Name: Monitoreo de la homeostasis del calcio del retículo endoplasmático Usando una Gaussia Luciferasa SERCaMP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a monitorear la homeostasis del calcio del retículo endoplásmico usando SERCaMP con luciferasa Gaussia en tejido hepático. Este método permite evaluación mínimamente invasiva en modelos in vivo.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas. Agradecemos a Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuño y Josh Hinkle por sus contribuciones al desarrollo de este método.

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<li>Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin+amplifies+the+platelet+procoagulant+response+caused+by+thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin.</a> Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
<li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li>
<li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li>
<li>Hareendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+in+gene+therapy%3A+immune+challenges+and+strategies+to+circumvent+them%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.</a> Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo pone de relieve la in vitro e in vivo de utilidad Gluc-SERCaMP para supervisar el agotamiento de calcio ER. Aunque la modificación de proteínas para generar SERCaMP parece generalizarse a otras proteínas reportero 12, elegimos Gaussia luciferasa por su robusta (200-1.000 mayor veces) bioluminiscencia en comparación con otras luciferasas 18. Demostramos detectable inducida thapsigargin de liberación Gluc-SERCaMP a través de un rango de dosis de 100 veces de virus Glu...

Las funciones en muchas capacidades celulares incluyendo plegamiento de proteínas, la secreción de proteínas, homeostasis de los lípidos, y de señalización intracelular 1 retículo endoplasmático (ER). Central a la función normal ER es mantener las concentraciones de calcio luminal a ~ 5.000 veces mayores que se encuentran en el citoplasma 2-4. Este proceso intensivo de energía está regulado por la ATPasa de calcio Sarco / retículo endoplásmico (SERCA), una bomba que mueve iones de calcio en la sala de emergencias. Flujo de calcio desde el ER está mediada principalmente por la rianodina (RyR) e inositol trifosfato (IP3R) receptores. Debido a que muchos procesos ER son dependientes de calcio, lo que altera la tienda puede conducir a estrés ER y la muerte celular eventual. ER desregulación de calcio se ha observado en enfermedades como la cardiopatía, la diabetes, el Alzheimer y el Parkinson 5. Debido a la naturaleza progresiva de estas enfermedades, ha sido un reto para delinear la causa-efecto relación entre patogénesis y alteraciones en la tienda de calcio ER. Varias tecnologías han permitido importantes avances en nuestra comprensión de la dinámica del calcio ER, incluyendo colorantes e indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis). Baja afinidad colorantes de calcio, que aumentan en la fluorescencia cuando se une a Ca 2+, se pueden cargar en las células para examinar compartimentos subcelulares con altas concentraciones de calcio 6. Gecis, tales como D1ER y el receptor permite la monitorización de las fluctuaciones de calcio con un control más preciso de la localización subcelular 7-9. Recientemente, otra clase de Gecis llama indicadores de proteínas de orgánulos atrapado en calcio de medición (CEPIA) se han descrito 10. Un tercer enfoque que combina la genética y la química pequeña molécula es-esterasa específica colorante de carga (TED), que utiliza una carboxilesterasa codificado genéticamente (dirigido a la ER) con un colorante de calcio a base de éster 11. Mientras que el AFORenfoques ementioned tienen fortalezas y debilidades inherentes, pueden proporcionar información valiosa sobre la dinámica del calcio ER a través de mediciones agudos de fluorescencia. Ellos son, sin embargo, no es óptimo para los estudios longitudinales a menudo necesarias para investigar la progresión de la enfermedad. Con el objetivo de diseñar un método para controlar la dinámica del calcio durante períodos prolongados de tiempo, hemos identificado y desarrollado una modificación de proteínas para crear las proteínas secretadas calcio ER monitoreo (SERCaMPs) 12. SERCaMP sortea varias limitaciones asociadas con otras metodologías, proporcionando un método mínimamente invasivo para interrogar en varias ocasiones el almacén de calcio ER. Hemos demostrado anteriormente que la ASARTDL péptido carboxi-terminal (alanina-serina-alanina-arginina-treonina-ácido aspártico-leucina) es suficiente para promover la retención de ER; Sin embargo, bajo condiciones que causan disminuciones en calcio ER, la secuencia del péptido ya no es capaz de retener localizatio ERn y la proteína es secretada 13. La base de la tecnología SERCaMP es el apéndice de ASARTDL a la carboxi-terminal de una proteína secretada (por ejemplo, luciferasa Gaussia, o gluc) de modo que la secreción es provocada por el agotamiento de calcio ER, creando así un reportero robusta de ER disregulación de calcio 12. La expresión de Gluc-SERCaMP a través de métodos transgénicos permite fluidos biológicos incluyendo medio de cultivo celular y plasma a analizar los cambios en la actividad gluc como un indicador de la homeostasis del calcio ER. El método tiene aplicaciones para el estudio longitudinal de alteraciones progresivas en la tienda de calcio ER tanto in vitro como in vivo. El siguiente protocolo se escribe como un esquema general para el uso de SERCaMP basado en gluc para estudiar la homeostasis del calcio ER, pero el protocolo puede servir como una guía para SERCaMPs informadores alternativos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 1,5 ml Fisher</td><td>&nbsp;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>Solución NP-40 al 10%&nbsp;</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td>para ensayos intracelulares GLuc</td></tr> 1 <tr><td>ml jeringas luer-lok</td><td>Fisher</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>200 puntas de filtro de microlitros</td><td>Rainin</td><td>RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0 suturas quirúrgicas</td><td>Fisher</td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>agujas de 30 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-821-13A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Láminas de sellado de microplacas adhesivas</td><td>Thermo</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación con alcohol</td><td>Fisher</td><td>22-246-073</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Auto Flow System</td><td>E-Z Anesthesia</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuperación de animales</td><td>Lyon Vet</td><td>ICU-912-004</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Solución de betadine</td><td>Fisher</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Suero de crecimiento bovino</td><td>Thermo</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazina, Native</td><td>Regis Technologies</td><td>1-361204-200</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de corte 3/8 suturas circulares</td><td>WPI</td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador ultrascónico digital</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alto contenido de glucosa, GlutaMAX, piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de masa de ADN</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia luciferasa (proteína recombinante)</td><td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de gauzsia luciferasa (para WB, ICC o IHC)</td><td>New England Biolabs</td><td>E8023S</td><td>1:2.000 (WB)</td></tr><tr><td>Germinador 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>Placas de ensayo Gluc (96 pocillos, opacas)</td><td>Fisher</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Butler Schein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Stop Polvo estíptico</td><td>Butler Schein</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>a452-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R Centrífuga</td><td>Bekman Colter</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Fisher</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscopio</td><td>Nikon Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel y limpieza de PCR</td><td>Pipeta Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Rainin</td><td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 Lenti-X kit de titulación rápida</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>Sello de película PCR</td><td>Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>ReFresh Bote de filtro de carbón</td><td>E-Z Anesthesia</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí, #10</td><td>Fine Science tools Inc</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Ratas SD 150-200 g</td><td>Río Charles</td><td>Ratas</td><td>ratas ordenadas a 150-200 g.&nbsp; Cirugía 5 días después de la llegada</td></tr><tr><td>Marcas auriculares de animales pequeños</td> National <td>Band and Tag co</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Paños quirúrgicos estériles</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 lector de placas</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems 4304437</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>perjudicial para salud humana</td></tr><tr><td>Virapower mezcla de envasado lentiviral</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>Xfect Reactivo de transfección</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Valley Vet</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoreo de la homeostasis del calcio del retículo endoplasmático usando una<em&gt; gaussia</em&gt; luciferasa sercamp

