Name: Producción de ADN de doble cadena Ministrings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprende a producir DNA ministrings de doble cadena mediante un sistema simple de un solo paso. Este método mejora la eficiencia y seguridad en la entrega de genes a células eucariotas.

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Los autores agradecen a las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) para financiar este trabajo.

1. Preparación de Medios de Comunicación y Culturas <ol><li> Para LB + Amp: preparar 500 ml de caldo Luria-Bertani (LB) esterilizar usando un autoclave a 121 ° C durante 30 min. Suplemento con ampicilina para dar una concentración final de 100 mg / ml de ampicilina y se almacena a 4 ° C hasta su utilización. </li><li> Para la TB + Amp: Prepárese para grandes (500 ml) o mayores volúmenes de producción Ministring. Preparar 600 ml de estéril Caldo Terrific (TB) esterilizadas usando un autoclave a 121 ° C durante 30 min. Suplemento con ampicilina para dar una concentración final de 100 mg / ml de ampicilina y se almacena a 4 ° C hasta su utilización. </li><li> Para LB agar + Amp: Preparar placas de agar LB estériles mediante la preparación de LB + Amp complementado con 15 g / L de agar. Alícuotas de aproximadamente 15 - 20 ml en placas de Petri estériles y almacenar al revés a 4 ° C hasta su utilización. </li><li> Preparar una placa racha de W3NN [PDMS] asépticamente rayas W3NN [PDMS] células en agar LB + Amp. Incubar la placa overnilucha a 30 ° C, hasta que las colonias individuales se pueden observar. No incubar W3NN por encima de esta temperatura para evitar derepressing expresión protelomerase. </li><li> transferencia asépticamente 5 ml de LB + Amp en un tubo de ensayo estéril. Preparar un cultivo de una noche de W3NN [] PDMS mediante la inoculación de este volumen con una sola colonia de la placa consecutivas. Incubar durante la noche el cultivo a 30 ° C en un agitador a 230 a 250 rpm. </li></ol> 2. Fase de crecimiento <ol><li> Transferir asépticamente 10 ml de LB + Amp en un estéril 125 ml matraz Erlenmeyer y inocular con 100 l de cultivo de una noche W3NN [PDMS] en el preparado LB + Amp, haciendo una dilución 1: 100. <ol><li> Para volúmenes mayores, añadir 500 l de cultivo durante la noche en 50 ml de TB + Amp en un Erlenmeyer de 250 ml, en lugar de LB + Amp. </li><li> Como alternativa, el uso como el segundo cultivo &quot;representante&quot; en el paso 2.2. </li></ol></li><li> Incubar en una incubadora de agitación a 30 ° C y 250 rpm hasta que el cultura alcanza mediados a fase logarítmica tardía, indicado por una densidad óptica (DO) o absorbancia: A 600 = 0,8. Después de 1-2 horas, el medio debe comenzar a aparecer turbia a simple vista. <ol><li> transferencia asépticamente 1 ml de cultivo a una cubeta de espectrofotómetro limpia. </li><li> Medir la absorbancia de la luz usando un espectrofotómetro UV-vis con la longitud de onda ajustado a 600 nm. Usar 1 ml de los medios de comunicación en el que se cultivan las células para establecer el blanco (LB o TB). Opcionalmente, utilice la cultura representativa de la etapa 2.1.3 para este paso en su lugar. </li><li> Si la cultura no ha alcanzado todavía la OD apropiada, vuelva a la coctelera y comprobar una vez más cada media hora. Compruebe el diámetro exterior mayor frecuencia como el A 600 se aproxima a 0,8. </li></ol></li><li> Una vez que el cultivo ha alcanzado la fase logarítmica tardía, indicada por A 600 = 0.8, transferir asépticamente el cultivo a tubos de centrífuga estéril de 50 ml. </li><li> Recoger las células por centrifugación del cultivo a 10.000 xg durante 10 min. Inspeccionar para una peLlet en la parte inferior del tubo. </li><li> Decantar el sobrenadante clarificado en un contenedor adecuado de residuos biopeligrosos. No perturbar el sedimento celular. </li><li> Repita los pasos 2.4-2.5 hasta que se hayan recogido todas las células. </li><li> Vuelva a suspender el precipitado en 100 l de LB + Amp. Aspirar el uso de una micropipeta o utilizar un mezclador de vórtice. Para mayor producción MiniString, volver a