Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN

El objetivo general de este procedimiento es rescatar partículas de virus infecciosos hechos completamente de un CDNA clonado de cadena positiva, virus de ARN cuyos genomas están en la misma polaridad que Mr.NA celular, como el virus de la encefalitis japonesa. Esta genética regénica basada en CNA es un método semial que permite la manipulación directa del ARN genómico viral, generando así virus recombinantes para el estudio molecular y genético en la replicación y patogénesis viral. Esta técnica también proporciona una plataforma valiosa que permite el desarrollo de vacunas y vectores virales genéticamente definidos para la entrega de genes extraños.

Estos vasos son aplicables a la clonación de CDNA de longitud completa para virus de ARN de longitud o positiva, particularmente aquellos con genomas mayores de 10 kb. Demostrando el procedimiento estarán varios miembros de mi laboratorio de investigación asistente, el profesor San Nun para el becario postdoctoral UNG y Xing y Kim y los estudiantes de pregrado, Jordan Frank. La parte de video de esta publicación cubre la preparación del cromosoma artificial bacteriano que contiene las secuencias de interés, la síntesis de ARN, transcrito del plásmido posterior, y cómo medir la infectividad de los ARN y el rendimiento del virus.

Todos los procedimientos utilizados antes de generar el plásmido trasero se proporcionan en el protocolo de texto con gran detalle. Para este procedimiento, primero se cultiva una sola colonia de E. coli DH 10 B, llevando el plásmido trasero en tres mililitros de dos caldos XYT con cloranfenicol. Incubar el cultivo durante 10 horas a 35 grados centígrados con agitación a 225 a 250 RPM.

Después de 10 horas, amplíe el cultivo, luego inocule 500 microlitros de crecimiento en 500 mililitros de medio y cultive el inóculo durante seis horas con agitación vigorosa después de seis horas. Centrifugar el cultivo bacteriano en 2 frascos de 250 mililitros a 3.100 Gs durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, vuelva a suspender cada pellet en 30 mililitros de solución GTE.

Añadir 500 microlitros de lisozima e incubar las suspensiones en hielo durante 10 minutos. Mientras tanto, prepare una nueva solución de lisis para el siguiente paso. Después de 10 minutos, agregue 60 mililitros de la solución de lisis y mezcle agitando hasta que la solución parezca clara.

Deje que las reacciones vayan a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, agregue 45 mililitros de solución neutralizante a cada botella e invierta las botellas hasta que estén bien mezcladas. Luego póngalos en hielo durante 10 minutos.

Recoja los lisados neutralizados con la centrifugación refrigerada de alta gravedad. A continuación, recoge los sobrenadantes en dos nuevas botellas de 250 mililitros. Agregue 0,6 volúmenes de isopropanol al 100% a cada uno y póngalos en hielo durante 20 minutos.

A continuación, centrifugar los precipitados, luego desechar los sobrenadantes y disolver los gránulos en cinco mililitros de tampón TE. Combine los dos volúmenes en un solo tubo de 50 mililitros y precipite el ARN agregando un volumen igual de cloruro de litio de cinco molares e incubando la mezcla en hielo durante 10 minutos. Utilice una centrifugación en frío de 20 minutos para recoger el precipitado de ARN.

A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 250 mililitros. Agregue dos volúmenes de isopropanol al 100% y coloque el tubo en hielo para que se forme el precipitado de ADN. Después de 20 minutos, centrifugar el precipitado, aspirar el sobrenadante, volver a suspender la pastilla de ADN en 9,5 mililitros de tampón TE y transferir la solución de ADN a un tubo de 50 mililitros.

Continúe la preparación configurando el gradiente de cloruro de cesio con un bromuro de th-dium. Cargue la mezcla en un tubo de polipropileno hermético con una jeringa con una aguja de calibre 18 y selle el tubo. Gire el tubo sellado durante la noche en una ultracentrífuga para formar un gradiente de cloruro de cesio.

Al día siguiente, recoja una banda de ADN del plásmido trasero del gradiente de cloruro de cesio. Use una aguja de calibre 18 para crear una salida de aire en la parte superior del gradiente y una aguja de calibre 20 con una jeringa para recolectar el ADN posterior del lado del gradiente, y luego transfiera la recolección a un tubo de microfuga de 1.7 mililitros. Realizar un lavado, añadir 2,5 volúmenes de butanol saturado de agua y mezclar con vórtice normal.

