Name: Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprende a evaluar la integridad de la membrana muscular en larvas de pez cebra mediante inyección de azul de Evans. Esta técnica permite caracterizar modelos de distrofia muscular y desarrollar terapias potenciales en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Queremos agradecer a Trent Waugh por su asistencia técnica. También reconocemos el Departamento de Pediatría en el Hospital para Niños Enfermos y Cure distrofia muscular congénita (CMD) por su generosa financiación para este proyecto.

1. Preparación de placas de agar de inyección (Tiempo: 45 min) <ol><li> Hervir 2% al 3% de agarosa en medios E3 y permita que la solución se enfríe un poco en el banco. Nota: El número de placas de inyección está preparando dicta la cantidad de agarosa necesario. Cada placa de inyección necesita aproximadamente 35 ml de la solución de agarosa. </li><li> Después de hervir, deje que la agarosa se ​​enfríe hasta alcanzar la temperatura deseada (por ejemplo., 45 ° C) según las instrucciones del fabricante molde de inyección. </li><li> Verter aproximadamente 35 ml de la agarosa enfriados en un plato de 100 mm. </li><li> Coloque un extremo del molde de inyección preferido en la solución, luego se quedó resto del molde sobre solución de agarosa (esto ayudará a reducir la aparición de burbujas de aire). </li><li> Dejar que la solución de agarosa se ​​solidifique ya sea a temperatura ambiente o 4 ° C durante aproximadamente 30 min. </li><li> Use una espátula para separar un extremo del molde de la agarosa sólida. Retire lentamente el resto de la m<html> viejo. </li></ol> 2. Preparación del colorante azul de Evans (EBD) Injection Mix (Tiempo: 30 min) <ol><li> Hacer un 1% stock de EBD en 1X solución de Ringer (NaCl mM 155; KCl 5 mM; 2 mM CaCl 2; 1 mM de MgCl 2; 2 mM Na 2 HPO 4; HEPES 10 mM; glucosa 10 mM; pH a 7,2), que se puede almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Hacer una solución de reserva de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -dextrano MW 10.000 kDa a 25 mg / ml en solución y la tienda de 1X Ringer a -20 ° C. </li><li> Preparar la mezcla de inyección diluyendo EBD a 0,1% directamente en solución madre de Stock FITC-dextrano (es decir, para un volumen de trabajo final de 100 l:. Mezclar 10 l de 1% EBD en 90 l de FITC Stock dextrano). </li><li> Mezclar bien la inyección de vórtice (debe ponerse de color verde) y mantenerlo fuera de la luz directa envolviendo tubo de mezcla de inyección en papel de aluminio. </li></ol> Preparación 3. EBD Inyección (Tiempo: Aproximadamente 30 min) ent &quot;&gt; Nota: Protocolo funciona mejor con larvas después de la fecundación 3-7 días (DPF). <ol><li> Placa de inyección Pre-caliente para RT. </li><li> Configurar aparato de inyección mediante la organización de micromanipulador en la placa de metal y de pie al lado del microscopio que se utilizan para la inyección. Encienda el controlador de la microinyección de aire impulsado. Nota: El sistema de inyección preferida variará por el laboratorio y no debe cambiar resultado del análisis. </li><li> Volver llenar aguja de inyección con aproximadamente 2.4 l de mezcla EBD. </li><li> Calibrar volumen de inyección a aproximadamente el 5 nl de mezcla EBD. Nota: Calibración Volumen de inyección dependerá de método de calibración. Una inyección de pistón accionado se puede fijar directamente a un volumen de inyección dado mientras que los inyectores de presión de gas tendrán que el volumen de inyección calibrado a través de volumen de bolo con el uso de un micrómetro. </li><li> Placa de inyección húmedo con una solución de 1X Ringer y eliminar el exceso de los pozos. </li><li> Larvas de Pre-tratamiento con sal metanosulfonato 0,04% de acetato de 3-aminobenzoatot (tricaína) diluido en solución de Ringer 1X para inmovilizar las larvas antes del comienzo de la inyección. Nota: Asegurar larvas son completamente inmóviles es importante ya que la inyección adecuada es difícil con cualquier movimiento residual. </li><li> Coloque larvas anestesiadas en los pocillos de las placas de inyección de agar usando una pipeta de vidrio. Asegúrese de que las larvas son completamente dentro del pozo y la mentira de su lado. Nota: El número de larvas por así es hasta el experimentador. </li><li> Después de larvas se colocan en los pocillos, eliminar el exceso de solución de Ringer para minimizar el movimiento larvas dentro del pozo. Deja una cantidad residual de solución para que las larvas no deshidratar. </li></ol> 4. Inyección pericárdico de larvas de pez cebra con EBD (Tiempo: Depende de la cantidad de inyección de larvas, que se estima 1.3 h) <ol><li> Coloque la placa de inyección que contiene las larvas en un microscopio de disección, donde se llevarán a cabo las inyecciones. </li><li> Coloque la aguja pipeta de inyección que contieneel EBD mezcla sobre un larvas de pez cebra. </li><li> Vuelva a la posición de la placa de inyección girándola para que la aguja de inyección está cerca del corazón de las larvas y de aproximadamente 45 ° ventral del eje antero-posterior. </li><li> Insertar la aguja de inyección en la vena cardinal común (CCV) en la región de la vena en la porción anterior de la yema donde la vena se está convirtiendo inicialmente en la dirección dorsal (Figura 1). Nota: con un aumento de hasta 40x puede ser útil para ver claramente la CCV. </li><li> Inyectar 5 nl de mezcla EBD y mantener la aguja de inyección en la posición de 5-8 segundos para minimizar la fuga inmediata de mezcla EBD. Nota: Una buena inyección tendrá coloración colorante se observa en las cámaras del corazón (Figura 1). Si mezcla EBD no se observa en el corazón, a continuación, la inyección de un 5 nl adicional de mezcla EBD puede ser suficiente para inducir la absorción de colorante. Alternativamente, el embrión puede ser desechada. Nota: En algunas situaciones, el corazón puede dejar de latir. Si este occurs, continuará monitoreando las larvas de 20-40 seg. Típicamente, el corazón latiendo como se reanuda el colorante se mueve a través del sistema circulatorio. </li><li> Pasar a la siguiente larvas y repetir. </li><li> Identificar embriones inyectados con éxito mediante la observación de la presencia de FITC-dextrano en la vasculatura inmediatamente después de la inyección (Figura 2). </li></ol> 5. Incubación y EBD Captación (Hora: 04.06 horas) <ol><li> Después se inyecta el número deseado de larvas, larvas de retorno inyecta a 1X solución de Ringer sin tricaína en placas de 100 mm. </li><li> Mantenga los platos envueltos en papel de aluminio. Nota: Mantener larvas inyectado en la oscuridad aumenta significativamente las tasas de supervivencia y garantiza la mayor coherencia en la intensidad de la señal. Envolver en papel de aluminio es especialmente importante para el período de tiempo que las larvas se encuentran fuera de la incubadora. </li><li> Permita que las larvas de incubar a 28,5 ° C durante 4-6 horas para asegurar la suficiente absorción EBD. </li></ol&gt; 6. Visualización de EBD en el músculo (Tiempo: Depende de la cantidad de inyección de larvas y el tipo de microscopía, prevista 0,5-3 horas) <ol><li> Antes de la formación de imágenes, anestesiar a las larvas con 0,04% tricaína para evitar el movimiento. </li><li> Ver larvas bajo fluorescencia roja para determinar si EBD absorción se produce en el músculo esquelético (Figura 3). </li></ol>