suspender el sedimento de una TB 50 ml + Amp cultura en 1 ml de medio LB fresco + Amp. </li></ol> 3. Producción Ministring <ol><li> Asépticamente añadir 20 ml de LB + Amp en un matraz Erlenmeyer de 125 ml y el calor a 42 ° C. Para mayor producción MiniString, preparar 500 ml de LB + Amp calentada a una temperatura de 42 ° C. </li><li> La transferencia de la resuspensión en el medio precalentado. </li><li> Incubar a 42 ° C y 250 rpm hasta que la fase de registro pasado, indicada por A 600 = 1,0. No deje de 20 ml de cultivo a 42 ° C pasada 1 hora. </li><li> Reducir la temperatura a 37 ° C y dejar la cultura de una adicional 90 min. Para 500 ml, dejar el cultivo durante un período de inducción adicional de 90 - 120 minutos y no disminuir la temperatura. </li><li> Reducir la temperatura a 30 ° C y dejar el cultivo con agitación a 200 rpm durante un período de reducción de marcha de temperatura adicional de 2 hr. Para 500 ml, extender el cambio hacia abajo a la temperatura de 4 horas o durante la noche. </li></ol> 4. Recolección de Ministrings <ol><li> transferir asépticamente el cultivo a tubos de centrífuga estéril de 50 ml. Centrifugar a 10.000 xg durante 10 minutos e inspeccione por un pellet. </li><li> Decantar el sobrenadante en un contenedor adecuado de residuos biopeligrosos sin perturbar el sedimento. Repita hasta que se hayan recogido todas las células. </li><li> Retener el sedimento para la extracción del plásmido con cualquier extracción comercial y el kit de eliminación de endotoxina o congelación de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C para su posterior extracción. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Se describe aquí un sistema simple para la producción de ADN ministrings LCC utilizando un protocolo inducible por calor de un solo paso, que no requiere ningún equipo especial aparte de la que se usa en el crecimiento y la manipulación bacteriana típica. ministrings de ADN están libres de torsión y estables casetes de expresión de ADN lineales, desprovistos de elementos genéticos procariotas. Se pueden usar en lugar de los métodos convencionales para la transferencia de genes, la expresión de genes indicadores, así como en las evaluaciones hacia la eficacia de la expresión del transgen en los sistemas eucariotas. ministrings ADN combinan la biocompatibilidad y el aumento de los beneficios de la eficiencia de transfección de vectores &quot;mini&quot; con el perfil de seguridad superior de vectores de ADN lineales. Nuestra sólida de un solo paso en la plataforma de producción in vivo rápidamente y fácilmente produce ministrings de ADN para cualquier aplicación de la transferencia de genes sin la necesidad de múltiples procesos costosos en vitro. Hay varios pasos críticos paraasegurar una producción óptima MiniString (Figuras 2 y 3). la inducción de calor es el paso más crítico para la producción Ministring. la falta completa de MiniString producción es más probable debido a la falta de inducción de calor (células retenidas a 30 ° C), donde la represión de la expresión protelomerase impide la conversión del plásmido precursor de MiniString LCC. Siguiendo el protocolo de inducción de calor, le espera una eficiencia de producción de aproximadamente 75%. la inducción de calor es óptima mientras que las células están en la fase de registro. Aunque no existe una diferencia estadísticamente significativa en Ministring PE utilizando las células en fase estacionaria ( &quot;Overgrown&quot;, Figura 3), lo hicimos observar casi un 50% de disminución en el rendimiento global del plásmido. Los rendimientos dependerán del protocolo de extracción de plásmido utilizado. Para la producción óptima MiniString, desencadenar la inducción de calor mientras que las células están en la fase de registro. la producción MiniString pobres será muy probablemente un resultado de aumento de marcha temperatura prolongado o insufficiereducción de marcha temperatura nt. Cambio ascendente temperatura prolongada no se recomienda ya que esto activa el E. coli respuesta de choque térmico 15, que puede inhibir la actividad de