El estudio de la estequiometría de factor de crecimiento epidérmico en células intactas utilizando microscopía correlativa

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar la distribución y la estequiometría de los receptores del factor de crecimiento epidérmico o EGFR en la membrana plasmática de células intactas e hidratadas mediante microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica. Esto se logra primero cultivando células que expresan EGFR, como las células cos seven, sobre microchips con una membrana de nitruro de silicio de 50 nanómetros de espesor que cubre una zona central con forma de ventana. A continuación, las células se incuban con una versión biotinilada del factor de crecimiento epidérmico que se une al receptor y provoca un cambio en la conformación del EGFR, lo que lleva a su dimerización y activación.

A continuación, las células se fijan para inmovilizar los receptores y se incuban con puntos cuánticos conjugados despojados de Hagen que se unen a los receptores activados por EGF, y luego se obtienen imágenes de las células. Finalmente, una segunda fijación con glutaraldehído crea enlaces cruzados que unen el punto cuántico conjugado despojado al EGFR y estabilizan la muestra para microscopía electrónica. Los resultados muestran una emisión de fluorescencia roja mediante imágenes de puntos cuánticos fluorescentes, así como la distribución del EGFR, su estado estequiométrico o agrupamiento, mediante microscopía electrónica de transmisión de barrido.

Este método proporciona información única sobre la geometría y distribución del stock de receptores de membrana en células intactas y puede utilizarse para obtener información sobre la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico en células normales y en células cancerosas. También puede aplicarse para estudiar otros receptores de membrana, como los canales iónicos. Para comenzar, trabaje bajo una campana química. Para los primeros pasos de preparación de los microchips de membrana de nitruro de silicio y tras sumergirlos en acetona según el protocolo descrito, transfiera los microchips directamente a un vaso de precipitados con etanol y espere dos minutos; luego, retire los chips del etanol y colóquelos sobre un tejido de sala limpia.

Una vez que las chips estén secas, transfiéralas sobre un portaobjetos previamente colocado en una placa de Petri. Luego, coloque la tapa sobre la placa. A continuación, introduzca el portaobjetos con las microchips en un limpiador de plasma.

Realice un programa estándar de limpieza de cinco minutos para hacer hidrofílica la superficie de la membrana de nitruro de silicio. Luego, bajo la campana de flujo laminar, transfiera los microchips desde el vidrio. Deslícelos sobre un papel limpio antes de colocarlos en un pocillo de una placa de 24 pocillos lleno con solución de poli-L-lisina o PLL e incube durante cinco minutos.

Luego, transfiera uno por uno los microchips a un segundo pocillo que contenga agua de grado HPLC antes de enjuagarlos en un segundo pocillo con agua. Finalmente, coloque individualmente los microchips en los pocillos llenos de DM de una placa de 96 pocillos y coloque la placa en un incubador de dióxido de carbono utilizando un subcultivo de células COS-7. Prepare una suspensión celular monocelular con una concentración de aproximadamente cinco por diez a la décima.

Cinco células por mililitro. Añada una gota de la suspensión celular a cada microchip en la placa de 96 pocillos e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos con un microscopio invertido. Comience a examinar las áreas de los microchips para obtener una densidad aproximada de 20 a 30 células por ventana de 150 por 400 micrómetros.

Una vez que las células se hayan adherido suficientemente, transfiera cuidadosamente los microchips con el espaciado celular hacia arriba a nuevos pocillos que contengan dm. Cuando queden suficientes células adheridas, transfiera los microchips con las células hacia arriba a nuevos pocillos que contengan dmm sin suero. Posteriormente, incube los microchips a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono durante varias horas hasta la noche para los siguientes pasos.

Utilizando una placa de 96 pocillos, rellene los pocillos con las soluciones necesarias y use una columna por fila para cada microchip. Lave los microchips colocándolos en un pocillo con B-S-A-G-E-L-P-B-S fresco e incube a 37 °C durante cinco minutos. Transfiera los microchips a una solución de EGF biotinilado de 300 nM y colóquelos nuevamente en el incubador durante tres minutos, ya que las células comenzarán a internalizar el EGF marcado en el EGFR.

Use rápidamente PBS para enjuagar los microchips tres veces. Luego, use tampón de catecolamina 0,1 molar o CB para enjuagar las muestras. A continuación, transfiera los microchips a PFA al 3% e incube durante 10 minutos.

