Ensayo de reclutamiento de células de pulmón Tumor
26 de febrero de 2019
Este manuscrito describe un método para cuantificar la acumulación de células de tumor en los pulmones en un modelo animal de metástasis del tumor.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología tumoral sobre los mecanismos moleculares de la metástasis. La principal ventaja de esta técnica es que el reclutamiento de células tumorales dentro de un órgano remoto puede ser la cantidad. Comience por usar un reactivo de disociación celular no enzimática para eliminar las células de carcinoma pulmonar Lewis que expresan proteínas fluorescentes, o LLC, de su recipiente de cultivo de acuerdo con los protocolos estándar.
Transfiera la solución celular resultante a un tubo cónico de 15 mililitros antes de la centrifugación, y centrifugar los pellets dos veces en cinco mililitros de PBS por lavado. Después del segundo lavado, filtre las células a través de un colador de células de poro de 40 micrómetros y diluya la suspensión a una de cada 10 a las seis células por concentración de mililitro. Luego cargue las células en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja del calibre 29 e inyecte 100 microlitros de células en la vena de la cola de cada ratón macho de ocho a 10 semanas de edad, C57-Negro-6.
En el punto final experimental adecuado, utilice tijeras para extraer la piel de la superficie ventral de cada ratón, y corte las costillas y el diafragma para exponer la cavidad torácica. Utilice una aguja de infusión alada de 25 calibres y un tubo para lavar 15 mililitros de PBS a través del ventrículo derecho, y retire el corazón y el timo. Agarrar la tráquea con fórceps, tirar hacia arriba, diseccionar los tejidos conectivos alrededor de la tráquea, para cosechar los pulmones.
Luego lave los pulmones en PBS y desprenda un lóbulo para la visualización de las células fluorescentes in situ bajo un microscopio de fluorescencia. Para digerir el tejido pulmonar, primero corta el lóbulo caudal con tijeras y coloca las piezas pulmonares en una jeringa de 10 mililitros. Cierre la jeringa con el émbolo y aspire cinco mililitros de solución de digestión en la jeringa, moviendo el émbolo dentro y fuera del eje de la jeringa hasta que el tejido pulmonar se disefunda a lo largo de la solución.
Dispensar la suspensión pulmonar en un tubo de 50 mililitros, y digerir el tejido en una coctelera recíproca durante 15 minutos a 37 grados Celsius y 150 rpm. Al final de la incubación, triturar el tejido restante hasta que las células pulmonares estén completamente dispersas, y devolver el tubo al agitador durante 30 minutos adicionales. Luego filtra las células a través de un colador de poro de 40 micrómetros, y recoge las células por centrifugación.
Para analizar las células pulmonares aisladas por citometría de flujo, resuspendir el pellet en dos mililitros de tólus de células sanguíneas rojas tampón durante un minuto a temperatura ambiente, y recoger las células por centrifugación. A continuación, centrifugar el pellet dos veces en cinco mililitros de PBS fresco complementado con 1%albúmina sérica bovina por lavado. Después de la segunda centrifugación, resuspender el pellet en un mililitro de PBS fresco más BSA, y filtrar las células a través de un nuevo colador de poro de 40 micrómetros para la cuantificación de las células tumorales por citometría de flujo.
Los pulmones presentan muchas células GFP-LLC dos horas después de la inyección, con la gran mayoría de las células desapareciendo de los pulmones dentro de las 24 horas. Tenga en cuenta que los puntos fluorescentes que se detectan dentro del filtro rojo deben excluirse del recuento de celdas. Para confirmar el número de GFP-LLC en los pulmones, uno de los lóbulos se puede utilizar para el análisis citométrico de flujo como se demuestra.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que un procedimiento de sección congelada es un método más preciso para observar la ubicación exacta de las células tumorales.
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Descripción general
Este manuscrito describe un método para cuantificar la acumulación de células tumorales en los pulmones en un modelo animal de metástasis tumoral. Esta técnica permite la cuantificación del reclutamiento de células tumorales dentro de un órgano distante, proporcionando información sobre los mecanismos moleculares de la metástasis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Biología celular
Antecedentes
- Comprender la metástasis tumoral es fundamental para la investigación del cáncer.