protelomerase e interferir con la estabilidad del plásmido. Por lo tanto, el momento de la reducción de marcha temperatura es un paso fundamental para la producción MiniString eficiente. Sin tiempo de incubación adicional a 30 ° C, se encontró MiniString eficiencia de la producción a ser muy pobre ( &quot;Extracción temprano&quot;, Figura 3). Esto se puede atribuir a la cantidad de tiempo requerido para la expresión y la actividad Tel. El originario profago PY54 codificación Tel protelomerase normalmente infecta a Yersinia, que crece de forma óptima alrededor de 28 ° C 12, lo que indica que 30 ° C también puede ser más óptimo para la actividad Tel. El sistema de producción minivector ADN utiliza una plataforma in vivo para generar minivectors ADN libre de secuencias bacterianas de alta calidad. Las modificaciones al protocolo de mayo iNCLUDE alterando el medio de cultivo para optimizar el plásmido y la producción de proteínas con el fin de promover el crecimiento celular durante la fase de crecimiento (TB en lugar de LB), o aumentar MiniString eficiencia de la producción y la conversión. Para volúmenes más grandes de cultivo (200 ml) y una mayor reducción de marcha, la temperatura y la incubación a 30 ° C durante la noche puede ser extendida sin graves repercusiones sobre la Ministring PE. Hemos incluido modificaciones en nuestro protocolo de cultivos de 500 ml como un ejemplo. Purificación de ministrings de ADN se puede acelerar a través de la digestión in vitro de endonucleasa de la columna vertebral procariota. Hay un número de sitios diana de endonucleasas (por ejemplo, PI-SceI, PvuI, ScaI) disponibles en la columna vertebral del plásmido procariota precursor, que puede ser cortado para exponer lineal extremos abiertos, lo que permite la degradación in vitro de la columna vertebral procariota. Aislamiento de ministrings de otras especies de vectores también se puede lograr a través de cromatografía de membrana de intercambio aniónico 16. Una limitación de corriente asociado con el sistema de producción de vector de ADN LCC es la necesidad de la purificación de la MiniString ADN de otros productos de LCC y CCC. Aunque fácilmente purificado utilizando métodos de aislamiento de plásmidos estándar, la etapa de aislamiento todavía puede ser una desventaja en un entorno a gran escala. La separación de la MiniString puede llevar mucho tiempo utilizando la edad si el MiniString y la columna vertebral procariota LCC son muy similares en tamaño. Como alternativa, la cromatografía de membrana de intercambio aniónico puede proporcionar una mejor separación de ministrings a partir de especies de vectores CCC 16. Cambio ascendente de la temperatura puede ser otra limitación potencial como altas temperaturas también activan la respuesta de choque térmico en E. coli, que afecta negativamente a la proteína recombinante produce 17 y por lo tanto reducir las tasas de plásmido a Ministring conversión. Se presenta en otro lugar optimizaciones de la plataforma de producción para eludir y / o mitigar esos efectos de choque térmico 18. NosotrosActualmente también se están optimizando los métodos para eliminar o reducir la contaminación LCC columna vertebral procariota in vivo. integración cromosómica del ADN MiniString LCC interrumpe el cromosoma del huésped y somete la célula a la apoptosis. Esto no sólo reducir posibles consecuencias negativas de la mutagénesis de inserción, tales como la oncogénesis y el silenciamiento de genes adyacentes, mejorando de este modo su seguridad; el efecto letal también puede servir como un método ideal para knock-in y estudios de sustitución de genes, sin los efectos secundarios asociados y daños de la integración. Vectores MiniString ADN se pueden aplicar a la transferencia y expresión de genes para proteínas terapéuticas, ARN, anticuerpos o antígenos en un objetivo determinado in vivo o sustituir un alelo funcional mal- o no. El simple inducible por calor en el sistema de producción in vivo de una sola etapa permite vectores MiniString ADN para ser producidos fácilmente para aplicaciones clínicas o industriales.

