Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

El objetivo general de la inyección de la vena cardinal común de Evans Blue Dye y Fitzy Dextrin es observar la integridad de la membrana del músculo esquelético en peces cebra vivos para ayudar a caracterizar los mecanismos causantes de enfermedades relacionadas con varios subtipos de distrofia muscular. La inyección de tinte azul de Evan puede ayudar a descubrir los mecanismos biológicos que contribuyen a la patología de la enfermedad al caracterizar modelos animales en distrofia muscular, también puede contribuir a nuestra comprensión de los posibles mecanismos terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que se puede llevar a cabo y analizar utilizando peces cebra vivos.

Además, la coinyección de Fitz Dextrin demuestra un control de calidad para una inyección exitosa, lo que mejora el rigor y la cuantificación. Las implicaciones de esta técnica se relacionan con la utilidad en la validación de modelos de enfermedad muscular de pez cebra. También mejoran la comprensión de cómo ciertas mutaciones conducen a fenotipos de enfermedades musculares, como la distrofia muscular, que es fundamental para encontrar tratamientos y curas.

Para preparar las placas de inyección de agar, hierva de dos a 3%aros en un medio E tres y deje que la solución se enfríe un poco en el banco. Vierta unos 35 mililitros de los agros enfriados en cada plato de 100 milímetros. A continuación, coloque un extremo de un molde de inyección preferido en la solución antes de colocar el resto del molde en la solución agrícola.

Deje que la solución agrícola se solidifique a temperatura ambiente o a cuatro grados centígrados durante unos 30 minutos. Luego use una espátula para separar un extremo del molde de los agros sólidos y retire lentamente el resto del molde. Haga un 1% de stock de Evan's Blue Dye o EBD en una solución de x ringer.

A continuación, prepare una solución madre de Fitzy Dextrin en una solución de timbre y almacene a 20 grados centígrados negativos. Para hacer una mezcla de inyección, diluya EBD al 0,1% directamente en la solución madre de Fitz Dextrin, devite completamente la mezcla de inyección y manténgala alejada de la luz directa utilizando papel de aluminio para envolver el tubo antes de inyectar. Precaliente la placa de inyección a temperatura ambiente.

Coloque el micromanipulador en una placa de metal y colóquese junto al microscopio de inyección. Encienda el controlador de microinyección accionado por aire. Luego, con aproximadamente dos a cuatro microlitros de mezcla EBD, rellene la aguja de inyección.

A continuación, calibrar el volumen de inyección con unos cinco nanolitros de mezcla EBD. A continuación, utilice una solución de anillo para humedecer la placa de inyección y eliminar el exceso de solución de los pocillos, trate previamente las larvas con 0,04 % de trica diluido en una solución de anillo x para inmovilizar completamente las larvas antes de inyectar con una pipeta de vidrio. Coloque las larvas anestesiadas en los pocillos de las placas de inyección de la barrena, asegurándose de que las larvas estén completamente en los pocillos acostadas de lado.

Retire el exceso de solución trica para minimizar el movimiento de las larvas dentro del pozo, pero deje lo suficiente para evitar la deshidratación. Coloque la placa de inyección de larvas en un endoscopio de disección y coloque la aguja de pipeta de inyección que contiene la EBD. Mezcle sobre una larva de pez cebra cerca del corazón y a unos 45 grados del eje anteroposterior.

Inserte la aguja de inyección en la vena cardinal común o CCV cerca de la porción anterior de la yema, donde la vena inicialmente gira en dirección dorsal. A continuación, inyecte cinco nanolitros de mezcla EBD y mantenga la aguja de inyección en posición durante cinco a ocho segundos. Para minimizar la fuga inmediata de la mezcla de EBD, una buena inyección mostrará el tinte en las cavidades del corazón, y se puede repetir.

Si no se observa EB DMX en el corazón inmediatamente después de una inyección exitosa, el embrión acumulará Fitz Dextrin en la vasculatura como se muestra aquí. Después de haber inyectado el número deseado de larvas, regrese las larvas a una solución de timbre x sin trica en placas de 100 milímetros para aumentar la tasa de supervivencia y mantener la intensidad de la señal. Mantenga los platos envueltos en papel de aluminio.

Incubar las larvas a 28,5 grados centígrados durante cuatro a seis horas para garantizar una absorción eficiente de la EBD. Para visualizar la EBD en el músculo, use 0.04%trica para anestesiar las larvas antes de verlas bajo fluorescencia roja. La EBD se inyectó en el CCV de mutantes homogéneos de Sapia y hermanos de tipo salvaje en inyecciones de PF 3D que llenaron las cámaras cardíacas como se muestra aquí, luego se analizaron para una perfusión de muerte exitosa mediante la visualización de dextrina fitzy en la vasculatura bajo fluorescencia verde.

Después de un período de incubación de cuatro horas, la absorción de EBD se examinó a nivel de ácaros, como se muestra en esta figura. Los hermanos de tipo salvaje no mostraron fluorescencia de EBD dentro de ninguna fibra muscular visible, mientras que los mutantes homocigotos de sapia mostraron una absorción de EBD que indica daño a la membrana muscular. Una vez que se inyecta el tinte azul de Evans en la vena cardinal común del pez cebra, las larvas se pueden completar en 30 a 60 minutos, dependiendo de la cantidad de larvas que se inyecten.

Además, los resultados experimentales se pueden obtener en un solo día para garantizar la competencia. Es importante recordar que hay que apuntar cuidadosamente a la vena cardinal para producir resultados consistentes e interpretables. Esto puede ser un desafío y probablemente tomará práctica siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como los cribados químicos y genéticos, para determinar los mecanismos moleculares responsables del daño membranal asociado a las distrofias musculares. Estos experimentos pueden ayudar a establecer nuevas estrategias terapéuticas para la enfermedad muscular después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación de enfermedades musculares exploraran la integridad de la membrana en modelos de distrofia muscular de pez cebra.

Después de ver este video, debería tener un conocimiento profundo de cómo inyectar el tinte azul de Evan en la vena cardinal común de las larvas de pez cebra. También debe comprender cómo identificar las fibras musculares con daño en la membrana debido a la presencia del tinte azul de Evan dentro de las fibras.