Name: Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca 2 + Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprende el mapeo óptico dual del potencial transmembrana y calcio del retículo sarcoplásmico en corazones de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite estudiar la dinámica cardíaca sin interferencias mecánicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (R01 HL 111600) y la Asociación Americana del Corazón (12SDG9010015).

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Davis, y se adhirieron a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicado por los Institutos Nacionales de Salud. 1. Preparación <ol><li> Prepare dos concentrados (25X) los stocks de solución de Tyrode modificada por adelantado y se almacena a 4 ° C: (1) de la I (en mM: NaCl 3205, CaCl2 32,5, KCl 117.5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl2 26.25) y (2) de la II (en mM: NaHCO3 500). <ol><li> Recién preparar la solución de 2 L Tyrode de la siguiente composición (en mM): NaCl 128,2, CaCl 2 1,3, KCl 4,7, MgCl 2 1,05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO3 20 y glucosa 11,1 mediante la combinación de 1840 ml de agua desionizada (DI) agua, 80 ml Stock I, 80 ml de Stock II, y 4 g de glucosa. No mezclar directamente de la I y II de la; añadir elm a 1840 ml DI para evitar la precipitación. </li></ol></li><li> Preparar la solución madre del desacoplador blebbistatin excitación-contracción en 10 mg / ml en anhidro di-metilsulfóxido (DMSO) con antelación y almacenar la solución madre a 4 ° C. </li><li> Preparar soluciones madre de colorantes fluorescentes: (1) RH237 sensibles al voltaje colorante (1 mg / ml en DMSO) y (2) indicador de calcio de baja afinidad Fluo-5N AM (2 mg / ml en DMSO) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Utilice los preparativos de inmediato para evitar la descomposición, con la consiguiente pérdida de capacidad de carga. </li><li> Cebe la recirculación sistema de perfusión Langendorff con oxigenada (95% O 2, 2 5% de CO) solución de Tyrode. Ajustar el flujo de O 2 / CO 2 para mantener el pH de la solución de Tyrode a 7,4 ± 0,05. Utilice un filtro de red en línea de nylon tejido (tamaño de poro: 11 micras) para filtrar continuamente el líquido de perfusión. <ol><li> Cebe el sistema de perfusión a temperatura ambiente, como la posterior loading de Fluo-5N AM se lleva a cabo a temperatura ambiente. Para Fluo-5N AM carga, utilice un pequeño volumen de líquido de perfusión de recirculación (~ 150 ml). Después de colorante de carga, utilizar un volumen mayor de líquido de perfusión (1 - 2 L, véase la Figura 1C). </li></ol></li><li> Encienda el sistema de adquisición de datos y prepararse para la monitorización continua de la presión de ECG y la perfusión. Prepara sistema de presión-vigilancia: Conecte un transductor de presión a la línea de perfusión y monitorear la presión de perfusión con un amplificador transbridge. Ajuste la presión de perfusión basal a 0 mmHg cuando el corazón no está conectado al sistema de perfusión. </li><li> Alinear las cámaras de mapeo óptico para asegurar la alineación espacial entre el V my SR Ca 2 + señales. <ol><li> En primer lugar, se centran las cámaras mediante la colocación de un gobernante o un objeto con el texto en el plato de la perfusión. A su vez las cámaras de mapeo en un modo de visualización en directo y ajustar el enfoque hasta que el texto es nítido y claro. Adquirir una sola imagen Marco de cada cámara. </li><li> Superposiciónestas imágenes y ajustar la transparencia de la imagen de arriba, así que ambas imágenes son visibles. El texto en las imágenes debe superponerse con exactitud. Si no perfectamente alineados, ajustar el ángulo del espejo dicroico o la posición de cada cámara hasta que se alinean las dos imágenes. </li></ol></li></ol> 2. La recolección, perfusión y tinte de carga del corazón de conejo <ol><li> Asegure el conejo en un retenedor de conejo aprobado. Profundamente anestesiar a través de una inyección intravenosa (vena marginal de la oreja) de pentobarbital sódico (50 mg / kg) y heparina (1000 IU). <ol><li> Cuando los conejos pantallas carecen de reflejos nociceptivos, hacer una incisión en la piel en la línea media para exponer el esternón y las costillas. Corte a través del esternón con-contundentes punta tijeras quirúrgicas desde el xifoides al manubrio. Tenga cuidado de no dañar el corazón al abrir el esternón. Difundir las costillas para exponer el corazón. </li><li> Extirpar rápidamente todo el bloque corazón-pulmón cortando rápidamente todos los vasos y tejido conectivo. Immediatamente colocar el bloque corazón-pulmón en solución enfriada con hielo de Tyrode. </li></ol></li><li> Localice la aorta para la perfusión retrógrada. Cortar la aorta ascendente proximal a las tres ramas del cayado aórtico. Canular la aorta a una cánula de 8 G conectado al sistema de perfusión. Use un pedazo de sutura USP 0 seda para asegurar la aorta en la cánula. </li><li> Diseccionar cuidadosamente la tráquea, los pulmones y la grasa epicárdica del corazón. Con un fuerte pinzas y tijeras de disección, localizar la válvula mitral y cuidadosamente dañar o quitar un folleto para evitar la congestión de la solución en el ventrículo izquierdo. </li><li> Sumergir el corazón en la cámara de perfusión con camisa de vidrio horizontalmente con la superficie anterior del corazón hacia arriba para formación de imágenes. Fije la cánula a una pieza de Sylgard con los pernos en forma de U en la parte inferior del plato de silicio para evitar el movimiento del corazón durante el mapeo (Figura 1D). Si lo desea, inserte un alfiler pequeño insecto en el ápice del corazón por stabilización. </li><li> Posición