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

El retículo endoplasmático (ER) contiene el mayor nivel de calcio intracelular, con concentraciones aproximadamente 5000 veces mayor que los niveles citoplasmáticos. El control estricto sobre el calcio ER es imprescindible para el plegamiento de proteínas, la modificación y la trata. Las perturbaciones a ER de calcio pueden dar lugar a la activación de la respuesta de la proteína desplegada, un mecanismo de respuesta de estrés ER de tres patas, y contribuir a la patogénesis de una variedad de enfermedades. La capacidad de monitorear alteraciones de calcio ER durante el inicio de la enfermedad y la progresión es importante en principio, pero difícil en la práctica. Los métodos actualmente disponibles para el monitoreo de calcio ER, tales como tintes y proteínas fluorescentes dependientes de calcio, han proporcionado información sobre la dinámica del calcio ER en las células, sin embargo estas herramientas no son muy adecuados para estudios in vivo. Nuestro laboratorio ha demostrado que una modificación en el carboxi-terminal de la luciferasa Gaussia confiere la secreción del reportero en respuesta aEl agotamiento de calcio ER. Los métodos para utilizar una luciferasa basado, proteína de monitoreo de calcio ER secretada (SERCaMP) para in vitro e in aplicaciones in vivo se describen en el presente documento. Este vídeo destaca inyecciones hepáticas, la manipulación farmacológica de Gluc-SERCaMP, extracción de sangre y el procesamiento y los parámetros de ensayo para el control longitudinal de calcio ER.

