Monitoreo de la homeostasis del calcio del retículo endoplasmático Usando una

El objetivo general del siguiente experimento consiste en monitorear la alteración del calcio del retículo endoplasmático a lo largo del tiempo mediante el uso de una proteína reportera secretada. Esto se logra mediante la transgénesis mediada por vectores virales en el tejido diana, específicamente el hígado. En este ejemplo, con el reportero Gai luciferasa circa, se recoge un fluido biológico posterior, como la sangre, con el fin de medir la cantidad de circa liberado desde el tejido; luego, se añade el sustrato de luciferasa a las muestras de plasma y se mide la luminiscencia para determinar la disminución del calcio en el retículo endoplasmático.

Los resultados muestran una alteración en el calcio del RE, indicada por niveles elevados de C en plasma. La homeostasis del RE puede monitorearse durante períodos prolongados mediante el muestreo repetido de pequeños volúmenes de fluidos biológicos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como colorantes de baja afinidad para calcio o indicadores de calcio codificados genéticamente, es que la homeostasis del calcio en el RE puede monitorearse in vivo a lo largo del tiempo mediante un procedimiento mínimamente invasivo. Existen dos vías terapéuticas para esta técnica.

El primero consiste en realizar un cribado de fármacos que puedan mantener o restablecer la homeostasis del calcio en el RE a un estado fisiológico normal. El segundo enfoque consiste en modificar la proteína terapéutica para convertirla en AMPs terapéuticos, donde la secreción ocurre en respuesta a la disminución del calcio en el RE. Aunque este método puede proporcionar información sobre la disregulación del calcio en el RE en el hígado.

También se puede aplicar a otros sistemas orgánicos como el cerebro, el corazón, el músculo o el páncreas. Después de anestesiar una rata dolly sprat, según el protocolo descrito, aplique una pomada oftálmica y realice una compresión en la cola para verificar la anestesia; afeite la región del abdomen ligeramente por debajo de las costillas hasta la zona media del abdomen y limpie el área quirúrgica tres veces, alternando Betadine y etanol al 70 %. A continuación, coloque la rata en posición supina sobre un campo quirúrgico estéril, cúbrala con campos quirúrgicos estériles y diluya una muestra de gluc a v a la concentración optimizada por el usuario.

En este caso, utilizamos 7,6 veces 10 a la novena de genomas virales por mililitro y mezclamos invirtiendo el tubo. Luego, pipetee 105 microlitros del A a V diluido en una placa estéril y use una aguja de calibre 30 para recoger el virus en una jeringa. Marque el sitio de incisión objetivo para exponer el hígado e inyectar utilizando un escalpelo.

Realice una incisión horizontal de aproximadamente dos a tres centímetros de longitud debajo de la caja torácica. Practique una disección por separación para separar el tejido conectivo del hipodermis. Corte el músculo abdominal para exponer el lóbulo medial derecho del hígado.

A continuación, coloque el animal bajo un microscopio quirúrgico y ajústelo para visualizar el lóbulo medio derecho del hígado. Luego, utilizando la jeringa, inyecte un tercio del volumen total del virus en tres sitios del parénquima del lóbulo medio derecho, dejando la aguja en el tejido durante cinco a 10 segundos tras cada inyección para asegurar la administración completa del volumen inyectado. Suture el músculo abdominal y el corte, y utilice un aplicador de algodón para aplicar Neosporin. Coloque la rata en una cámara de recuperación hasta que recupere la conciencia y pueda mantener una posición erecta antes de devolverla a su jaula individual.

De cuatro a siete días después de la inyección. Prepare los tubos para la recolección de sangre etiquetándolos y pesándolos previamente. Luego añada 50 microlitros de 1000 unidades por mililitro de heparina a cada tubo.

Después de anestesiar la rata según el protocolo descrito, realice una compresión del rabo para verificar la sedación y, utilizando tijeras estériles, corte la punta del rabo aproximadamente de uno a dos milímetros desde el extremo. Recolecte más de 100 microlitros de sangre gota a gota en un tubo previamente llenado con heparina para detener el sangrado.

Utilice un aplicador de algodón húmedo para aplicar el polvo de STIC a la cola. Utilice una torunda con etanol para limpiar las tijeras y esterilice por calor entre cada recolección. Almacene los tubos de sangre a cuatro grados Celsius.

Si se recogen muestras posteriores, pese los tubos de recolección y ajuste la cantidad de heparina para obtener una proporción de dos a uno entre sangre y heparina. Este paso normalizará la cantidad de heparina en cada muestra. Centrifugue los tubos a 2000 ×g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos.

Transfiera el sobrenadante de plasma a un tubo nuevo y almacénelo a cuatro grados Celsius durante un máximo de 72 horas o a menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo para el ensayo de luciferasa para administrar thaa garin como control positivo. Diluya en etanol hasta una concentración final de 2,5 miligramos por mililitro. Luego inyecte un miligramo por kilogramo por vía intraperitoneal en la parte inferior del abdomen.

Tomar la primera muestra de sangre a las 24 horas posteriores a la inyección, como se describió anteriormente. Para medir la luminiscencia. Prepare el sustrato de trabajo de selen ezina según el protocolo descrito en el texto e incubar a temperatura ambiente protegido de la luz durante 30 minutos.

Mientras tanto, descongele todas las muestras sobre hielo y transfiera 10 microlitros de plasma a una placa de paredes opacas utilizando un lector de placas capaz de monitorear la bioluminiscencia y equipado con un inyector de sustrato. Purgue las líneas con sustrato. Inyecte 100 microlitros de sustrato en un pocillo.

Agite durante cinco segundos a velocidad media y mida la emisión de luz para muestras in vitro. Integre la emisión de luz durante 0,5 segundos para el paso de lectura y, para muestras in vivo, integre durante cinco segundos en el paso de lectura para evaluar la homeostasis del calcio. Mediante el Método Gluc SAR Camp, se pueden incluir varios controles, como un reportero secretado constitutivamente, como Gluc Noag en este caso.

Un aumento en los niveles extracelulares de ambos GLUC SAR camp y Gluc noag en respuesta a condiciones experimentales se consideraría un resultado ambiguo. Sin embargo, un aumento en la secreción de gluc SAR camp sin respuesta de gluc noag respalda un evento dependiente del calcio del RE. Pueden utilizarse moduladores farmacológicos del almacén de calcio del RE para confirmar la contribución del calcio del RE a la liberación de SAR camp en nuevos paradigmas.

Por ejemplo, tal como se demuestra aquí, la dantroleno, un antagonista del receptor INE que estabiliza el calcio del retículo endoplásmico, inhibe la liberación de SAR camp en respuesta al argón tico en estudios in vitro que utilizan SAR camp basado en glucosa; la respuesta inducida por el tratamiento se evalúa mejor a lo largo del tiempo. Al rastrear los cambios en la respuesta relativa dentro de una placa frente a los controles, no es recomendable comparar los valores brutos entre varias placas, donde la degradación del sustrato puede provocar cambios en los valores crudos. Para estudios in vivo, los datos deben evaluarse independientemente para cada animal, con cada animal actuando como su propio control previo al tratamiento.

Esto es necesario para tener en cuenta la variabilidad en la entrega y expresión del transgén entre los animales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la tecnología sircam para investigar la regulación del calcio en el retículo endoplásmico en modelos roedores de enfermedad hepática. No olvide que el trabajo con vectores virales puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado, al realizar este procedimiento.