Name: Ensayo de reclutamiento de células de pulmón Tumor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 28 s
Description: Aprende a cuantificar la acumulación de células tumorales en pulmones mediante un ensayo de reclutamiento en modelo animal. Esta técnica permite estudiar los mecanismos moleculares de la metástasis en cáncer.

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Todos los procedimientos realizados con ratones fueron aprobados por la Universidad de medicina Animal investigación Comité de Tokio de las mujeres.
1 inyección en la vena cola de pulmón de Lewis (LLC) células
<ol><li>Mantener las células de la LLC en DMEM suplementado con 10% FCS, en humidificado 5% CO2 incubadora a 37 ° C. Células deben contener un sistema de expresión de la proteína fluorescente (p. ej., GFP).</li>
	<li>Eliminar las células de la placa de cultivo mediante el uso de un reactivo de disociación no enzimática de la célula. Seguir el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Recoger las células en un tubo de 15 mL y centrifugar a 400 x g por 3 minutos resuspender las células en 5 mL de PBS por pipeteo y centrifugue el tubo (400 g de x, 3 min). A continuación, eliminar el sobrenadante.<ol>
<li>Repita este paso de lavado una vez más.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después del segundo lavado, pasar las células a través de un tamiz celular (tamaño de poro de 40 μm) y resuspender en PBS a una densidad celular final de 1 x 106 células/mL.</li>
	<li>Inyectar 0.1 mL de la suspensión celular (1 x 105 células, aguja 29 G) en cada ratón C57BL/6 (varones 8-10 semanas de edad) a través de la vena de la cola.</li>
</ol>2. aislamiento de los pulmones y contar las células bajo un estereomicroscopio de fluorescencia
<ol><li>Eutanasia a los ratones por la inhalación de CO2 .</li>
	<li>Retirar la piel en la cara ventral del tórax con tijeras. Luego, corte las costillas y el diafragma para exponer la cavidad torácica. Ras PBS (100 cmH2O, total 15 mL) a través del ventrículo derecho con una aguja de 25 G de infusión alado y tubería.</li>
	<li>Cortar el corazón y el timo. Agarre la tráquea con el fórceps y tire hacia arriba, los tejidos conectivos alrededor de tráquea de disección con tijeras. Diseccionar a los pulmones y lavar en PBS.</li>
	<li>Separe cada lóbulo y observar bajo un estereomicroscopio de fluorescencia.</li>
</ol>3. pulmón digestión
<ol><li>Disolver 10 mg de colagenasa, 10 mg de dispase y 10 μg de DNasa en 10 mL de DMEM libre de suero. Filtrar con un filtro de jeringa de 0,22 μm para preparar la solución de digestión enzimática.</li>
	<li>Dados el lóbulo caudal aislado con unas tijeras. Coloque los pedazos de pulmón en una jeringa de 10 mL, seguida por el émbolo.</li>
	<li>Aspirar la solución de digestión (5 mL) en la jeringuilla tirando del émbolo. Funcionar el émbolo hacia arriba y hacia abajo hasta que el pulmón se hunde en la solución. Luego, coloque el buffer de digestión y pulmón en un tubo de 50 mL.</li>
	<li>Agitar el tubo durante 15 min a 37 ° C en un agitador recíproco (150 rpm). Los pulmones pueden ser rota durante la incubación.</li>
	<li>Pipetee hacia arriba y hacia abajo hasta que las células del pulmón se dispersan totalmente. Agite el tubo adicional 30 min a 37 ° C en un agitador recíproco (150 rpm).</li>
	<li>Pasar las células pulmonares a través de un tamiz de célula 40 μm. Desactivación de las células a 400 x g durante 3 minutos.</li>
</ol>4. flujo Cytometry de pulmón de células
<ol><li>Disolver 100 mg de BSA en 10 mL de PBS y el filtro a través de un filtro de jeringa 0,22 μm prepararse PBS - 1% de BSA.</li>
	<li>Retire el sobrenadante de la muestra obtenida en el paso 3.6 con una pipeta y añadir 2 mL de solución de lisis de glóbulos rojos. Entonces, giro de las células a 400 x g durante 3 min descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 5 mL de PBS - 1% de BSA mediante pipeteo y centrifugue el tubo (400 g de x, 3 min). Deseche el sobrenadante.<ol>
<li>Repita este paso de lavado una vez más.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suspender las células en 1 mL de PBS - 1% de BSA y pasar por un colador de celular nuevo de 40 μm.</li>
	<li>Analizar las células con un citómetro de flujo para contar las células tumorales (usando filtro instalación FL1 de GFP-LLC).</li>
</ol>

