Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

El objetivo general de la inyección de azul de Evans y dextrina Fitzy en la vena cardinal común es observar la integridad de la membrana del músculo esquelético en pececillos de cebra vivos, con el fin de ayudar a caracterizar los mecanismos causantes de enfermedades relacionados con diversos subtipos de distrofia muscular. La inyección de azul de Evans puede ayudar a descubrir los mecanismos biológicos que contribuyen a la patología de la enfermedad al caracterizar modelos animales de distrofia muscular, y también puede contribuir a nuestra comprensión de posibles mecanismos terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que puede realizarse y analizarse utilizando pececillos de cebra vivos.

Además, la coinyección de Fitz Dextrin demuestra un control de calidad para una inyección exitosa, lo que mejora la rigurosidad y la cuantificación. Las implicaciones de esta técnica se relacionan con su utilidad en la validación de modelos de pez cebra para enfermedades musculares. También mejoran la comprensión de cómo ciertas mutaciones conducen a fenotipos de enfermedades musculares, como la distrofia muscular, lo cual es fundamental para encontrar tratamientos y curas.

Para preparar placas de agar para inyección, hierva de dos a 3% de aros en medio E tres y deje que la solución se enfríe ligeramente sobre la bancada. Vierta aproximadamente 35 mililitros de agaros enfriado en cada placa de 100 milímetros. Luego coloque un extremo del molde de inyección preferido en la solución antes de colocar el resto del molde sobre la solución de agaros.

Deje solidificar la solución de agar a temperatura ambiente o a cuatro grados Celsius durante aproximadamente 30 minutos. Luego, use una espátula para separar un extremo del molde del agar sólido y retire lentamente el resto del molde. Prepare un stock al 1 % de colorante azul de Evans o EBD en solución de Ringer 1x.

Luego, prepare una solución stock de Fitzy Dextrin en solución Ringer 1x y almacénela a menos 20 grados Celsius. Para preparar la mezcla de inyección, diluya el EBD hasta 0,1 % directamente en la solución stock de Fitzy Dextrin, mezcle bien mediante vortexeo, y proteja de la luz directa envolviendo el tubo con papel de aluminio antes de la inyección. Precaliente la placa de inyección a temperatura ambiente.

Coloque el micromanipulador sobre una placa de metal y colóquelo junto al microscopio de inyección. Encienda el controlador de microinyección accionado por aire. Luego, con aproximadamente dos a cuatro microlitros de la mezcla de EBD, rellene la aguja de inyección por detrás.

A continuación, calibre el volumen de inyección con aproximadamente cinco nanolitros de la mezcla de EBD. Luego, use una solución de Ringer al 1x para humedecer la placa de inyección y elimine el exceso de solución de los pozos. Pretrate los larvas con trica al 0,04 % diluida en solución de Ringer al 1x para inmovilizar completamente las larvas antes de inyectarlas con una pipeta de vidrio. Coloque las larvas anestesiadas en los pozos de las placas de inyección de tornillo sinfín, asegurándose de que las larvas queden completamente dentro de los pozos, acostadas de lado.

Retire la solución de trica en exceso para minimizar el movimiento de las larvas dentro del pocillo, pero deje suficiente para evitar la deshidratación. Coloque la placa de inyección con las larvas sobre un microscopio estereoscópico y posicione la aguja de la pipeta de inyección que contiene el EBD. Mueva la aguja sobre una larva de pez cebra cerca del corazón y aproximadamente a 45 grados del eje anterior-posterior.

Inserte la aguja de inyección en la vena cardinaria común o CCV cerca de la porción anterior de la yema, donde la vena inicialmente gira en dirección dorsal. A continuación, inyecte cinco nanolitros de la mezcla de EBD y mantenga la aguja de inyección en posición durante cinco a ocho segundos. Para minimizar la fuga inmediata de la mezcla de EBD, una buena inyección mostrará el colorante en las cámaras cardíacas, y puede repetirse.

Si EB DMX no se observa en el corazón inmediatamente después de una inyección exitosa, el embrión acumulará Fitz Dextrina en el sistema vascular como se muestra aquí. Después de inyectar el número deseado de larvas, devuélvalas a una solución de Ringer sin trica en placas de 100 milímetros para aumentar la tasa de supervivencia y mantener la intensidad de la señal. Mantenga las placas envueltas en papel de aluminio.

Incube las larvas a 28,5 grados Celsius durante cuatro a seis horas para asegurar una absorción eficiente de EBD. Para visualizar el EBD en el músculo, use trica al 0,04 % para anestesiar las larvas antes de observarlas bajo fluorescencia roja. Se inyectó EBD en la CCV de mutantes homocigotos de Sapia y hermanos silvestres al 3D PF; las inyecciones que llenaron las cámaras cardíacas, como se muestra aquí, se analizaron luego para verificar la perfusión exitosa del colorante mediante la visualización de fitzy dextrina en la vasculatura bajo fluorescencia verde.

Después de un período de incubación de cuatro horas, la absorción de EBD se examinó al nivel del somito, como se muestra en esta figura. Los hermanos de tipo silvestre no exhibieron fluorescencia de EBD dentro de ninguna fibra muscular visible, mientras que los mutantes homocigotos sapia mostraron absorción de EBD, lo que indica daño en la membrana muscular. Una vez que se domina la inyección eficaz del colorante azul de Evans en la vena cardinale común del pez cebra, las larvas pueden procesarse en 30 a 60 minutos, dependiendo del número de larvas que se inyecten.

Además, los resultados experimentales pueden obtenerse en un solo día para garantizar la competencia. Es importante recordar apuntar cuidadosamente hacia la vena cardinal con el fin de producir resultados consistentes e interpretables. Esto puede ser un desafío y probablemente requerirá práctica tras seguir este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como análisis químicos y genéticos, para determinar los mecanismos moleculares responsables del daño de la membrana asociado con las distrofias musculares. Estos experimentos pueden ayudar a establecer nuevas estrategias terapéuticas para las enfermedades musculares tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación de enfermedades musculares exploraran la integridad de la membrana en modelos de pez cebra de distrofia muscular.

Después de ver este video, debería tener una comprensión completa de cómo inyectar el colorante azul de Evans en la vena cardinales común de larvas de pez cebra. También debería comprender cómo identificar fibras musculares con daño de membrana debido a la presencia del colorante azul de Evans dentro de las fibras.