El método Gluc-SERCaMP permite la evaluación de la homeostasis del calcio ER mediante el muestreo de fluidos extracelulares. Varios controles pueden ser incluidas en el diseño experimental para mejorar la interpretación de los resultados. En primer lugar, el uso de un reportero constitutivamente secretada (por ejemplo, gluc sin la ASARTDL C-terminal o &quot;Gluc-No Tag&quot;) se puede emplear para evaluar los efectos de los tratamientos experimentales en la vía secretora (secreción celular global) y la expresió...

La homeostasis del calcio del retículo endoplásmico se ve alterada en diversas patologías. Se puede utilizar un indicador de proteína de monitoreo de calcio del RE (SERCaMP) para detectar interrupciones en el almacenamiento de calcio del RE. Este protocolo describe el uso de una SERCaMP de Gaussia luciferasa para examinar la homeostasis del calcio del RE in vitro e in vivo.

Monitoreo de la homeostasis del calcio del retículo endoplasmático Usando una<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasa SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en monitorear la alteración del calcio del retículo endoplasmático a lo largo del tiempo mediante el uso de una proteína reportera secretada. Esto se logra mediante la transgénesis mediada por vectores virales en el tejido diana, específicamente el hígado. En este ejemplo, con el reportero Gai luciferasa circa, se recoge un fluido biológico posterior, como la sangre, con el fin de medir la cantidad de circa liberado desde el tejido; luego, se añade el sustrato de luciferasa a las muestras de plasma y se mide la luminiscencia para determinar la disminución del calcio en el retículo endoplasmático.Los resultados muestran una alteración en el calcio del RE, indicada por niveles elevados de C en plasma. La homeostasis del RE puede monitorearse durante períodos prolongados mediante el muestreo repetido de pequeños volúmenes de fluidos biológicos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como colorantes de baja afinidad para calcio o indicadores de calcio codificados genéticamente, es que la homeostasis del calcio en el RE puede monitorearse in vivo a lo largo del tiempo mediante un procedimiento mínimamente invasivo. Existen dos vías terapéuticas para esta técnica.El primero consiste en realizar un cribado de fármacos que puedan mantener o restablecer la homeostasis del calcio en el RE a un estado fisiológico normal. El segundo enfoque consiste en modificar la proteína terapéutica para convertirla en AMPs terapéuticos, donde la secreción ocurre en respuesta a la disminución del calcio en el RE. Aunque este método puede proporcionar información sobre la disregulación del calcio en el RE en el hígado.También se puede aplicar a otros sistemas orgánicos como el cerebro, el corazón, el músculo o el páncreas. Después de anestesiar una rata dolly sprat, según el protocolo descrito, aplique una pomada oftálmica y realice una compresión en la cola para verificar la anestesia; afeite la región del abdomen ligeramente por debajo de las costillas hasta la zona media del abdomen y limpie el área quirúrgica tres veces, alternando Betadine y etanol al 70 %. A continuación, coloque la rata en posición supina sobre un campo quirúrgico estéril, cúbrala con campos quirúrgicos estériles y diluya una muestra de gluc a v a la concentración optimizada por el usuario.En este caso, utilizamos 7,6 veces 10 a la novena de genomas virales por mililitro y mezclamos invirtiendo el tubo. Luego, pipetee 105 microlitros del A a V diluido en una placa estéril y use una aguja de calibre 30 para recoger el virus en una jeringa. Marque el sitio de incisión objetivo para exponer el hígado e inyectar utilizando un escalpelo.Realice una incisión horizontal de aproximadamente dos a tres centímetros de longitud debajo de la caja torácica. Practique una disección por separación para separar el tejido conectivo del hipodermis. Corte el músculo abdominal para exponer el lóbulo medial derecho del hígado.A continuación, coloque el animal bajo un microscopio quirúrgico y ajústelo para visualizar el lóbulo medio derecho del hígado. Luego, utilizando la jeringa, inyecte un tercio del volumen total del virus en tres sitios del parénquima del lóbulo medio derecho, dejando la aguja en el tejido durante cinco a 10 segundos tras cada inyección para asegurar la administración completa del volumen inyectado. Suture el músculo abdominal y el corte, y utilice un aplicador de algodón para aplicar Neosporin. Coloque la rata en una cámara de recuperación hasta que recupere la conciencia y pueda mantener una posición erecta antes de devolverla a su jaula individual.De cuatro a siete días después de la inyección. Prepare los tubos para la recolección de sangre etiquetándolos y pesándolos previamente. Luego añada 50 microlitros de 1000 unidades por mililitro de heparina a cada tubo.Después de anestesiar la rata según el protocolo descrito, realice una compresión del rabo para verificar la sedación y, utilizando tijeras estériles, corte la punta del rabo aproximadamente de uno a dos milímetros desde el