<ol><li>Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Duchenne+muscular+dystrophy+%28DMD%29+for+the+pediatricians+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Pediatr+%28Phila%22%5BJournal%5D)">Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community.</a> Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).</li>
<li>Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+into+prominence%3A+the+zebrafish+as+a+valuable+tool+for+studying+human+myopathies+and+muscular+dystrophies%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies).</a> FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).</li>
<li>Lancet, , 381-845 (2013).</li>
<li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dystrophin+glycoprotein+complex%3A+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Campbell, K. P., Kahl, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+dystrophin+and+an+integral+membrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein.</a> Nature. 338, 259-262 (1989).</li>
<li>Cohn, R. D., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of muscular dystrophies.</a> Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).</li>
<li>Yoshida, M., Ozawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+complex+anchoring+dystrophin+to+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma.</a> J Biochem. 108, 748-752 (1990).</li>
<li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).</li>
<li>Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+dystrophic+muscle+fibers+in+mdx+mouse+by+vital+staining+with+Evans+blue%3A+evidence+of+apoptosis+in+dystrophin-deficient+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle.</a> J Biochem. 118, 959-964 (1995).</li>
<li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li>
<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).</li>
<li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+muscle+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Modeling human muscle disease in zebrafish.</a> Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).</li>
<li>Cavanna, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+genetic+mapping+of+the+mouse+mdx+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus.</a> Genomics. 3, 337-341 (1988).</li>
<li>Bassett, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Horstick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stac3+is+a+component+of+the+excitation-contraction+coupling+machinery+and+mutated+in+Native+American+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy.</a> Nat Commun. 4, (1952).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li>
<li>Whitfield, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral.</a> , 123-241 (1996).</li>
<li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, (2013).</li>
<li>Waugh, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoxetine+prevents+dystrophic+changes+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.</li>
<li>Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+embryonic+and+larval+zebrafish+skeletal+myofibers+from+dissociated+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations.</a> J Vis Exp. 50259, (2013).</li>
<li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. 50925, (2013).</li>
<li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo.+marker+of+myofibre+damage%3A+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li>
<li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+isolation+and+characterization+of+a+splicing+mutant+of+zebrafish+dystrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin.</a> Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Majczenko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Mutation+of+CCDC78+in+a+Unique+Congenital+Myopathy+with+Prominent+Internal+Nuclei+and+Atypical+Cores%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum%22%5BJournal%5D)">Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores.</a> Am J Hum. , (2012).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Evans+blue+dye+to+compare+limb+muscles+in+exercised+young+and+old+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice.</a> Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen que compiten intereses financieros u otros conflictos de intereses.