El objetivo es producir cantidades escalables de lineal cerrado covalentemente minivectors (LCC) de ADN usando un sistema simple y de alta eficiencia de un solo paso inducible por calor in vivo de ADN de producción MiniString. ministrings de ADN proporcionan una estrategia no viral seguro y eficaz para suministrar el ADN. Se combinan la seguridad de los vectores de LCC con la eficiencia de minicircles de ADN, y también ofrecen una alternativa más segura a los vectores derivados de virus sin comprometer la eficiencia de la transfección. Para que un sistema de suministro de transgén para tener éxito, el vector de ADN debe entrar en la célula huésped diana y expresar el transgén (s) codificada. Hay varias barreras celulares que hay que superar en la práctica, en particular en los sistemas de mamíferos. Con el fin de evitar la degradación por nucleasas de suero y la detección inmune por el sistema retículo-endotelial, el vector de ADN debe ser bio- y compatible-inmune con sistema de destino. ADN sin protección es digerida rápidamente por las nucleasas de plasmay la membrana plásmido se compone de barreras de lipoproteínas densas por lo que el vector de ADN debe ser capaz de atravesar rápidamente la membrana plasmática de las células diana. Una vez en la célula, los vectores deben atravesar el citoplasma y pasar a través de la membrana nuclear para entrar en el núcleo para la expresión del transgen. técnicas de suministro de genes no virales se centran en la mejora de los tejidos y las células de metas. Sin embargo, el uso de plásmidos convencionales con estas técnicas reduce la eficacia de transfección debido a la presencia de secuencias bacterianas inmunogénicas, que silencia rápidamente la expresión génica 1,2. plásmidos convencionales suelen llevar los genes de resistencia a antibióticos para el mantenimiento en los sistemas procariotas. Sin embargo, éstos pueden producir efectos adversos potenciales en huéspedes humanos o conferir resistencia a la flora natural de acogida a través de los efectos de transferencia horizontal de genes. Plásmidos convencionales también contienen dinucleótido CpG motivos 2, que puede desencadenar una respuesta inmunoestimuladora no deseado, potencialmentela reducción o silenciamiento de la expresión del transgen. A medida que se exclusivamente compuestos por el casete de expresión eucariota, minivectors ADN, tales como minicircles de ADN 3, son una mejor alternativa para la entrega de genes, ya que muestran una biodisponibilidad mejorada extracelular e intracelular y la mejora de la expresión de genes debido a su tamaño reducido y la ausencia de elementos procariotas inmunoestimulantes 4. Las tarifas de tamaño reducido vector mejor con respecto a la resistencia a las fuerzas de cizallamiento asociadas con la administración in vivo a un sitio diana 5. El mayor número de copias del vector por unidad de masa requiere menos reactivo de transfección, disminuyendo así la toxicidad. Sin embargo, en el caso de la integración vector aleatorio en un cromosoma huésped, circular cerrado covalentemente vectores (CCC), incluyendo tanto minicircles de ADN y plásmidos convencionales, impartir continuidad molecular y por lo tanto puede conducir a la mutagénesis de inserción, lo que puede tener consecuencias devastadoras <sarriba&gt; 6. Comparativamente, la integración de un vector de ADN lineal interrumpe el cromosoma e inicia vías de