electrocardiograma (ECG) electrodos en el baño en el lado derecho e izquierdo del corazón. Sumergir totalmente los electrodos en el baño y asegurarse de que no están en contacto con la superficie del corazón para proporcionar un ECG volumen realizado análoga a una configuración de derivación I. Verifique un plomo normal, me ECG morfología. Ajuste el flujo (25 - 35 ml / min) para asegurar que la presión aórtica se mantiene a 60 - 70 mmHg. </li><li> Apague las luces de la sala y añadir 0,3 a 0,6 ml de solución madre blebbistatin (paso 1.2) a la perfusión (concentración final 10 a 20 M). <ol><li> Apague las luces de las habitaciones para evitar fotoinactivación de blebbistatin. Si es necesario, un pequeño proyector o faro se pueden usar para proporcionar iluminación de la tarea. Nota: blebbistatin es un inhibidor de la ATPasa de la miosina y un desacoplador excitación-contracción. Debido Fluo-5N carga requiere condiciones prolongados (60 min) RT (hipotermia) (consulte los pasos 2,8 - 2,10), la producción de energía cardiaca podría estar comprometida. Therefore, la adición de blebbistatin en el perfundido antes de colorante de carga puede reducir la demanda de energía 16 y eliminar los artefactos de movimiento durante las grabaciones ópticas posteriores 17. </li></ol></li><li> Cuando la contracción del corazón ha cesado (10 - 15 min, verificado en el registro de la presión aórtica), cambiar al sistema de perfusión de recirculación de pequeño volumen (vea el paso 1.4.1). </li><li> Preparar y cargar solución de carga Fluo-5N AM: Añadir 0,25 ml de Fluo-5N AM solución madre (paso 1.3) a 0,25 ml cálida 20% F127 Pluronic. Añadir 0,5 ml de solución caliente de Tyrode a la mezcla, mezclar bien y agregar al sistema de perfusión de recirculación de pequeño volumen. </li><li> Monitorear continuamente la presión de perfusión y ECG y ajustar el flujo si es necesario. Colorante de carga dura aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. 45 min después de la carga ha comenzado, encienda el baño de agua circulante para comenzar a calentar el sistema de perfusión y la perfusión a 37 ° C. </li><li> Después de 60 minutos de Fluo-5N AM carga, switch la perfusión para el sistema de perfusión recirculante volumen más grande (véase el paso 1.4). </li><li> Diluir 50 l de solución de colorante sensible al voltaje de la RH237 (etapa 1.3) en 1 ml de solución caliente de Tyrode y se añade lentamente (más de ~ 5 min) en un puerto de inyección proximal a la cánula. </li></ol> 3. Mapeo óptico <ol><li> Durante los momentos finales de colorante de carga, coloque el corazón y el enfoque de las cámaras de mapeo óptico para asegurar el campo apropiado de vista para el experimento. </li><li> Si lo desea, coloque un electrodo de estimulación bipolar en la superficie epicárdica del corazón para la estimulación. </li><li> Coloque un plástico o de vidrio cubierta de resbalón en la superficie de la cámara de perfusión para reducir los artefactos de movimiento en la superficie del líquido que puede estar presente debido a la recirculación del líquido de perfusión. Nota: Como alternativa a una hoja de cubierta, utilice una cubierta de plástico de cocina limpio 50 mm Petri. </li><li> Centrarse las guías de luz para iluminar uniformemente la superficie del corazón con el correoluz xcitation. Utilice azul diodo emisor de luz (LED) fuentes de luz y filtrar aún más la luz con un 475 a 495 nm filtro de banda (Figura 1). </li><li> Recoger fluorescencia emitida con un macroscopio y dos de metal-óxido-semiconductor (CMOS) cámaras de mapeo óptico complementarias. Dividir la luz emitida con un espejo dicroico a 545 nm. <ol><li> -Pass largo filtrar la fracción de longitud de onda más larga, que contiene la señal m V, a 700 nm. De paso de banda filtrar la fracción de longitud de onda más corta, que contiene la señal SR Ca 2 +, 502 a 534 nm (Figura 1A). Ajuste la frecuencia de adquisición de datos ópticos de 0,5 a 1 kHz. </li></ol></li><li> Para cada grabación óptica, primero iniciar el protocolo de estimulación deseada, encender la luz de excitación, y recoger 1-4 seg de datos. Si lo desea, sincronizar el protocolos de estimulación y adquisición de datos. Nota: No es posible volver a cargar el Fluo-5N AM, por lo tanto la relación señal a ruido (SNR) se decreaSE lo largo del experimento debido a teñir fuga de la SR. Limite protocolo experimental a 1 - 2 horas para asegurar altos valores de SNR. </li><li> Tras el experimento, lavar el sistema de perfusión en la secuencia de agua DI, 70% de alcohol reactivo, y nuevamente con agua DI. </li><li> Filtra cada conjunto de datos con un filtro gaussiano espacial (radio de 3 píxeles) utilizando paquetes de software disponibles comercialmente de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Si es necesario, espacialmente alinear el V my SR conjuntos de datos Ca 2+. Como en el paso 1.6, superponer imágenes de cada cámara y verificar que las estructuras anatómicas del corazón (es decir., Vasculatura coronaria, bordes de las aurículas o ventrículos) u otros artículos en el campo de visión (es decir, la cánula, el electrodo de estimulación) exactamente solapamiento. Si no, la alineación espacial de los conjuntos de datos es necesario. </li><li> Cambie la imagen transparente superior se logra en las direcciones x e y-dirección hasta que la superposición exacta, tomando nota del número de píxelesla imagen debe ser desplazado en cada dirección. Todo el conjunto de datos correspondiente a la parte superior de la imagen (ya sea V m o SR Ca 2+) debe entonces ser desplazado por el número determinado de píxeles en cada dirección para asegurar la alineación precisa entre el V y m SR Ca 2+ conjuntos de datos. </li></ol>