Después de enjuagar una vez con CB y tres veces con PBS, transfiera los chips a G-L-Y-P-B-S e incube durante dos minutos. Luego, use PBS para enjuagar dos veces. Ahora, coloque los microchips en S-T-R-Q-D 10 NANOMOLAR durante 10 minutos antes de enjuagar cuatro veces con B-S-A-P-B-S.

Luego, sumerja un microchip en una placa de 35 milímetros con fondo de vidrio previamente llenada con B-S-A-P-B-S a temperatura ambiente para observar las células mediante microscopía DIC y de fluorescencia. Utilice un objetivo de aire de 40 x para obtener imágenes generales de las células marcadas con QD 6 55. Use un cubo de filtros que excite los puntos cuánticos entre 340 y 380 nanómetros con emisión por encima de 420 nanómetros.

Minimice la intensidad de la luz para evitar dos luces intensas que podrían dañar la muestra. Establezca el tiempo de exposición en al menos 300 milisegundos para que se capturen las señales de todos los puntos cuánticos, ya que la fluorescencia de los puntos cuánticos parpadea; ajuste la intensidad de la luz y la amplificación para obtener imágenes brillantes sin ruido visible en la imagen, al mismo tiempo que se minimiza la intensidad de la luz. Después de la adquisición de imágenes, coloque nuevamente el microchip en una placa de 96 pocillos con B-S-A-P-B-S.

Lave una vez con cb, luego transfiera a un 2 % de glutaraldehído e incube durante 10 minutos más. Lave y use B-S-A-P-B-S para lavar el microchip tres veces; guárdelo en pozos de B-S-A-P-B-S previamente llenos en una nueva placa de 96 pozos para cada microchip. Llene una fila de cuatro pozos con agua grado HPLC.

Después de configurar el ESEM según el protocolo descrito, cargue una muestra en la etapa STEM ESEM pre-COOL sacando la placa de 96 WAT del recipiente refrigerado y colocándola cerca de la etapa ESEM abierta. Coloque un paño de sala limpia al lado. Enjuague rápidamente un microchip sumergiéndolo cuatro veces durante un segundo cada vez en un pocillo lleno de agua grado HPLC.

Seque brevemente el reverso del microchip sobre el tejido y colóquelo en la etapa previamente enfriada con tres microlitros de agua grado HPLC enfriada. Humedezca la superficie de la muestra y fije la muestra en la etapa. A continuación, coloque tres gotas adicionales de agua de tres microlitros sobre la etapa cerca de la muestra y cierre la cámara de especímenes.

Después de identificar una célula de interés, según el protocolo descrito en el texto registre una imagen general de STEM de la célula, muévase a una región periférica de la célula donde sea visible el borde celular y aumente hasta una magnificación de 50.000 X. Registre imágenes que muestren puntos cuánticos individuales y utilice tiempos de permanencia del píxel de 20 a 30 microsegundos. Aquí se muestran puntos cuánticos 655 marcados con EGFR unido a la membrana en células COS siete intactas y completamente hidratadas. La imagen de DIC ilustra la topografía de la membrana de las células y la imagen de fluorescencia correspondiente muestra la distribución de EGFR en toda la superficie de la célula tras tres minutos de incubación con biotina-EGF.

Estas imágenes de STEM en ESEM de baja magnificación revelan estructuras finas, como filopodios que se extienden desde la célula hacia las células vecinas, y algunas estructuras dentro de las regiones celulares más delgadas. Las regiones celulares centrales gruesas, incluyendo el núcleo, aparecen blancas porque la transmisión a través de la muestra no es posible para electrones de la energía utilizada. Alta resolución.

Las imágenes de STEM en ESEM de las regiones periféricas más delgadas muestran etiquetas de puntos cuánticos en un pliegue de membrana que cruza diagonalmente la imagen. Esta estructura de membrana presenta una densidad de EGFR mayor que las regiones de membrana circundantes en varios lugares, y dos etiquetas se encontraban en proximidad cercana. Se indican dos ejemplos con distancias de 20 y 24 nanómetros mediante puntas de flecha.

Se interpretó que estos pares de etiquetas pertenecen a EGFR. Esta imagen fue registrada de una región con una densidad de EGFR y una señal fluorescente más bajas. No obstante, también se encontró EGFR aquí en dímeros, y estaban presentes dos agrupaciones de 10 o 11 EEG.

Una vez dominada, la preparación de la muestra puede realizarse en menos de dos horas, mucho más rápido que las técnicas comúnmente utilizadas para microscopía electrónica. La posterior imagenología STEM essem puede proporcionar hasta 100 imágenes de alta resolución en medio día.