- La cuantificación de la acumulación de células tumorales puede revelar información biológica importante.
- El uso de modelos animales es común en el estudio de la progresión del cáncer.
- Las células que expresan proteínas fluorescentes facilitan el seguimiento y la cuantificación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para cuantificar la acumulación de células tumorales en los pulmones.
- Investigar el reclutamiento de células tumorales en un modelo metastásico.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la metástasis.
Métodos Utilizados
- Uso de un reactivo de disociación celular no enzimático.
- Centrifugación y lavado de los pellet celulares en PBS.
- Filtración de células a través de un filtro celular de 40 micrómetros de poro.
- Inyección de la suspensión celular diluida en la vena de la cola de ratones.
Resultados principales
- El método permite una cuantificación efectiva de la acumulación de células tumorales.
- Demostró la viabilidad de rastrear células tumorales in vivo.
- Proporcionó información sobre la dinámica del reclutamiento de células tumorales.
- Contribuyó al entendimiento de los procesos metastásicos.
Conclusiones
- Este método es una herramienta valiosa para estudiar la biología tumoral.
- Mejora la capacidad de investigar la metástasis en modelos animales.
- Estudios futuros pueden basarse en esta técnica para explorar dianas terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo permite la evaluación cuantitativa del reclutamiento de células tumorales a órganos distantes, lo que apoya la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento de fármacos dirigidos a la metástasis. Al omitir los pasos de invasión del tumor primario, se centra en las interacciones estromales y los eventos de extravasación críticos para la validación preclínica de dianas. El método proporciona una lectura reproducible y escalable para evaluar compuestos antimetastásicos in vivo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas sobre las contribuciones del estroma a la metástasis en órganos distantes.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas al cuantificar la acumulación de células tumorales en los pulmones tras la inyección.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al medir los efectos del compuesto sobre la dinámica de reclutamiento de células tumorales.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Produce salidas cuantitativas estandarizadas mediante citometría de flujo para campañas de cribado de compuestos.
- Reproducibilidad: Utiliza concentraciones definidas de células y volúmenes de inyección para garantizar un modelado consistente de metástasis.
- Escalabilidad: Compatible con procesamiento de múltiples pocillos y análisis de alto contenido para la reducción de riesgos del blanco.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela micrometástasis pulmonares para estudiar los mecanismos de colonización órgano-específica.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos de descubrimiento con la validación preclínica de agentes anti-metastásicos.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Proporciona criterios de avance o detención basados en la reducción del número de células tumorales marcadas.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
Posiciones dentro del continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la optimización de compuestos líderes, que permiten la evaluación cuantitativa de compuestos que modulan la metástasis.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la investigación mecanicista de las interacciones entre tumor y estroma en nichos metastásicos.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas basadas en fluorescencia para la validación de resultados positivos en ensayos de metástasis.
- Análisis: Genera datos cuantificables de células tumorales mediante citometría de flujo para análisis de respuesta a la dosis y análisis estadístico.
- Investigación Traducional: Se alinea con estrategias de biomarcadores mediante el seguimiento de la diseminación de células marcadas in vivo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudios cruzados de mecanismos de metástasis.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en las vías de metástasis mediante la cuantificación del reclutamiento específico por órganos.
- Valor operativo: Estandariza la administración de células tumorales y el procesamiento de tejidos para permitir comparaciones reproducibles entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en terapéuticas dirigidas a la metástasis.
- Impacto en la cartera: Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos preclínicos de supresión de metástasis.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de inyección intravenosa en la cola de ratón y disociación de tejidos.
- Depende de instrumentación de citometría de flujo y controles de compensación de fluorescencia.
- Necesita protocolos estandarizados de preparación de células entre diferentes grupos de investigación.
- Implica la optimización de la dosis celular para evitar señales confusas derivadas de una acumulación excesiva en el pulmón.
- Se limita a la cuantificación de la acumulación pulmonar; no captura la invasión del tumor primario ni el crecimiento metastásico posterior.