<ol><li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22tissues.+Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells.</a> tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circulation research. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optical+mapping+of+the+Langendorff-perfused+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).</li>
<li>Kong, W., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dye+affinity+in+optical+measurements+of+Cai%282%2B%29+transients+in+cardiac+muscle.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBers%2C+DM+%22Excitation-Contraction+Coupling+and+Cardiac+Contractile+Force%22">Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force</a>. , 2nd edn, Kluwer Academic. (2001).</li>
<li>Bers, D. M., Shannon, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+movements+inside+the+sarcoplasmic+reticulum+of+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).</li>
<li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+roles+of+calsequestrin+and+triadin+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle.</a> The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+calsequestrin+regulation+of+single+cardiac+ryanodine+receptor+in+normal+and+pathological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions.</a> The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).</li>
<li>Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuation+is+the+key+to+cardiac+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans.</a> Circulation research. 94, 650-656 (2004).</li>
<li>Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+scraps%3A+local+depletions+of+free+%5BCa2%2B%5D+in+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+during+contractions+leave+substantial+Ca2%2B+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve.</a> Circulation research. 93, 40-45 (2003).</li>
<li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+Ca%282%2B%29+content+regulates+intracellular+Ca%282%2B%29+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts%3A+effect+of+exogenous+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).</li>
<li>Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+alternans+do+not+rely+on+diastolic+sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations.</a> Circulation research. 99, 740-748 (2006).</li>
<li>Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractoriness+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+determines+Ca2%2B+alternans+in+atrial+myocytes.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+in+the+intact+heart%3A+ryanodine+receptor+refractoriness+during+alternans+and+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation.</a> Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).</li>
<li>Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R. 3rd, Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+Changes+During+Hypoxia%2C+Ischemia%2C+and+Increased+Work+Differ+Between+Isolated+Heart+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).</li>
<li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+rhythm+%3A+the+official+journal+of+the+Heart+Rhythm+Society%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).</li>
<li>Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+beta-adrenergic+stimulation+overcomes+source-sink+mismatch+to+generate+focal+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia.</a> Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).</li>
<li>Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+proteins+and+heart+failure%3A+mechanisms+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).</li>
<li>Cutler, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+ATPase+2a+gene+delivery+to+restore+electrical+stability+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart.</a> Circulation. 126, 2095-2104 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Las claves del éxito Fluo-5N colorante de carga son la configuración de perfusión de recirculación de pequeño volumen, lo que permite una alta concentración Fluo-5N sin la necesidad de grandes cantidades de colorante, la longitud de tiempo de carga (1 hr), y la realización de la carga a TA. Si la carga se realiza a temperaturas fisiológicas, la actividad enzimática celular rápidamente escinde la etiqueta -AM cuando el colorante atraviesa la membrana celular, atrapando las moléculas de colorante en el citosol y no lo que...

