Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca ^{2 +} Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

El objetivo general de este procedimiento es mapear ópticamente simultáneamente el retículo intrasarcoplásmico libre, el calcio y el potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundido LOR aislado intacto. Esto se logra extirpando primero el corazón del conejo y canulando la aorta para la perfusión retrógrada de Lanor. El segundo paso es eliminar la contracción agregando un desacoplamiento de contracción de excitación al perfu ocho.

A continuación, se cambia la perfusión a un circuito de recirculación de pequeño volumen y se añade un indicador de calcio de baja afinidad a temperatura ambiente. Los pasos finales son calentar el corazón a 37 grados centígrados usando el bucle de profusión de gran volumen y agregar el tinte sensible al voltaje. Por lo tanto, durante el experimento, los cambios en el calcio y el potencial transmembrana se miden excitando el corazón con luz azul y midiendo la luz emitida con cámaras CM OS de alta velocidad.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que permite a los investigadores sondear directamente el retículo sarcoplásmico o SR para la dinámica de calcio corto sin interferencia de las señales de calcio transmembrana. Este método también puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con el papel del manejo del calcio SR en la contribución a las arritmias, ya que el potencial transmembrana se registra simultáneamente con el calcio SR, Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las señales ópticas de calcio SR son de muy baja amplitud. Por lo tanto, la carga adecuada del indicador de calcio es esencial Para este protocolo, es necesario tener a mano una solución de tiro recién hecha.

Cuatro litros serán suficientes. No mezcle las soluciones madre concentradas sin diluirlas. También haga que las otras soluciones se preparen de antemano como se indica en el protocolo de texto, burbujee el suministro de neumáticos con 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono, y ajuste el flujo de gas para establecer el pH de la solución muy cerca de 7.4.

La solución debe estar a temperatura ambiente. Prepare el sistema de perfusión de recirculación L andorf colocando un filtro de nylon en línea con poros de 11 micras para filtrar el estado de perfu. Ahora cebe el sistema de profusión principal con aproximadamente dos litros de los tiros oxigenados.

El volumen total de dos litros incluye la solución en el depósito. A continuación, prepare y cebe una línea de profusión corta que evite el depósito de solución para crear un circuito de profusión de recirculación de pequeño volumen para la gripe de las cinco N am. La descarga del volumen total en el sistema de recirculación más pequeño debe ser de unos 150 mililitros.

Para preparar el sistema de monitoreo de presión, conecte un transductor de presión a la línea de profusión y conecte la salida del transductor a un amplificador de puente trans. Ahora encienda el sistema de adquisición de datos. Configúrelo para monitorear continuamente el ECG y la presión de profusión.

A continuación, ajuste la presión de perfusión de referencia a cero milímetros de mercurio. Por último, alinee la cámara de mapeo óptico como se describe en el protocolo de texto. Para empezar, asegure al conejo y anestesiarlo con pentobarbital, junto con un bolo de 1000 unidades de heparina.

Cúbrete los ojos para calmar al conejo. Comience con una incisión en la línea media para exponer el esternón y las costillas con unas tijeras de punta roma. Corta a través del esternón entre el xifoides y el meibum.

A continuación, abra con cuidado el esternón sin dañar el corazón y separe las costillas para exponer el corazón. A continuación, retire rápidamente todo el bloqueo cardíaco-pulmonar cortando todos los vasos y tejidos circundantes. Transfiera el bloqueo cardíaco-pulmonar a aproximadamente 100 mililitros de solución de tiro helada.

En el bloque de tejido extirpado, localice la aorta y corte la aorta ascendente justo proximal a las tres ramas del arco aórtico. A continuación, canula la aorta con la cánula de calibre ocho conectada al sistema de profusión. Asegure la aorta a la cánula con un trozo de sutura de seda cero USP.

Después de asegurar la cánula, diseccione cuidadosamente la tráquea, los pulmones y la grasa epicárdica. A continuación, identifique la válvula mitral y utilice cuidadosamente pinzas afiladas y tijeras para dañar o extraer una valva. Por lo tanto, no puede producirse una congestión de la solución en el ventrículo izquierdo.