El pez cebra se perfila como una herramienta poderosa para el estudio de 2,29 enfermedad neuromuscular. Hasta la fecha, el sistema de pez cebra se ha utilizado para validar que causan enfermedades nueva musculares mutaciones 16,17,30, dilucidar nuevos mecanismos patológicos 18, e identificar potencialmente nuevas drogas terapéuticas 12,24. Estos esfuerzos colectivos han establecido la utilidad del pez cebra para modelar enfermedades neuromusculares humanos. Sin embargo, a pesar de los avances realizados con modelos de pez cebra y mamíferos, hay opciones limitadas de tratamiento para los pacientes dentro del amplio espectro de condiciones neuromusculares. Por lo tanto, existe una gran demanda para el desarrollo de la terapia para este grupo de enfermedades devastadoras. Paralelamente a esta demanda para la terapéutica es la correspondiente necesidad de innovación experimental en curso, así como el análisis riguroso para verificar nuevos modelos animales y estrategias terapéuticas putativos. Análisis EBD se utiliza comúnmente en modelos de ratón detejido estudio y el daño celular en el cerebro, el corazón y el músculo esquelético 27,31. Más notablemente, EBD se utiliza ampliamente en modelos de ratón de diversos subtipos distrofia muscular para mostrar la gravedad de la inestabilidad muscular membrana y dañar 8. El uso de EBD para revelar daño de la membrana muscular es un parámetro de apoyo establecer similitudes del modelo animal para el estado de enfermedad humana 9. El poder de la EBD en el ratón ha llevado a varios laboratorios, incluido el nuestro, para desarrollar y aplicar EBD a los modelos de pez cebra de enfermedad neuromuscular. Debido a la aplicabilidad de análisis EBD, esta técnica se está aplicando activamente para corroborar modelos de pez cebra para el estado de enfermedad humana 11,15,22,24,32. Las larvas con las membranas musculares dañadas tendrá EBD absorción y fluorescencia roja, por lo tanto dentro de las fibras musculares. La fluorescencia observada en el espacio entre las fibras, pero no dentro de las fibras musculares individuales también pueden ser de carácter informativo de las fibras de desprendimiento de la membrana basal en tque la ausencia de daño de la membrana, proporcionando detalles de diagnóstico útil. Análisis EBD tiene aplicación potencial más allá de la validación de modelos animales. Los esfuerzos de nuestro laboratorio han demostrado recientemente que el análisis EBD es beneficioso en la validación de nuevos fármacos potencialmente terapéuticos 24. Determinar si los tratamientos terapéuticos potenciales reducir o abolir EBD captación en modelos de enfermedades neuromusculares puede significar acción terapéutica relevante 8. Este tipo de análisis puede ayudar a establecer el mecanismo (s) de la terapéutica y amplía la aplicación del análisis EBD. Al igual que con muchas técnicas, análisis EBD tiene varias advertencias que deben observarse durante el diseño y la práctica experimental. Por ejemplo, puede ser un reto para identificar el CCV debido a la engrosamiento del tejido con la edad. Además, es fácil dañar las larvas en la preparación antes y durante la inyección pericárdico, la reducción de los recuentos experimentales y el aumento de la necesidad de preparar un gran número de larvas.Además, el daño físico causado a las larvas durante la manipulación y la inyección podría dar lugar a falsos positivos como el músculo dañado puede tomar hasta EBD. Con el fin de superar algunos de estos obstáculos, hemos descrito una estrategia de co-inyección en este artículo de vídeo que permite la identificación fácil y fiable de las larvas con la infusión de colorante éxito inmediatamente después de la inyección y antes de posterior análisis. La controles co-inyección de FITC-dextrano para inyección éxito al permitir la confirmación de EBD en la vasculatura antes de su absorción por las fibras musculares. Esto puede ser particularmente útil como EBD fluorescencia se vuelve muy difusa en las larvas después de varias horas si no se recoge en las fibras musculares; como tal, puede ser difícil de detectar. Además, falta el CCV y la inyección de EBD en la yema o el cuerpo cavidad puede, después de la incubación, dar lugar a fluorescencia roja difusa similar a controlar embriones, sin embargo, con la reducción de la probabilidad de absorción por las fibras musculares dañadas. Colectivamente, estas cuevasats sugieren inyección EBD requiere paciencia y práctica para lograr resultados consistentes y fiables. En total, se describe un método práctico y sencillo para realizar el análisis EBD en larvas de pez cebra. Hasta la fecha, el uso del pez cebra como modelo de sistema, sobre todo como modelo de enfermedad humana, se ha expandido rápidamente. Esta expansión se debe en parte al desarrollo continuo y la modificación de las técnicas experimentales que mejoran sobre las ventajas actuales del sistema de pez cebra. La técnica de inyección EBD ofrece una herramienta adicional y potente al arsenal de un investigador para la validación y el estudio de modelos de enfermedad del músculo del pez cebra. La aplicación en curso y la modificación de esta técnica tiene el potencial de ayudar a descubrir nuevas estrategias terapéuticas, así como mecanismos de la enfermedad que causa.