muerte celular, eliminando de este modo la célula mutante de la población de células en proliferación y la prevención de la mutagénesis de inserción 7. La expresión de genes inmunológicamente definido (MIDGE) vectores minimalistas 8 y vectores micro-lineal 9 (MiLV) son vectores de ADN LCC desarrollados in vitro. Vectores MIDGE han mostrado hasta un expresión del transgen mejorado 17 veces in vivo en comparación con ADN de plásmido convencional vectores 11, y han demostrado resultados prometedores en la terapia génica de la vacuna 10 y el cáncer 8. Además, debido a la estructura libre de torsión de la minivector LCC, se requiere menos reactivo de transfección en comparación con la contraparte CCC superenrollado, reduciendo así la toxicidad 7. Nuestros vectores de ADN LCC mejorados, ministrings de ADN, han demostrado eficacia de expresión superior y bioavailabilidad 7. Además, ministrings de ADN se producen en un sistema de un solo paso inducible por calor in vivo la producción, una alternativa conveniente y rentable de MIDGE y MiLV LCC vectores, que requieren varios pasos en vitro. El sistema de producción MiniString ADN que ser demostrada es un proceso inducible por calor sencillo realizado in vivo, lo que es tanto rentable y fácilmente escalable. Este sistema aprovecha la Yersinia enterocolitica bacteriófago PY54 derivado de Tel / PAL protelomerase sistema de recombinación 12 para separar el casete de expresión eucariota mínima por parte del esqueleto del plásmido procariota. Hemos diseñado Escherichia coli células (W3NN) para expresar Tel protelomerase bajo el control del promotor del bacteriófago λ-inducible por calor, cI [Ts] 857 13. Tras la expresión, Tel protelomerase actúa sobre sitios diana pal presentes dentro de &quot;Super Sequence&quot; (SS) sitios ubicados en el plásmido precursorpara dar productos de LCC, de los cuales el MiniString ADN puede entonces ser purificado (Figura 1). Los sitios de la SS en el plásmido precursor MiniString ADN también codifican sitios diana para otras recombinasas incluyendo la recombinasa Cre (LOX), TELN protelomerase (telRL) y Flp recombinasa (FRT), facilitando de este modo la producción de LCC isogénicas y minivectors CCC de un plásmido precursor. Además, cada sitio SS está flanqueado en ambos lados por secuencias de SV40 Enhancer (SV40E), que sirven para mejorar la translocación nuclear 14. Hemos demostrado en otro lugar que la adición sucesiva de SV40E confiere progresivamente los correspondientes incrementos en la eficiencia de la transfección 7. El plásmido precursor (pDNA MiniString o PDMS) contiene un polienlazador (Figura 1) para facilitar la inserción de cualquier gen deseado de interés en fusión transcripcional con el reportero fluorescente verde (GFP). La tecnología de ADN pueden minivectorser utilizado en lugar de los métodos convencionales para la transferencia de genes, la expresión de genes informadores, y las evaluaciones hacia la eficacia de la expresión del transgen en los sistemas eucariotas. ministrings ADN combinan la biocompatibilidad y el aumento de los beneficios de la eficiencia de transfección de vectores &quot;mini&quot; con el perfil de seguridad superior de vectores de ADN lineales. Nuestra sólida plataforma de producción de un solo paso con rapidez y facilidad produce ministrings de ADN para cualquier aplicación de la transferencia de genes y ofrece un perfil de seguridad superior.