El mapeo óptico dual del Ca2+ intracelular y el potencial transmembrana (Vm) en el corazón intacto perfundido por Langendorff se ha convertido en un pilar de las investigaciones en electrofisiología cardíaca, incluidos los mecanismos de arritmia y el acoplamiento excitación-contracción1-4. Este enfoque ha proporcionado un conocimiento sin precedentes sobre la electrofisiología normal y anormal y, lo que es más importante, sobre la relación bidireccional entre Vm y Ca2+ intracelular. Sin embargo, el mapeo óptico de Ca2+ intracelular con indicadores fluorescentes de alta afinidad (como Rhod-2 y Fluo-4) solo informa sobre cambios masivos en Ca2+ intracelular y no puede distinguir si estos cambios se deben al flujo, liberación y recaptación de Ca2+ transmembrana en las reservas intracelulares o, en la mayoría de los casos, a alguna combinación de ambos. Además, los indicadores de Ca2+ de alta afinidad tienen una cinética de encendido y apagado lenta y es posible que no informen con precisión de cambios rápidos en la concentración de Ca2+ 5.
Cada potencial de acción desencadena un aumento en el Ca2+ intracelular, conocido como el Ca2+ transitorio intracelular (CaT). En el corazón de los mamíferos, aproximadamente el 70-90% del CaT total se debe a la liberación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico (SR) a través de la apertura de los receptores de rianodina (RyRs)6. Dentro de la RS, aproximadamente la mitad del total de Ca2+ se une a la calsecuestrina (CSQ) y otros tampones intra-SR7, que desempeñan un papel importante en la homeostasis de la SR Ca2+ 8,9. La cantidad de SR Ca2+ libre dicta la fuerza impulsora para la liberación de SR Ca2+, así como la activación de RyR y, por lo tanto, tiene un impacto significativo en el CaT intracelular. Además, las alteraciones en la liberación o recaptación de SR Ca2+ pueden, a su vez, afectar a Vm a través del intercambio electrogénico Na+-Ca2+, lo que puede tener consecuencias arritmogénicas. Por lo tanto, además de la CaT, la monitorización de SR Ca2+ libre puede proporcionar información importante sobre la disfunción contráctil y electrofisiológica.
En los últimos años, los investigadores han logrado avances significativos en la monitorización de SR Ca2+ en miocitos cardíacos aislados y desde una sola ubicación en el corazón intacto. Uno de estos métodos requiere pulsos rápidos de cafeína para abrir RyRs y el contenido de SR Ca2+ se infiere o calcula a partir del aumento inmediato de Ca2+10 intracelular. Otro enfoque intrigante utiliza indicadores de Ca2+ de baja afinidad, como Fluo-5N11 o Mag-Fluo412, que se unen a SR Ca2+ libre. Estos indicadores tienen constantes de disociación (Kd) en el rango de 10 a 400 μM y, por lo tanto, exhiben una fluorescencia mínima en el citosol en comparación con el lumen SR, donde la concentración de Ca2+ ([Ca2+]SR) está en el rango milimolar. Utilizando indicadores de Ca2+ de baja afinidad, se han investigado varios aspectos del ciclo de Ca2+ de SR a nivel del miocito aislado, incluida la liberación fraccional de Ca2+ de SR y los mecanismos de alternancia de Ca2+ 13,14. Sin embargo, para comprender completamente la naturaleza heterogénea del ciclo de SR Ca2+ en el corazón intacto y el papel de SR Ca2+ en fenómenos arrítmicos espacialmente distintos, se requieren métodos para obtener imágenes de SR Ca2+ a través de la superficie epicárdica del corazón intacto15.
Este artículo describe la metodología para el mapeo óptico dual de SR Ca2+ y Vm libres en el corazón de conejo intacto perfundido por Langendorff con el indicador de Ca2+ de baja afinidad Fluo-5N. Además de revelar las características de SR Ca2+ espacialmente a través de la superficie epicárdica del corazón, este enfoque tiene la ventaja de la monitorización simultánea de Vm, lo que permite investigar la relación bidireccional entre Vm y SR Ca2+.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td>Componente de la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Componente de la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td>Componente de la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>Componente de la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>Componente de la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>Componente de la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td>Componente de la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td><td>AirGas</td><td>carbógeno</td><td>Para la oxigenación y el pH de la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td>Desacoplador de excitación-contracción</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>Colorante sensible al voltaje</td></tr><tr><td>Fluo-5N AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-26915</td><td>Indicador Ca2+ de baja afinidad; Alternativa: Invitrogen F-14204; La carga debe realizarse a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td>Para la carga del indicador Ca2+; Calentar hasta que la solución esté clara antes de usar</td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetilo (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Para disolver blebbistatina y colorantes</td></tr><tr><td>Filtro</td><td>EMD Millipore</td><td>NY1104700</td><td>11 &#956; m filtro en línea</td></tr><tr><td>Transductor de presión</td><td>WPI</td><td>BLPR2</td><td>Para medir la presión de perfusión</td></tr><tr><td>Transbridge Transductor Amplificador</td><td>WPI</td><td>SYS-TBM4M</td><td>Para transducir/amplificar la señal de presión; PowerLab también se puede utilizar con los instrumentos BioAmp</td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td>ADInstruments</td><td></td> adecuados <td>para el registro continuo de señales de presión y ECG</td></tr><tr><td>THT Macroscope</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Configuración óptica macroscópica. Detalles: Objetivo 0,63X (NA = 0,31), objetivo de condensación 2X, campo de visión resultante = 3,1 cm x 3,1 cm, profundidad de enfoque = ~ 1,5 mm</td></tr><tr><td>MiCam Ultima-L CMOS</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Cámaras de mapeo óptico</td></tr><tr><td>Precision LED Spot Light Mightex</td><td></td><td>PLS-0470-030-15-S</td><td>Fuente de luz LED</td></tr></tbody></table>