Las distrofias musculares constituyen un grupo de enfermedades musculares humanas prevalentes y heterogéneas con características histopatológicas específicas1,2. Los síntomas típicamente asociados con este devastador grupo de enfermedades incluyen debilidad muscular, degeneración muscular, pérdida de motilidad y mortalidad temprana1,3. Los principales mecanismos patológicos de las distrofias musculares son la pérdida de proteínas que estabilizan el sarcolema, anclan los complejos transmembrana y median la señalización celular a través de la membrana4-6. Por ejemplo, la pérdida completa de la proteína distrofina, una proteína primaria del andamiaje del complejo distrofina-glicoproteína, resulta en la desestabilización de la membrana muscular en la distrofia muscular de Duchenne7. Debido a que la mayoría de las distrofias musculares son el resultado de mutaciones en proteínas que participan en el enlace entre la matriz extracelular y el citoesqueleto sarcolema, una observación común a nivel celular es la pérdida de la integridad sacrolemática8,9. Esta comprensión de los principales mecanismos patológicos asociados con las distrofias musculares es el producto de numerosos años de investigación empleando sistemas de modelos animales2,10-15. Sin embargo, a pesar de los avances en el campo, todavía hay opciones terapéuticas limitadas para el tratamiento o el manejo de la gama de subtipos de distrofia. Esta limitación de las terapias viables se debe a varios factores clave: 1) la dificultad de las estrategias de terapia génica, 2) una alta frecuencia de casos de enfermedad de novo y la correspondiente falta de modelos animales traducibles, y 3) la falta de estrategias rigurosas para probar las consecuencias fisiológicas de los agentes terapéuticos putativos con medidas de resultado claras y reproducibles.
Para superar algunas de estas limitaciones, numerosos laboratorios, incluido el nuestro, están empleando el pez cebra como sistema para modelar y estudiar las enfermedades neuromusculares humanas2. Hasta la fecha, el pez cebra ha demostrado ser una herramienta valiosa en la investigación de enfermedades. El modelo de pez cebra se ha utilizado para identificar y validar nuevas mutaciones causantes de enfermedades humanas16,17, dilucidar mecanismos causantes de enfermedades no caracterizados17,18 e identificar nuevas estrategias terapéuticas12,19. Estos avances se lograron, en parte, por las fortalezas canónicas del sistema del pez cebra, como su claridad óptica, la facilidad de manipulación genética y la capacidad de reproducirse en grandescantidades. Además, el pez cebra ha demostrado ser modificable a las pruebas de detección de drogas a gran escala21, un método valioso para la identificación de nuevas terapias22-24. En lo que respecta a la investigación de enfermedades musculares, estas fortalezas se complementan con la capacidad de aislar fibras musculares esqueléticas individuales de pez cebra a través de la disociación25 y por la capacidad de examinar la organización de las miofibras in vivo utilizando el fenómeno óptico llamado birrefringencia26, que colectivamente permite una determinación rápida de la integridad muscular macroscópica. Independientemente de estas utilidades disponibles, se requiere continuamente un mayor desarrollo de herramientas para avanzar en la investigación.
Nosotros, y otros, hemos adaptado un protocolo para la inyección y el análisis de EBD en el modelo de pez cebra. La EBD es un tinte vital permeable a las células que es absorbido por las células dañadas, degeneradas o apoptóticas y luego se visualiza bajo fluorescencia27. Hasta la fecha, el análisis de EBD se ha utilizado ampliamente para analizar la integridad de la membrana muscular en modelos murinos de enfermedades del músculo esquelético y del corazón8,9,27. Sin embargo, en las preparaciones de mamíferos, el músculo recolectado generalmente requiere una sección o disección laboriosa antes del análisis. En el pez cebra, el análisis directo es posible en grandes cantidades utilizando animales vivos e intactos. En este videoartículo, demostraremos la metodología para realizar la inyección y el análisis de EBD en larvas vivas de pez cebra, con imágenes representativas de la absorción de EBD en la línea mutante de distrofia de pez cebra sapje15,28. Además, presentamos una estrategia de co-inyección que permite una mayor cuantificación de las preparaciones de EBD.