<table><tbody><tr><td>E. coli W3NN</td><td>Cepa de mediphage</td><td></td><td>para el procesamiento de minicuerdas: Nafissi & Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td> Plásmido padre de <td>Medifage</td><td></td><td>para el procesamiento de minicuerdas: también conocido como pDNA Ministring (pDMS)</td></tr><tr><td>BD Difco Medios de cultivo deshidratados: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Caldo excelente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Agar deshidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC 2190147</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milipore Ultrapure Water</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>Modelo: Guantes quirúrgicos para sistema de purificación de agua Mili-Q Advantage A10</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de Fisherbrand con Tapa Transparente Raised Ridge (100&nbsp; x&nbsp; 15&nbsp; mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Tubos de ensayo KIMAX VWR</td><td></td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Cubeta</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 15 ml Tubos Falcon</td><td>&nbsp; BD Falcon</td><td>62406-200,Tubos</td><td></td></tr> <tr><td>de centrífuga estériles de 50 ml</td><td>&nbsp; FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipetas Serológicas Desechables de Poliestireno 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Serológicas Desechables de Poliestireno Falcon 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta (100-1,000&nbsp; &mu; l)</td> <td>Micropipeta FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>(20-200&nbsp; &mu; l)</td> <td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta estériles (100-1,250&nbsp; &mu; l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta estériles (1-200&nbsp; &mu; l)</td> <td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Shaker</td><td>New Brunswick Scientific&nbsp;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer estéril (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matraz estéril Erlenmeyer (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matraz estéril Erlenmeyer (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Modelo: Centrífuga de piso Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>369001</td><td>Modelo: Centrífuga de sobremesa Avanti J-E</td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>Modelo: GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Escalera de ADN</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

producción de adn de doble cadena ministrings

Production of Double-stranded DNA Ministrings

Hemos construido lineales cerrados covalentemente minivectors (LCC) de ADN como un gen de entrega alternativa vector no viral producido a través de una plataforma sencilla in vivo. Ministrings de ADN poseen un perfil de seguridad elevado y también proporcionan de manera eficiente la carga de ADN a las células diana. vectores de ADN convencionales llevan secuencias procarióticas indeseables, incluyendo genes de resistencia a antibióticos, motivos CpG, y orígenes bacterianos de replicación, que puede conducir a la estimulación de las respuestas inmunológicas host. La biodisponibilidad de vectores de ADN convencionales también se ve comprometida debido a su tamaño molecular más grande. Su naturaleza circular puede impartir también la integración cromosómica, que conduce a la mutagénesis de inserción. secuencias bacterianas se escindieron de minivectors de ADN, dejando sólo el gen de interés (GOI) y elementos de expresión eucariotas necesarios. Nuestros minivectors ADN LCC, o ministrings de ADN, están desprovistos de secuencias bacterianas inmunogénicas; por lo tanto, la mejora de THEIR biodisponibilidad y la expresión GOI. En el caso de la integración del vector en el cromosoma, la MiniString ADN LCC se letalmente interrumpir el cromosoma del huésped, eliminando de este modo el mutante potencialmente peligrosa de la población de células en proliferación. En consecuencia, ministrings de ADN ofrecen los beneficios de ADN &#39;minicircle&#39; al tiempo que elimina el potencial de eventos de integración vector indeseables. En comparación con los plásmidos convencionales y sus contrapartes isogénicas circulares cerradas covalentemente (CCC), ministrings ADN demuestran una biodisponibilidad superior, la eficiencia de transfección, y la cinética citoplasmáticos - que por lo tanto requieren menores cantidades de tensioactivos catiónicos para la transfección eficaz de células diana. Hemos construido un solo paso inducible sistema in vivo para la producción de ministrings de ADN en Escherichia coli que es fácil de usar, rápido y escalable.

