenda las células mediante tripsinización. Recopile las células por centrifugación a 270 g durante dos minutos.Luego, resuspenda las células en 50 mililitros de la solución fría A y vuélvalas a centrifugar. Repita este lavado tres veces. Después del último lavado, resuspenda las células a 20 millones por mililitro en la solución A. A continuación, mezcle una alícuota de 400 microlitros de la suspensión celular con dos microgramos de ARN sintético en una cubeta de dos milímetros.Electroporar inmediatamente la mezcla en condiciones óptimas y dejar reposar las células durante 10 minutos. A continuación, transferir las células a un tubo microcéntrifugo que contenga 600 microlitros de medio de cultivo completo. Preparar ahora diluciones seriadas de diez veces de las células electroporadas en volúmenes de un mililitro. Sembrar alícuotas de 100 microlitros de cada dilución sobre monocapas de células BHK21 normales. Tras cuatro a seis horas de incubación, cubrir las células con agarosa al 0,5 % en MEM más suero bovino fetal (FBS) y cultivarlas durante cuatro días más.Las células BHK21 fueron sometidas a electro poración simulada o electro poradas con transcritos de ARN derivados de dos clones independientes del JEV-BAC de longitud completa. Cuatro días después, las células fueron teñidas con violeta de cristal para observar el ARN infeccioso en las células. Mediante esta tinción, se cuantificaron los centros infecciosos. A continuación, se examinó la expresión de proteínas virales en células electro poradas con ARN 20 horas después de la transfección, utilizando un antisuero de conejo anti-NS1 y un anticuerpo secundario conjugado con Cy3, visible en rojo. Los núcleos fueron contrateñidos con DAPI, visible en azul. Posteriormente, a las 22 y 40 horas tras la transfección, se analizó la producción de viriones infecciosos acumulados en los sobrenadantes de cultivo de las células electro poradas con ARN mediante ensayos de placas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recuperar un virus infeccioso completamente a partir de un ADNc clonado de una cepa positiva de ARN, como el virus de la encefalitis japonesa. Así que no olvide que trabajar con el virus de la encefalitis japonesa y otros patógenos humanos puede ser extremadamente peligroso. Es necesario contar con una formación adecuada en bioseguridad antes de realizar este procedimiento.

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