<table><tbody><tr><td>Isotiocianato-dextrano de fluoresceína MW 10.000</td><td>Sigma</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Evan's Blue Dye</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm</td><td>Fischerbrand</td><td>FB0875712</td><td>Base de molde de inyección</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de pared delgada</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td>Para aguja de inyección</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td>Molde</td></tr> de <tr>inyección Molde de<td>microinyección</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>Molde de inyección</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Bioshop</td><td>SOD001</td><td>Solución de Ringer</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td>Solución de Ringer</td></tr><tr><td>Cloruro de magnessio hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>Solución de Ringer</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico monohidratado</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Solución de Ringer</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Solución de Ringer</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>Solución de Ringer</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C1061</td><td>Solución de Ringer</td></tr></tbody></table>

análisis de pez cebra larvas esquelético integridad del músculo con el colorante azul de evans

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

El modelo del pez cebra es un sistema emergente para el estudio de los trastornos neuromusculares. En el estudio de las enfermedades neuromusculares, la integridad de la membrana muscular es un determinante crítico de la enfermedad. Hasta la fecha, numerosas afecciones neuromusculares muestran fibras musculares en degeneración con integridad anormal de la membrana; Esto se observa con mayor frecuencia en las distrofias musculares. Evans Blue Dye (EBD) es un tinte vital permeable a las células que se incorpora rápidamente a las células degeneradas, dañadas o apoptóticas; Por el contrario, no es absorbido por las células con una membrana intacta. La inyección de EBD se emplea comúnmente para determinar la integridad muscular en modelos de ratón de enfermedades neuromusculares. Sin embargo, estos experimentos de EBD requieren disección y/o seccionamiento muscular antes del análisis. Por el contrario, la absorción de EBD en el pez cebra se visualiza en preparaciones vivas e intactas. Aquí, demostramos una metodología simple y directa para realizar inyecciones y análisis de EBD en peces cebra vivos. Además, demostramos una estrategia de coinyección para aumentar la eficacia del análisis de EBD. En general, este artículo de video proporciona un esquema para realizar la inyección y caracterización de EBD en modelos de pez cebra de enfermedad neuromuscular.

