La entrega de proteínas, péptidos o impermeable a las células pequeñas moléculas en células vivas por incubación con el reactivo endosomolítico dfTAT

El objetivo general del siguiente experimento consiste en introducir macromoléculas en células vivas mediante el uso de dímero de tat fluorescente o df tat, un reactivo capaz de penetrar eficazmente en las células sin dañarlas. Esto se logra primero generando y purificando el agente de entrega. Dfta como segundo paso.

Se incuba Dfta con las células durante una hora a 37 grados Celsius en presencia de la carga de macromoléculas de interés; df tat induce la absorción de la carga dentro de vesículas endocíticas. Las vesículas maduran hasta convertirse en endosomas tempranos y finalmente alcanzan la etapa de endosoma tardío, donde DF tat es capaz de liberar la carga en el espacio citosólico de las células. A continuación, se observan las células mediante microscopía de fluorescencia para evaluar la eficiencia de entrega de detta y de la carga de interés.

Los resultados muestran que el DF TT puede ingresar a las células con alta eficiencia y sin citotoxicidad observable. El DF tat puede entregar macromoléculas de diferentes tamaños al espacio citosólico de las células, tal como se puede observar mediante microscopía de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos de entrega sólidos existentes es que nuestro agente de entrega presenta una alta eficiencia sin impacto negativo observable en la fisiología celular. Además, es fácil de usar, ya que solo requiere un sencillo paso de coincubación.

Para comenzar, para la síntesis de FTA, hinchar 500 miligramos de resina R amida MBHA con dimetilformamida o DMF en un vaso estándar de SPPS de 50 mililitros durante una hora, llevando a cabo la reacción a temperatura ambiente utilizando solo la cantidad de gas nitrógeno necesaria para burbujear la mezcla. Sintetice FTA sobre la resina rink amida MBHA utilizando 1,2 milimoles de cada aminoácido protegido con FM indicado en el protocolo del texto para cada reacción de acoplamiento de aminoácido. Añada también 0,44 gramos de HBTU y 0,51 mililitros de DIEA disueltos en DMF, llevando a cabo cada reacción de acoplamiento de aminoácido durante cuatro horas; trascurridas las cuatro horas de acoplamiento.

Lave la resina con DMF y realice el paso de protección FD según se describe en el protocolo escrito. Repita hasta que se sintetice la cadena peptídica lineal de FTA. A continuación, elimine el grupo protector MTT incubando la resina con 20 mililitros de una solución compuesta por 1 % de ácido trifluoroacético o TFA y 2 % de triisopropilsilano o TIS en DCM durante cinco minutos.

Dado que la eliminación del grupo protector MTT daría lugar a la aparición de un color amarillo. Repita este paso hasta que no se observe ningún color amarillo, lavando la resina con DCM y DMF intermedios. Añada una solución adicional con 1 % de TFA en DCM a la resina para asegurar que no se elimine MTT y que la solución permanezca clara.

A continuación, disuelva T-M-R-H-B-T-U y DIEA en DMF y añada esta mezcla a la resina. Realice la reacción durante la noche utilizando nitrógeno seco para proporcionar agitación tras la protección fm d y la conjugación del aminoácido. Lave la resina con DCM y déjela secar para lograr la escisión completa del péptido de la resina.

Añada una solución que contenga 92,5 % TFA, 2,5 % agua, 2,5 % TIS y 2,5 % etanoditiol a la resina peptídica durante tres horas a temperatura ambiente para lograr la desprotección global y la escisión de la resina. Precipite los productos peptídicos crudos utilizando éter etílico anhidro frío, vertiendo la solución preparada en 40 mililitros de éter etílico. Centrifugue a cuatro grados Celsius y 4.000 ×g durante 20 a 25 minutos.

Repita este paso para permitir el lavado del precipitado con éter etílico anhidro frío. Suspenda los precipitados en agua y liofilice, luego re suspenda los productos obtenidos en TFA acuoso al 0,1 % para el ensayo de ACEDONITA. Realice análisis de cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC con una columna analítica C18.

Para analizar cada péptido, utilice un caudal de un mililitro por minuto y detección a 214 nanómetros y 550 nanómetros. A continuación, realice HPLC semipreparativa en una columna C 18 para la purificación de péptidos. Utilice un caudal de cuatro mililitros por minuto y detección a 214 nanómetros y 550 nanómetros para todos los análisis.

Utilice gradientes lineales antes de realizar la reacción de oxidación. Confirme la identidad correcta de los péptidos mediante MALDI según el protocolo del fabricante. Disuelva FTA en solución salina tamponada con fosfato aireada.

Asegúrese de que el pH esté entre 7,0 y 7,5. Después de la adición del péptido, incube la reacción durante la noche para permitir que reaccione hasta su finalización. Purifique el producto utilizando HPLC de fase reversa y analice mediante espectrometría de masas; a continuación, liofilice el DF tat puro y reconstituya en 200 microlitros de agua para medir la concentración.

Primero, suspenda una alícuota del DF tat purificado en 149 microlitros de solución de TCEP 50 milimolar y deje que la muestra reaccione durante aproximadamente 20 minutos. En este paso, el DF tat se reduce a su contraparte monomérica, F tat, para eliminar el apagado de la absorbancia que ocurre debido a la proximidad cercana del marcador TMR y el DF tat. Añada todas las soluciones a una cubeta de cuarzo CVE y mida la absorbancia a 556 nanómetros.

Utilizando la ley de Beer, determine la concentración de la solución. Esto corresponde a la concentración de FTA.

Divida la concentración de FTA por dos para obtener la concentración de dfta. Cultive las células en un medio adecuado hasta alcanzar una confluencia del 80 al 90 % en una atmósfera húmeda a 37 grados Celsius con 5 % de CO2, lave las células tres veces con 200 microlitros de PBS y una vez con NRL 15. Incube las células con cinco micromoles de df tat con o sin carga, como la proteína verde fluorescente mejorada, y mantenga a 37 grados Celsius durante una hora para inducir la fuga endosomal tras la incubación.

Lave las células tres veces con heparina en medio L-15 para eliminar la DF tat unida a la membrana plasmática de las células. Como paso final, obtenga imágenes de las células mediante un microscopio de fluorescencia, utilizando un filtro para proteína fluorescente roja o RFP, para evaluar la diferencia entre F TAT y D ftt. Las células HeLa se incuban con cada péptido para determinar la diferencia en su localización celular.

Como se muestra aquí, FTA se localiza en una distribución punteada. Esta distribución es consistente con el péptido que permanece atrapado dentro de los endosomas. En contraste, la señal fluorescente de dfta muestra una distribución homogénea a lo largo del citosol y el núcleo.

Se observa la distribución citosólica de DF tat en varias líneas celulares diferentes. Las imágenes a 20 x muestran que un porcentaje muy alto de células en una placa presentan una distribución citosólica de DF tat sin toxicidad celular, como se evidencia por la ausencia de tinción nuclear con cit blue, para determinar si la fuga endosomal mediada por dfta permite la entrega de proteínas grandes en el citosol de las células. Se utilizó EGFP para detectar la entrega de proteínas correctamente plegadas.

EGFP mostró una distribución fluorescente verde citosólica y nuclear, similar a la observada para DF tat en más del 90 % de las células, sin toxicidad observable. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las células no deben estar excesivamente confluentes. Además, las células deben lavarse exhaustivamente para eliminar el FPS antes de añadir df tap.