<ol><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Kaplan, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR1-positive+haematopoietic+bone+marrow+progenitors+initiate+the+pre-metastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche.</a> Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).</li>
<li>Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-mediated+upregulation+of+chemoattractants+and+recruitment+of+myeloid+cells+predetermines+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis.</a> Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).</li>
<li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+S100A8-serum+amyloid+A3-TLR4+paracrine+cascade+establishes+a+pre-metastatic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase.</a> Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalance+of+Clara+cell-mediated+homeostatic+inflammation+is+involved+in+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis.</a> Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).</li>
<li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+amyloid+A3+binds+MD-2+to+activate+p38+and+NF-%CE%BAB+pathways+in+a+MyD88-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).</li>
<li>Erler, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+lysyl+oxidase+is+a+critical+mediator+of+bone+marrow+cell+recruitment+to+form+the+premetastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche.</a> Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+vascular+destabilization+in+the+premetastatic+phase+facilitates+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis.</a> Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).</li>
<li>Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pre-metastatic+niche%3A+finding+common+ground%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The pre-metastatic niche: finding common ground.</a> Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).</li>
<li>Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+circulating+tumor+cells+in+breast+cancer%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast%22%5BJournal%5D)">The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review.</a> The Breast. 23, 552-560 (2014).</li>
<li>Wolf, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+CCR2+signaling+induced+by+colon+carcinoma+cells+enables+extravasation+via+the+JAK2-Stat5+and+p38MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway.</a> Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).</li>
<li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+tumours+modulate+innate+immune+signalling+to+create+pre-metastatic+vascular+hyperpermeability+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci.</a> Nature Communications. 4, 1853(2013).</li>
<li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eritoran+inhibits+S100A8-mediated+TLR4%2FMD-2+activation+and+tumor+growth+by+changing+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment.</a> Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).</li>
<li>Ieguchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM12-cleaved+ephrin-A1+contributes+to+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis.</a> Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Pretratamiento de ratones con anticuerpos, medicamentos, una dieta alta en grasas o medio condicionado por el tumor antes de la inyección de células de tumor es posible. El paso más difícil en este análisis es la inyección de la vena de la cola. Inyección incompleta da lugar a datos no concluyentes. La vena de la cola en C57BL/6 es particularmente difícil de identificar, dando por resultado las inyecciones fallidas. Colocando el ratón sobre una almohadilla de calefacción (37 ° C) ayuda a dilatar la vena de la cola para q...