Después de la extracción de ADN, el plásmido precursor residual, LCC columna vertebral procariota, y la MiniString DNA serán recuperados. En general el rendimiento y la pureza plásmido se pueden evaluar usando un espectrofotómetro. La pureza se estimó utilizando la relación de la absorbancia a 260 nm y 280 nm (A260 / A280), donde una proporción de 1,9 a 2,0 es óptimo. Todos los productos de LCC y CCC se pueden separar a través de electroforesis en gel de agarosa (AGE) (Figura 2). EDAD visualiza los resultados de la producción Ministring después de la inducción de calor, antes de la Ministring purificación. Una evaluación cualitativa de la producción Ministring se puede hacer en esta etapa mediante la comparación de la intensidad de banda de la MiniString (2,4 kb) de plásmido parental (5,6 kb) (Figura 2). ADN Ministring se puede recuperar a través de protocolos de extracción de gel plásmido estándar siguientes EDAD. La figura 3 resume Ministring eficiencia de producción en diversas condiciones que puedan producirse mientras acarreoing a cabo el protocolo. MiniString eficiencia de producción se determinó sobre la base de la intensidad de banda de ADN utilizando el programa de análisis del fabricante. Cualquier programa de densitometría similar se puede utilizar para analizar los resultados de AGE. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Descripción general de MiniString de producción (A) El vector parental contiene un polienlazador en fusión transcripcional con un gen reportero, enmarcado por los dos sitios SS. La columna vertebral codifica beta-lactamasa para resistencia a ampicilina y también contiene varios sitios de corte únicos para la columna vertebral de la digestión in vitro. (B) Descripción general del protocolo principal. Pasos 2) fase de crecimiento y 3) Producción Ministring están representados en un diagrama para proporcionar un esquema general de los pasos implicados, destacando la simplicidad del protocolo. Inducción (C) Ministring. La inducción de calor inactiva el represor sensible a la temperatura, permitiendo la expresión tel seguido por la actividad de los sitios Tel SS en los plásmidos parentales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> Figura 2: Ministring producción después de las desviaciones de protocolo. 1: Control, 2: no inducidas, 3: Cubierto de vegetación, 4: Overinduced, 5: La eliminación temprana. MiniString ADN es de aproximadamente 2,4 kb, columna vertebral LCC es de 3 kb y pNN9 plásmido parental es de 5,6 kb. la intensidad de banda de las bandas MiniString y en troncales LCC caer con desviaciones de protocolo, lo que indica un rendimiento MiniString inferior. De izquierda a derecha: 1 kb escalera de New England Biolabs; Control, siguiendo el protocolo; No inducido, no cambio ascendente de la temperatura; Cubierto de vegetación, temperatura de cambio ascendente during fase estacionaria; Overinduced, cambio ascendente de temperatura ampliado; La remoción temprana, sin reducir la marcha de la temperatura. Los plásmidos se extrajeron mediante el Omega-Biotek EZNA plásmido Mini Kit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> Figura 3:. Efectos de las desviaciones de protocolo en MiniString eficiencia de la producción (PE) Los resultados son la media de 3 ensayos. PE se estima a partir de la intensidad de banda relativo medido usando AlphaImager HP después de la edad. Las desviaciones se producen en los siguientes pasos: Control, siguiendo el protocolo; No inducido, sin cambio ascendente temperatura en el paso 2; Cubierto de vegetación, cambio ascendente temperatura empezó durante la fase estacionaria en el paso 1.6; Overinduced, cambio ascendente de temperatura ampliado en el paso 2.3; La remoción temprana, las células retira y se extrajosin reducir la marcha de temperatura en el paso 2.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El minivector de ADN lineal covalentemente cerrado (LCC) (DNA ministring) es un vector de entrega de genes no viral que ofrece una alta eficiencia de transfección y es relevante para cualquier aplicación de entrega de ADN. El sistema de producción es sencillo, rápido y escalable in vivo. El siguiente protocolo proporciona instrucciones visuales paso a paso para la producción de minicadenas de ADN.