A continuación, centrifugar la mezcla a temperatura ambiente y transferir la fase acuosa inferior a un nuevo tubo de micro fuga de 1,7 mililitros. Repita este lavado un total de seis veces para eliminar todo el bromuro de etidio. Ahora precipita el ADN posterior.

Añada una décima parte del volumen de acetato de sodio de tres molares y 2,5 volúmenes de etanol al 100% al tubo. Incuba la mezcla en hielo durante 10 minutos. A continuación, centrifugar el precipitado a temperatura ambiente y lavar el pellet de ADN con un mililitro de etanol al 70%.

Repita el giro y recoja la bolita nuevamente. Por último, seque al aire el ADN granulado durante 10 minutos y cúbralo en 200 microlitros de tampón TE. Comience con una digestión enzimática de restricción a gran escala del plásmido trasero con xbo.

Uno en un volumen total de 100 microlitros. Realice esta digestión a 37 grados centígrados durante 12 a 15 horas. A continuación, incube aún más la digestión con 25 unidades adicionales de nucleasa de frijol mungo a 30 grados centígrados durante dos horas.

Después de la incubación, aumente el volumen a 300 microlitros con agua destilada. Ahora realice una extracción de fenol agregando un volumen igual de cloroformo fenol, alcohol isoamílico a la muestra diluida. Vórtice vigorosamente durante un minuto, girando por el tubo y transfiriendo la fase acuosa superior a un nuevo tubo.

A continuación, repita la extracción con cloroformo. A continuación, recupere el ADN linealizado mediante precipitación de etanol. Recoja el pellet de ADN con centrifugación, deseche el sobrenadante y lave el pellet con un mililitro de etanol al 70%.

Repita el paso de centrifugación y seque el pellet al aire. Después de 10 minutos de secado, disuelva el pellet de ADN en 30 microlitros de agua destilada. A continuación, examine un microlitro de la espalda recuperada en un gel de AROS al 0,8%.

A continuación, configure una transcripción de escorrentía de 25 microlitros del ADN posterior linealizado, incluida la UTP tritiada para la cuantificación del ARN. Realice la reacción a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, examine uno o dos microlitros de la reacción de transcripción de escorrentía en un gel 0,6% AROS.

Comience con BHK 21 células cultivadas durante 24 horas en placas de 150 milímetros sembradas con 3 millones de células por placa. Enjuague la monocapa celular con solución fría A y luego sepárelas con tripsina. Ización. Recoja las células por centrifugación a 270 GS durante dos minutos.

A continuación, vuelva a suspender las células en 50 mililitros de solución fría A y vuelva a centrifugarlas. Repita este lavado tres veces después del último lavado. Vuelva a suspender las células a 20 millones por mililitro en la solución A. Luego mezcle una alícuota de 400 microlitros de la suspensión celular con dos microgramos de ARN sintético en una cápsula de dos milímetros.

Electropurar rápidamente la mezcla en condiciones óptimas y dejar reposar las celdas durante 10 minutos. A continuación, transfiera las células a un tubo de microfuga que contenga 600 microlitros de medio de cultivo completo. Ahora prepare una dilución en serie diez veces mayor de las células electroporadas en una placa de volumen de mililitros de 100 alícuotas de microlitros de cada dilución en monocapas de células bhk 21 normales después de cuatro a seis horas de incubación, superponga las células con 0,5%aros en MEM más FBS y cultive durante cuatro días más.

Las células Bhk 21 fueron electroporadas simuladas o electroporadas con transcripciones de ARN derivadas de dos clones independientes del JEV de longitud completa. Cuatro días después, las células se tiñeron con violeta cristalino para ver el ARN infeccioso en las células. Con esta tinción se cuantificaron los focos infecciosos. A continuación, se examinó la expresión de la proteína viral en células electroporadas de ARN 20 horas después de la transfección utilizando anti NS, un suero antis de conejo y un anticuerpo secundario conjugado SI de tres vistos en rojo.

Los núcleos fueron contratiñidos con DAPI visto en azul. Posteriormente, a las 22 y 40 horas después de la transfección, la producción de varianas infecciosas se acumuló en el cultivo. Los sobrenadantes de las células electroporadas de ARN se examinaron mediante ensayos de placa.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo rescatar un virus infeccioso por completo de un CNA clonado de una cepa positiva, ARN, como el virus de la encefalitis japonesa. Así que no olvides que trabajar con el virus de la encefalitis japonesa y otros patógenos humanos puede ser extremadamente peligroso. Es necesario recibir una capacitación adecuada en bioseguridad antes de realizar este procedimiento.