mapeo óptico de intra-retículo sarcoplásmico ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos langendorff

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

< clase p = 'jove_content'>El manejo del retículo sarcoplasmático (SR) Ca2+ juega un papel clave en el acoplamiento normal de excitación-contracción y se sabe que el manejo aberrante de SRCa 2+ juega un papel importante en ciertos tipos de arritmia. Debido a que las arritmias son fenómenos emergentes espacialmente distintos, deben investigarse a nivel tisular. Sin embargo, los métodos para sondear directamente SR Ca2+ en el corazón intacto siguen siendo limitados. Este artículo describe el protocolo para el mapeo óptico dual del potencial transmembrana (Vm) y el intra-SR libre [Ca2+] ([Ca2+]SR) en el corazón de conejo perfundido por Langendorff. Este enfoque aprovecha el indicador de Ca2+ de baja afinidad Fluo-5N, que tiene una fluorescencia mínima en el citosol donde el [Ca2+] ([Ca2+]i intracelular) es relativamente bajo, pero exhibe una fluorescencia significativa en el lumen SR donde [Ca2+]SR está en el rango milimolar. Además de revelar las características espaciales de SR Ca2+ a través de la superficie epicárdica del corazón, este enfoque tiene la clara ventaja de la monitorización simultánea de Vm, lo que permite investigar la relación bidireccional entre Vm y SR Ca2+ y el papel de SR Ca2+ en los fenómenos arritmogénicos.

La figura 1A muestra un diagrama esquemático de la configuración óptica para la doble V m y SR Ca 2+ mapeo. Con esta configuración, no hay separación espectral completa de la V my SR Ca 2 + señales (Figura 1B). Un diagrama del sistema de perfusión de doble bucle utilizado para Fluo-5N colorante de carga se ilustra en la Figura 1C. Figura 1D muestra la orientación horizontal del corazón en el plato de perfusión...