Metástasis del tumor responsable de alta mortalidad en enfermedades relacionadas con el cáncer. Desde el punto de vista de las investigaciones a nivel molecular, la metástasis se puede dividir en varios pasos: iniciación del tumor en el sitio del tumor primario, el crecimiento del tumor primario e invasión en alrededor de los tejidos, intravasación, circulación a través de los vasos sanguíneos , extravasación en órganos distantes y re-crecimiento del tumor. Cada paso implica diferentes conjuntos de moléculas/señales1.
Estudios hasta la fecha han estado preocupados con los eventos que ocurren en órganos distantes antes las células tumorales circulantes en la sangre, que también es conocida como la fase pre-metastásica2,3,4,5, 6. Nuestros estudios con ratones modelo revelaron que la fase pre-metastásica facilita la metástasis del pulmón mediante la creación de larga duración y bajo nivel de las respuestas inflamatorias en los pulmones. La fase pre-metastásica se caracteriza por hiperpermeabilidad de themicrovasculature y reclutamiento de células de la médula ósea derivada (BMDC), upregulation de citoquinas/quimioquinas-como moléculas incluyendo S100A8 y SAA33,4 . Se ha divulgado que esa lisil oxidasa modifica la matriz extracelular en los pulmones para reclutar BMDCs7. Otro informe ha revelado la importancia de Angpt2, MMP3 y MMP10 en la fase pre-metastásica8. En otras palabras, las intrincadas interacciones entre tumores primarios, médula ósea y órganos remotos necesitan ser comprendidos y modulada correctamente (por ejemplo, mediante el uso de fármacos que atacan las proteínas implicadas en estas interacciones) para evitar futuras metástasis9 . Para regular la fase pre-metastásica, debe primero visualizar y evaluar las intervenciones diagnósticas o terapéuticas. Aquí, Divulgamos un ensayo de reclutamiento de células de tumor de pulmón que permite el estudio de la fase pre-metastásico en los pulmones.
Las células del tumor inyectadas directamente en el vaso sanguíneo del ratón son similares a circulación las células del tumor en pacientes con cáncer, aunque puede haber diferencias entre las células cultivadas y células tumorales circulantes. Células tumorales circulantes se experimentan algunos cambios característicos cuando entran en circulación desde el tumor primario. Sin embargo, las células cultivadas pueden formar tumores en ratones inmunodeficientes cuando se inyectan en la vena de la cola. Además, en el sistema de modelo de ratón, fluorescencia marcada de las células del tumor puede utilizarse que permiten el seguimiento de estas células en el cuerpo. El comportamiento de las células tumorales en circulación es fundamental ya que determinan las consecuencias finales en cáncer pacientes10. Sangre no es un buen lugar para la supervivencia de las células de tumor2. Que necesitan para escapar del ataque por el sistema de inmune del huésped y necesita señales anti-apoptosis para evitar la apoptosis debido a la falta de soporte físico. Las células del tumor con mayores habilidades de iniciación de tumor en sitios metastáticos generan más nódulos del tumor. Si las células tumorales muestran tropismo de órgano específico, se deben observar metástasis en los órganos particulares. En este ensayo, los pasos iniciales de la cascada metastásica (crecimiento del tumor primario y la invasión) no están incluidos, y por lo tanto el foco está en la interacción entre la circulación de las células tumorales y las células del estroma (células endoteliales, células epiteliales y células de la sangre). En estudios de inyección de células de tumor convencional, los investigadores tienen que esperar hasta que los nódulos del tumor crecen hasta un tamaño tangible para detectar la metástasis. En este caso, no se puede cuantificar el número exacto de las células tumorales en los vasos sanguíneos. Además, este proceso incluye una fase de rebrote del tumor, indicando que otros factores en las células del tumor pueden afectar el resultado.
Conteo de las células del tumor bajo un estereomicroscopio de fluorescencia de etiquetado es un proceso simple. El estereomicroscopio proporciona un amplio campo de visión que puede analizarse el pulmón entero. Citometría de flujo es también una herramienta útil que al instante le da un número exacto de las células tumorales en el tejido. Conteo de células fluorescentes en el tejido bajo un microscopio confocal, es posible y muestra las imágenes más precisas de las células del tumor metastásico, pero requiere tiempo y puede dar resultados sesgados si sólo se cuenta un área seleccionada. El objetivo final de este ensayo es observar cómo fácilmente se acumulan las células del tumor en los pulmones. Como se informó anteriormente de3,4, si los pulmones están en fase de pre-metastásico debido a la señalización inflamatoria del tumor primario, las células tumorales inyectadas son propensas a acumular en los pulmones, por lo tanto, lo que implica mayor probabilidad de metástasis del pulmón. Otras condiciones (artritis reumatoide, asma, etc.) y su tratamiento con agentes antiinflamatorios (como anti-TNFα) pueden atenuar la metástasis del pulmón. Por lo tanto, concluimos que este análisis es una poderosa herramienta para evaluar la posibilidad de metástasis del pulmón.

<table><tbody><tr><td>Colagenasa</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>sin calcio, sin magnesio</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td>traza</td></tr><tr><td>tampón de lisis RBC</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>BD</td><td>352340</td><td>malla de 40 micrómetros</td></tr><tr><td>Kit de etiquetado de fluorescencia</td><td>Sigma</td><td>MIN26-KIT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filtro de jeringa</td><td>sartorius</td><td>17597K</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. compuesto</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehído Fosfato Solución</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de reclutamiento de células de pulmón tumor

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Para investigar los mecanismos moleculares que rigen la metástasis del tumor, se han propuesto varias pruebas utilizando el ratón como un animal modelo. Aquí, demostramos un simple ensayo para evaluar extravasación de células tumorales o micrometástasis. En este ensayo, las células del tumor fueron inyectadas en la vena de la cola, y después de un corto período, los pulmones fueron disecados y digeridos para contar las células tumorales marcadas acumulada. Este análisis omite el paso inicial de la invasión del tumor primario en el vaso sanguíneo y facilita el estudio de los acontecimientos en el lejano órgano donde se produce la metástasis del tumor. El número de células que inyecta en los vasos sanguíneos puede ser optimizado para observar un número limitado de metástasis. Se ha reportado que las células estromales en el órgano distante contribuyen a la metástasis. Así, este análisis podrían ser una herramienta útil para explorar potenciales medicamentos o dispositivos para la prevención de metástasis del tumor.