Producción de ADN de doble cadena Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

El objetivo general de este procedimiento es generar minivectores de ADN lineales y covalentemente cerrados seguros, o minicuerdas de ADN, utilizando un sistema de producción sencillo y de un solo paso. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los vectores de ADN y la entrega de genes. En particular, cómo producir eficientemente vectores de entrega génica más seguros y eficaces denominados minicuerdas de ADN.La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un enfoque eficiente y sencillo, en un solo paso y in vivo, para la producción de minicadenas de ADN. Para preparar los medios, tras preparar 500 mililitros de LB, 600 mililitros de TB y agar LB para placas, autoclavar a 121 grados Celsius durante 30 minutos. Tras el enfriamiento, suplementar cada medio con ampicilina, a una concentración final de 100 microgramos por mililitro.Almacene los medios líquidos a cuatro grados Celsius. Luego, vierta de 15 a 20 mililitros del agar LB con amp en placas de Petri estériles y, después de enfriar, almacénelas boca abajo a cuatro grados Celsius. Inocule por estría las células W3NN PDMS en agar LB con ampicilina e incube la placa a 30 grados Celsius durante la noche hasta que se puedan observar colonias individuales.Luego, con una colonia individual del cultivo por estría, prepare un cultivo nocturno de W3NN PDMS inoculando cinco mililitros de LB más ampicilina. Incube el cultivo a 30 grados Celsius y entre 230 y 250 RPM durante la noche. En un matraz Erlenmeyer de 125 mililitros, inocule 10 mililitros de LB más ampicilina con 100 microlitros del cultivo nocturno de W3NN PDMS para obtener una dilución de 1 en 100.Incube el cultivo a 30 grados Celsius y 250 RPM hasta que aparezca turbio a simple vista y alcance la fase logarítmica media o tardía. A continuación, transfiera 1 mililitro de cultivo a una cubeta limpia. Luego, utilizando un espectrofotómetro UV-Vis con una longitud de onda de 600 nanómetros y el medio usado para cultivar las células, ajuste el blanco antes de medir la absorbancia de la luz del cultivo.Si el cultivo aún no ha alcanzado la DO adecuada, devuélvalo al agitador y verifíquelo nuevamente cada media hora. Una vez que el cultivo haya alcanzado la fase logarítmica media, transfiéralo a tubos estériles de centrífuga de 50 mililitros. Pelote las células centrifugando a 10.000 × g durante 10 minutos.Decante el sobrenadante claro en un recipiente adecuado para desechos biopeligrosos, y use 100 microlitros de LB más amp para resuspender el sedimento mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo o por vortex. Para inducir la producción de minicadenas, agregue 20 mililitros de LB más amp a un matraz Erlenmeyer de 125 mililitros y caliente a 42 grados Celsius. Transfiera el sedimento resuspendido al medio precalentado e incube a 42 grados Celsius y 250 RPM más allá de la fase logarítmica, o durante no más de una hora para 20 mililitros.Reduzca la temperatura a 37 grados Celsius y deje la cultura durante 90 minutos adicionales. Luego, reduzca aún más la temperatura a 30 grados Celsius y deje la cultura agitándose a 200 rpm durante dos horas. Para recolectar las minicadenas, transfiera la cultura a tubos estériles de centrífuga de 50 mililitros.Luego, centrifugue a 10.000 × g durante 10 minutos e inspeccione la presencia de un precipitado. Finalmente, deseche el sobrenadante y utilice un kit comercial de extracción y eliminación de endotoxinas para extraer el plásmido. Después de la extracción del ADN, se recuperarán el plásmido precursor residual, el armazón procariota LCC y la minicadena de ADN, los cuales pueden separarse mediante electroforesis en gel de agarosa, como se observa aquí.Antes de la purificación del ministring, en esta etapa se puede realizar una evaluación cualitativa de la producción del ministring comparando la intensidad de la banda del ministring con la del plásmido parental. Esta figura resume las eficiencias de producción de ministring que probablemente ocurran bajo diversas condiciones durante la realización del protocolo. La eficiencia de producción de ministring se determinó en función de la intensidad de la banda de ADN.Una vez dominada, esta técnica puede completarse por completo en menos de ocho horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar adherirse a los cambios de temperatura adecuados. Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como electroforesis en gel de agarosa o digestión con endonucleasas para aislar minicadenas o verificar la eficiencia de producción.Esta técnica puede mejorar considerablemente la entrega de genes a células eucariotas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo maximizar la producción de minicadenas de ADN utilizando nuestra plataforma de producción. No olvide que, al trabajar con bromuro de etidio, los iluminadores de luz ultravioleta pueden ser extremadamente peligrosos, y siempre se debe usar equipo de seguridad adecuado en el laboratorio al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Biología

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