En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto.

Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

El objetivo general de este procedimiento es mapear simultáneamente de forma óptica el calcio libre en el retículo sarcoplásmico y el potencial transmembranal en el corazón de conejo aislado y perfundido intacto mediante LOR. Esto se logra primero mediante la extirpación del corazón de conejo y la cánulación de la aorta para la perfusión retrograda con LOR. El segundo paso consiste en eliminar la contracción mediante la adición de un agente desacoplador de la excitación y la contracción a la perfusión.A continuación, la perfusión se cambia a un circuito recirculante de pequeño volumen y se añade un indicador de calcio de baja afinidad a temperatura ambiente. Los pasos finales consisten en calentar el corazón hasta 37 grados Celsius utilizando el circuito de perfusión de gran volumen y añadir el colorante sensible al voltaje. Así, durante el experimento, los cambios en el calcio y en el potencial transmembrana se miden excitando el corazón con luz azul y registrando la luz emitida mediante cámaras CMOS de alta velocidad.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que permite a los investigadores sondear directamente el retículo sarcoplasmático, o RS, para

optical-mapping-intra-sarcoplasmic-reticulum-ca2-transmembrane

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe una técnica de alta resolución temporal y espacial de la imagen ópticamente movimiento de acción potencial en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos con un tinte potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

Este informe proporciona una descripción detallada de la metodología y los resultados del mapeo simultáneo óptico endocárdico y epicárdico de excitación eléctrica de la aurícula izquierda intacta de un corazón de oveja Langendorff perfundidos durante el estiramiento inducido por fibrilación auricular.

Cartografía de alta resolución óptica endocárdicos y epicárdicos en un modelo de ovejas inducidas por el estiramiento de la fibrilación auricular

En este artículo se describen los procedimientos básicos para la realización de experimentos ópticos de asignación en el corazón de conejo Langendorff perfundidos con el sistema de imágenes panorámicas, y el doble (voltaje y calcio) modalidad de imagen.

Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos

Este documento detalla el procedimiento de disección, la configuración instrumental y las condiciones experimentales durante el mapeo óptico del potencial de membrana (Vm) y el calcio intracelular transitoria (CAT) en Langendorff perfundidos aislados intactos los corazones de ratón.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

A continuación, se presenta un protocolo para el mapeo óptico de la actividad eléctrica de la aurícula derecha del ratón y, especialmente, el nodo sinoauricular, con una resolución espacial y temporal alta.

-Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón

Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de atria murino utilizando un sistema de mapeo óptico con una alta resolución espacial y temporal, incluyendo grabaciones duales de la tensión de la membrana y Ca2 + transitoria bajo programado estimulación a través de un catéter electrodo especializados.

Evaluación electrofisiológica de Atria murino con mapeo óptico alta resolución

Presentamos la metodología para el aislamiento de miocitos murinos y cómo obtener trazas de voltaje o calcio simultáneamente con rastros de acortamiento de sarcomere utilizando fotometría de fluorescencia con mediciones simultáneas de geometría celular digital.

Imágenes ópticas de miocitos ventriculares murinos aislados

El objetivo de este estudio fue establecer un método para investigar la dinámica cardíaca utilizando un modelo animal traslacional. El enfoque experimental descrito incorpora optocardiografía de doble emisión junto con un estudio electrofisiológico para evaluar la actividad eléctrica en un modelo de corazón porcino aislado e intacto.

Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff

Este protocolo describe el procedimiento para secimiento y cultivo de rebanadas cardíacas humanas para pruebas de fármacos preclínicos y detalla el uso de mapeo óptico para registrar el voltaje transmembrano y las señales de calcio intracelular simultáneamente a partir de estas rebanadas.

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Este protocolo introduce el mapeo óptico de doble colorante de corazones de ratón obtenidos de animales de tipo salvaje y knock-in afectados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluyendo mediciones electrofisiológicas de voltaje transmembrana y transitorios intracelulares de Ca2+ con alta resolución temporal y espacial.

Mapeo óptico de doble colorante de corazones a partir de ratones knock-in RyR2R2474S de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica

Aprende el mapeo óptico dual del potencial transmembrana y calcio del retículo sarcoplásmico en corazones de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite estudiar la dinámica cardíaca sin interferencias mecánicas.

Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca

Explorar más videos