Los pulmones presentan muchas células GFP-LLC 2 h después de la inyección (figura 1A). Cabe señalar que los puntos fluorescentes también detectados en el filtro rojo deben ser excluidos de la cuenta del número de celular. La gran mayoría de las células LLC desaparece de los pulmones 24 h después de la inyección (figura 1).
Para confirmar el número de la GFP-LLC en los p...

Este manuscrito describe un método para cuantificar la acumulación de células de tumor en los pulmones en un modelo animal de metástasis del tumor.

Ensayo de reclutamiento de células de pulmón Tumor

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología tumoral sobre los mecanismos moleculares de la metástasis. La principal ventaja de esta técnica es que el reclutamiento de células tumorales dentro de un órgano remoto puede ser la cantidad. Comience por usar un reactivo de disociación celular no enzimática para eliminar las células de carcinoma pulmonar Lewis que expresan proteínas fluorescentes, o LLC, de su recipiente de cultivo de acuerdo con los protocolos estándar.Transfiera la solución celular resultante a un tubo cónico de 15 mililitros antes de la centrifugación, y centrifugar los pellets dos veces en cinco mililitros de PBS por lavado. Después del segundo lavado, filtre las células a través de un colador de células de poro de 40 micrómetros y diluya la suspensión a una de cada 10 a las seis células por concentración de mililitro. Luego cargue las células en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja del calibre 29 e inyecte 100 microlitros de células en la vena de la cola de cada ratón macho de ocho a 10 semanas de edad, C57-Negro-6.En el punto final experimental adecuado, utilice tijeras para extraer la piel de la superficie ventral de cada ratón, y corte las costillas y el diafragma para exponer la cavidad torácica. Utilice una aguja de infusión alada de 25 calibres y un tubo para lavar 15 mililitros de PBS a través del ventrículo derecho, y retire el corazón y el timo. Agarrar la tráquea con fórceps, tirar hacia arriba, diseccionar los tejidos conectivos alrededor de la tráquea, para cosechar los pulmones.Luego lave los pulmones en PBS y desprenda un lóbulo para la visualización de las células fluorescentes in situ bajo un microscopio de fluorescencia. Para digerir el tejido pulmonar, primero corta el lóbulo caudal con tijeras y coloca las piezas pulmonares en una jeringa de 10 mililitros. Cierre la jeringa con el émbolo y aspire cinco mililitros de solución de digestión en la jeringa, moviendo el émbolo dentro y fuera del eje de la jeringa hasta que el tejido pulmonar se disefunda a lo largo de la solución.Dispensar la suspensión pulmonar en un tubo de 50 mililitros, y digerir el tejido en una coctelera recíproca durante 15 minutos a 37 grados Celsius y 150 rpm. Al final de la incubación, triturar el tejido restante hasta que las células pulmonares estén completamente dispersas, y devolver el tubo al agitador durante 30 minutos adicionales. Luego filtra las células a través de un colador de poro de 40 micrómetros, y recoge las células por centrifugación.Para analizar las células pulmonares aisladas por citometría de flujo, resuspendir el pellet en dos mililitros de tólus de células sanguíneas rojas tampón durante un minuto a temperatura ambiente, y recoger las células por centrifugación. A continuación, centrifugar el pellet dos veces en cinco mililitros de PBS fresco complementado con 1%albúmina sérica bovina por lavado. Después de la segunda centrifugación, resuspender el pellet en un mililitro de PBS fresco más BSA, y filtrar las células a través de un nuevo colador de poro de 40 micrómetros para la cuantificación de las células tumorales por citometría de flujo.Los pulmones presentan muchas células GFP-LLC dos horas después de la inyección, con la gran mayoría de las células desapareciendo de los pulmones dentro de las 24 horas. Tenga en cuenta que los puntos fluorescentes que se detectan dentro del filtro rojo deben excluirse del recuento de celdas. Para confirmar el número de GFP-LLC en los pulmones, uno de los lóbulos se puede utilizar para el análisis citométrico de flujo como se demuestra.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que un procedimiento de sección congelada es un método más preciso para observar la ubicación exacta de las células tumorales.

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Investigación

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Investigación del cáncer

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El cultivo de CTC permite una caracterización funcional más profunda del cáncer, a través del ensayo de la expresión de marcadores específicos, y la evaluación de la resistencia a los medicamentos y la capacidad de colonizar el hígado, entre otras posibilidades. En general, el cultivo de CTC podría ser una herramienta clínica prometedora para la medicina personalizada para mejorar el resultado del paciente.

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