La mezcla de inyección EBD se inyectó en el CCV de mutantes homocigotos sapje y hermanos de tipo salvaje en 3 dpf. Las inyecciones que llenaron las cámaras del corazón (Figura 1B) y luego se analizaron para la inyección con éxito mediante la visualización de FITC-dextrano en la vasculatura bajo fluorescencia verde (Figura 2). Después de un periodo de incubación de 4 horas, EBD captación fue examinado a nivel somito mediante microscopía de fluorescencia. Hermanos de tipo salvaje no mostraron fluorescencia EBD dentro de las fibras musculares visibles (Figura 3A), mientras que los mutantes homocigotos sapje mostraron EBD captación, lo que indica daños en la membrana muscular 15 (Figura 3B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig1.jpg" /> Figura 1. mezcla de inyección Inyectar EBD en la vena cardinal común (CCV) de un embry pez cebrao. Embrión (A) no inyectados. Flecha indica la ubicación ideal para la inyección CCV. (B) la inyección exitosa en el CCV. El colorante entra en las cámaras del corazón (flecha) y comienza a ser bombeado a través de la vasculatura. (C) Una inyección CCV sin éxito dará lugar a algunos o todos el tinte de entrar en el saco vitelino del embrión (flecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig2.jpg" /> Figura 2. Los embriones se pueden ordenar para inyección con éxito mediante la observación de la distribución-FITC dextrano bajo fluorescencia verde en toda la vasculatura inmediatamente después de la inyección y antes de la EBD captación.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig3.jpg" /> Figura 3: EBD será absorbido por las fibras con las membranas dañadas hermanos (A) Wildtype que no muestran fluorescencia EBD en las fibras musculares.. (B) sapje mutante homocigotos con fluorescencia EBD dentro de las fibras musculares múltiples (flechas). Todas las larvas fueron inyectados con la mezcla de inyección EBD y se analizó después de un período de incubación de 4 horas a 3 dpf. Hermanos y mutantes fueron ordenados por el músculo de fibra desprendimiento antes de la inyección CCV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

En este estudio, describimos un método sencillo para realizar el análisis de Evans Blue Dye (EBD) en larvas de pez cebra. Esta técnica es una herramienta poderosa para la caracterización de la integridad del músculo esquelético y la delineación de modelos de distrofia muscular de pez cebra, y es un método valioso para el desarrollo de nuevas terapias.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