Continúe sumergiendo el corazón en la cámara de perfusión horizontalmente con la cara anterior hacia arriba. Coloque la cánula sobre un trozo de sardina. Asegure la cánula con alfileres en forma de U insertados a través del trozo de sarda y en el fondo de silicona de la placa de perfusión.

Esto evitará que el corazón se mueva. Durante la toma de imágenes, se puede usar un pequeño alfiler de insecto para estabilizar el ápice si es necesario, medir la cantidad de solución de tiro utilizada durante la canulación y reemplazarla con una solución fresca para mantener la solución circulante total en dos litros. Ahora sumerja completamente los electrodos de ECG en el baño a ambos lados del corazón, pero no en contacto con el corazón.

A continuación, verifique que esto hace que una derivación normal tenga una morfología de ECG. Mientras tanto, mantenga la presión aórtica en 60 a 70 milímetros de mercurio ajustando el flujo de perfusiones entre 25 y 35 mililitros por minuto. Ahora, apague las luces de la habitación y agregue de 0,3 a 0,6 mililitros de solución de stock de estatinas BLEs al PERFU ocho para una concentración final de 10 a 20 micromolares.

Después de 10 a 15 minutos, las contracciones cardíacas deben detenerse. A continuación, cambie al sistema de profusión de pequeño volumen. Una de las claves para el éxito de las imágenes de calcio SR es la carga adecuada del colorante de flujo cinco Nam.

Esto requiere una perfusión de pequeño volumen para lograr una alta concentración de colorante y condiciones de temperatura ambiente. Para evitar la esterificación D del D en el citosol, prepare 500 microlitros de solución de carga de gripe O cinco N am y mézclela con 500 microlitros de solución para carreteras. Luego agréguelo a los ocho de PERFU.

Deje que la descarga continúe durante 45 minutos y luego encienda el baño de agua circulante para calentar el sistema a 37 grados centígrados. Después de una hora de descarga, vuelva al volumen más grande de Perfu ocho. A continuación, mezcle 50 microlitros del colorante sensible al voltaje RH 2 37 en un mililitro de neumáticos tibios.

Inyecte lentamente esto en el sistema durante unos cinco minutos y proceda con el mapeo óptico del corazón. Para comenzar, enfoque las cámaras de mapeo óptico en el campo apropiado para reducir el movimiento en la superficie PERFU ocho. Coloque un cubreobjetos sobre la solución.

Ahora ajuste el haz de luz LED para proporcionar una iluminación uniforme al corazón. Para cada grabación óptica, establezca el protocolo de ritmo deseado. Encienda la luz de excitación y recopile de uno a cuatro segundos de datos en una o dos horas.

El ruido del tinte filtrado pondrá fin al experimento. A continuación, lave el sistema con agua desionizada. Luego 70%etanol y terminar con otro enjuague de agua desionizada.

Utilizando el protocolo descrito, se puede separar la separación espectral de la señal de potencial transmembrana y el retículo sarcoplásmico o la señal de calcio SR. También se registraron trazas ópticas durante la estimulación continua. A continuación, se construyeron mapas de activación a partir de los datos trazando el tiempo de activación de cada píxel.

En un grafo isócrono, hay un retraso típico de ocho a 10 milisegundos entre las dos señales. Fue posible cuantificar el cambio relativo en la RS diastólica. La carga de calcio y la RS sistólica liberan amplitudes de calcio en varios ciclos de estimulación. Se observó un manejo patológico del calcio SR tras la aplicación del agonista del receptor beta adrenérgico isoproterenol.

Las flechas rojas señalan una clara fuga de calcio del sr. En estas condiciones, puede producirse una activación de potenciales de acción mediada por calcio. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo realizar el mapeo óptico simultáneo del potencial transmembrana y las señales de calcio SR en el corazón de conejo perfundido de Lang Endorf intacto.