El objetivo general de la inyección de azul de Evans y dextrina Fitzy en la vena cardinal común es observar la integridad de la membrana del músculo esquelético en pececillos de cebra vivos, con el fin de ayudar a caracterizar los mecanismos causantes de enfermedades relacionados con diversos subtipos de distrofia muscular. La inyección de azul de Evans puede ayudar a descubrir los mecanismos biológicos que contribuyen a la patología de la enfermedad al caracterizar modelos animales de distrofia muscular, y también puede contribuir a nuestra comprensión de posibles mecanismos terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que puede realizarse y analizarse utilizando pececillos de cebra vivos.Además, la coinyección de Fitz Dextrin demuestra un control de calidad para una inyección exitosa, lo que mejora la rigurosidad y la cuantificación. Las implicaciones de esta técnica se relacionan con su utilidad en la validación de modelos de pez cebra para enfermedades musculares. También mejoran la comprensión de cómo ciertas mutaciones conducen a fenotipos de enfermedades musculares, como la distrofia muscular, lo cual es fundamental para encontrar tratamientos y curas.Para preparar placas de agar para inyección, hierva de dos a 3% de aros en medio E tres y deje que la solución se enfríe ligeramente sobre la bancada. Vierta aproximadamente 35 mililitros de agaros enfriado en cada placa de 100 milímetros. Luego coloque un extremo del molde de inyección preferido en la solución antes de colocar el resto del molde sobre la solución de agaros.Deje solidificar la solución de agar a temperatura ambiente o a cuatro grados Celsius durante aproximadamente 30 minutos. Luego, use una espátula para separar un extremo del molde del agar sólido y retire lentamente el resto del molde. Prepare un stock al 1 % de colorante azul de Evans o EBD en solución de Ringer 1x.Luego, prepare una solución stock de Fitzy Dextrin en solución Ringer 1x y almacénela a menos 20 grados Celsius. Para preparar la mezcla de inyección, diluya el EBD hasta 0,1 % directamente en la solución stock de Fitzy Dextrin, mezcle bien mediante vortexeo, y proteja de la luz directa envolviendo el tubo con papel de aluminio antes de la inyección. Precaliente la placa de inyección a temperatura ambiente.Coloque el micromanipulador sobre una placa de metal y colóquelo junto al microscopio de inyección. Encienda el controlador de microinyección accionado por aire. Luego, con aproximadamente dos a cuatro microlitros de la mezcla de EBD, rellene la aguja de inyección por detrás.A continuación, calibre el volumen de inyección con aproximadamente cinco nanolitros de la mezcla de EBD. Luego, use una solución de Ringer al 1x para humedecer la placa de inyección y elimine el exceso de solución de los pozos. Pretrate los larvas con trica al 0,04 % diluida en solución de Ringer al 1x para inmovilizar completamente las larvas antes de inyectarlas con una pipeta de vidrio. Coloque las larvas anestesiadas en los pozos de las placas de inyección de tornillo sinfín, asegurándose de que las larvas queden completamente dentro de los pozos, acostadas de lado.Retire la solución de trica en exceso para minimizar el movimiento de las larvas dentro del pocillo, pero deje suficiente para evitar la deshidratación. Coloque la placa de inyección con las larvas sobre un microscopio estereoscópico y posicione la aguja de la pipeta de inyección que contiene el EBD. Mueva la aguja sobre una larva de pez cebra cerca del corazón y aproximadamente a 45 grados del eje anterior-posterior.Inserte la aguja de inyección en la vena cardinaria común o CCV cerca de la porción anterior de la yema, donde la vena inicialmente gira en dirección dorsal. A continuación, inyecte cinco nanolitros de la mezcla de EBD y mantenga la aguja de inyección en posición durante cinco a ocho segundos. Para minimizar la fuga inmediata de la mezcla de EBD, una buena inyección mostrará el colorante en las cámaras cardíacas, y puede repetirse.Si EB DMX no se observa en el corazón inmediatamente después de una inyección exitosa, el embrión acumulará Fitz Dextrina en el sistema vascular como se muestra aquí. Después de inyectar el número deseado de larvas, devuélvalas a una solución de Ringer sin trica en placas de 100 milímetros para aumentar la tasa de supervivencia y mantener la intensidad de la señal. Mantenga las placas envueltas en papel de aluminio.Incube las larvas a 28,5 grados Celsius durante cuatro a seis horas para asegurar una absorción eficiente de EBD. Para visualizar el EBD en el músculo, use trica al 0,04 % para anestesiar las larvas antes de observarlas bajo fluorescencia roja. Se inyectó EBD en la CCV de mutantes homocigotos de Sapia y hermanos silvestres al 3D PF; las inyecciones que llenaron las cámaras cardíacas, como se muestra aquí, se analizaron luego para verificar la perfusión exitosa del colorante mediante la visualización de fitzy dextrina en la vasculatura bajo fluorescencia verde.Después de un período de incubación de cuatro horas, la absorción de EBD se examinó al nivel del somito, como se muestra en esta figura. Los hermanos de tipo silvestre no exhibieron fluorescencia de EBD dentro de ninguna fibra muscular visible, mientras que los mutantes homocigotos sapia mostraron absorción de EBD, lo que indica daño en la membrana muscular. Una vez que se domina la inyección eficaz del colorante azul de Evans en la vena cardinale común del pez cebra, las larvas pueden procesarse en 30 a 60 minutos, dependiendo del número de larvas que se inyecten.Además, los resultados experimentales pueden obtenerse en un solo día para garantizar la competencia. Es importante recordar apuntar cuidadosamente hacia la vena cardinal con el fin de producir resultados consistentes e interpretables. Esto puede ser un desafío y probablemente requerirá práctica tras seguir este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos, como análisis químicos y genéticos, para determinar los mecanismos moleculares responsables del daño de la membrana asociado con las distrofias musculares. Estos experimentos pueden ayudar a establecer nuevas estrategias terapéuticas para las enfermedades musculares tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación de enfermedades musculares exploraran la integridad de la membrana en modelos de pez cebra de distrofia muscular.Después de ver este video, debería tener una comprensión completa de cómo inyectar el colorante azul de Evans en la vena cardinales común de larvas de pez cebra. También debería comprender cómo identificar fibras musculares con daño de membrana debido a la presencia del colorante azul de Evans dentro de las fibras.

analysis-zebrafish-larvae-skeletal-muscle-integrity-with-evans-blue

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El pez cebra es un sistema emergente para modelar enfermedades humanas del músculo esquelético. Se describe un método rápido y eficaz para aislar las miofibrillas del músculo esquelético de pez cebra embrionario y larval. Este método proporciona una preparación de alta densidad miofibra adecuada para el estudio de la morfología sola fibra muscular esquelética, localización subcelular de proteínas, y la fisiología muscular.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

Mediciones de fuerza se pueden utilizar para demostrar los cambios en la función muscular debido al desarrollo, lesión, enfermedad, tratamiento o toxicidad química. En este vídeo, se demuestra un método para medir la fuerza durante una contracción máxima de los músculos del tronco larvas de pez cebra.

Medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra

El pez cebra es ahora una herramienta establecida y poderosa para modelar distrofias musculares, miopatías congénitas y enfermedades neuromusculares relacionadas. La birrefringencia y el comportamiento de escape evocado por el tacto son dos ensayos no invasivos comunes que se utilizan para determinar el grado de desorganización muscular y deterioro locomotor de los embriones de pez cebra durante el desarrollo temprano.

Análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape de evocación táctil

El músculo esquelético es esencial para la locomoción y es la tienda principal proteína de los cuerpos. Se describen las medidas de salud musculares dentro de C. elegans. Los posibles cambios en la estructura y la función muscular se evaluó a través de las buenas prácticas agrarias localizadas y colorantes catiónicos.

Métodos para evaluar subcelulares compartimentos de músculo en C. elegans

peces cebra son un excelente modelo para estudiar la función muscular y las enfermedades. Durante la embriogénesis temprana, el pez cebra comienza a realizar contracciones musculares regulares produciendo un comportamiento rítmico de natación, que se altera cuando el músculo se interrumpe. Aquí describimos una respuesta evocada por el tacto y un ensayo de locomoción para examinar el rendimiento de la natación como una medida de la función muscular.

Usando respuesta evocada-Touch y la locomoción ensayos para evaluar el rendimiento muscular y la función en el pez cebra

El análisis de elementos finitos es una herramienta de uso frecuente para investigar el rendimiento mecánico de estructuras bajo carga. Aquí aplicamos su uso para modelar la biomecánica de la mandíbula del pez cebra.

La construcción de modelos de elementos finitos para investigar pez cebra mandíbula Biomecánica

El objetivo de este protocolo es modificar la penetrancia de fenotipos mutantes esqueléticos letal en el pez cebra por cría selectiva. Mutantes letales no pueden cultivarse a la edad adulta y crían ellos mismos, por lo tanto este protocolo describe un método de seguimiento y selección de penetración a través de múltiples generaciones por prueba de progenie.

Cambio de penetrancia mutante esquelética letal de pez cebra por prueba de progenie

La regeneración del músculo esquelético es impulsada por las células madre musculares residentes en el tejido, que se ven afectadas en muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular, y esto resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. Aquí, describimos un protocolo que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular

Aquí, hemos utilizado la tinción de rojo alizarina para mostrar que la exposición al acetato de plomo causa un cambio de masa ósea en las larvas de pez cebra. Este método de tinción se puede adaptar a la investigación de la pérdida ósea en larvas de pez cebra inducida por otros tóxicos peligrosos.

Uso de tinción de rojo de alizarina para detectar la pérdida ósea inducida químicamente en larvas de pez cebra

La claridad óptica es una gran ventaja para el trabajo biológico y fisiológico celular en el pez cebra. Se describen métodos robustos para medir el crecimiento celular en animales individuales que permiten nuevos conocimientos sobre cómo el crecimiento del músculo esquelético y los tejidos vecinos se integran con el crecimiento de todo el cuerpo.

Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada

Este protocolo describe un modelo de criolesión para inducir daño profundo de varios miómeros caudales en peces cebra adultos. Este método proporciona un nuevo enfoque para estudiar la regeneración del músculo esquelético después de una pérdida severa de tejido en vertebrados no mamíferos.

Un modelo de criolesión para estudiar la regeneración del músculo esquelético del pedúnculo caudal en peces cebra adultos

Aprende a evaluar la integridad de la membrana muscular en larvas de pez cebra mediante inyección de azul de Evans. Esta técnica permite caracterizar modelos de distrofia muscular y desarrollar terapias potenciales en tiempo real.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

Explorar más videos