extremo. Recolecte más de 100 microlitros de sangre gota a gota en un tubo previamente llenado con heparina para detener el sangrado.Utilice un aplicador de algodón húmedo para aplicar el polvo de STIC a la cola. Utilice una torunda con etanol para limpiar las tijeras y esterilice por calor entre cada recolección. Almacene los tubos de sangre a cuatro grados Celsius.Si se recogen muestras posteriores, pese los tubos de recolección y ajuste la cantidad de heparina para obtener una proporción de dos a uno entre sangre y heparina. Este paso normalizará la cantidad de heparina en cada muestra. Centrifugue los tubos a 2000 ×g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos.Transfiera el sobrenadante de plasma a un tubo nuevo y almacénelo a cuatro grados Celsius durante un máximo de 72 horas o a menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo para el ensayo de luciferasa para administrar thaa garin como control positivo. Diluya en etanol hasta una concentración final de 2,5 miligramos por mililitro. Luego inyecte un miligramo por kilogramo por vía intraperitoneal en la parte inferior del abdomen.Tomar la primera muestra de sangre a las 24 horas posteriores a la inyección, como se describió anteriormente. Para medir la luminiscencia. Prepare el sustrato de trabajo de selen ezina según el protocolo descrito en el texto e incubar a temperatura ambiente protegido de la luz durante 30 minutos.Mientras tanto, descongele todas las muestras sobre hielo y transfiera 10 microlitros de plasma a una placa de paredes opacas utilizando un lector de placas capaz de monitorear la bioluminiscencia y equipado con un inyector de sustrato. Purgue las líneas con sustrato. Inyecte 100 microlitros de sustrato en un pocillo.Agite durante cinco segundos a velocidad media y mida la emisión de luz para muestras in vitro. Integre la emisión de luz durante 0,5 segundos para el paso de lectura y, para muestras in vivo, integre durante cinco segundos en el paso de lectura para evaluar la homeostasis del calcio. Mediante el Método Gluc SAR Camp, se pueden incluir varios controles, como un reportero secretado constitutivamente, como Gluc Noag en este caso.Un aumento en los niveles extracelulares de ambos GLUC SAR camp y Gluc noag en respuesta a condiciones experimentales se consideraría un resultado ambiguo. Sin embargo, un aumento en la secreción de gluc SAR camp sin respuesta de gluc noag respalda un evento dependiente del calcio del RE. Pueden utilizarse moduladores farmacológicos del almacén de calcio del RE para confirmar la contribución del calcio del RE a la liberación de SAR camp en nuevos paradigmas.Por ejemplo, tal como se demuestra aquí, la dantroleno, un antagonista del receptor INE que estabiliza el calcio del retículo endoplásmico, inhibe la liberación de SAR camp en respuesta al argón tico en estudios in vitro que utilizan SAR camp basado en glucosa; la respuesta inducida por el tratamiento se evalúa mejor a lo largo del tiempo. Al rastrear los cambios en la respuesta relativa dentro de una placa frente a los controles, no es recomendable comparar los valores brutos entre varias placas, donde la degradación del sustrato puede provocar cambios en los valores crudos. Para estudios in vivo, los datos deben evaluarse independientemente para cada animal, con cada animal actuando como su propio control previo al tratamiento.Esto es necesario para tener en cuenta la variabilidad en la entrega y expresión del transgén entre los animales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la tecnología sircam para investigar la regulación del calcio en el retículo endoplásmico en modelos roedores de enfermedad hepática. No olvide que el trabajo con vectores virales puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe un método para la medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial de imagen fluorescente. El método se aprovecha de una circular permutaciones YFP basada en sensor de calcio de doble excitación radiométrica (radiométrica pericam-mt) expresa selectivamente en las mitocondrias.

Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

El retículo endoplasmático juega un papel clave en la biogénesis de proteínas y en la homeostasis del calcio. Hemos establecido un sistema experimental que nos permite abordar el papel de los canales de Ca2 + de fugas y para caracterizar sus mecanismos de regulación putativo. Este sistema consiste en el silenciamiento de genes mediada por siRNA y de células vivas imágenes de Ca2 +.

Imágenes en vivo del calcio celular combinado con el silenciamiento de genes mediada por siRNA Identifica Ca 2 + Canales de fugas en la membrana del ER y sus mecanismos de regulación

La extensión de la tienda que funciona con...

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Fuente: Bannai, H., et. al., Disección de señales locales de Ca2+ en células cultivadas por indicadores de Ca2+ dirigidos a la membrana. J. Vis. Exp. (2019)El video demuestra imágenes de fluorescencia para observar la dinámica espontánea del calcio específica del compartimento en los astrocitos mediante el monitoreo secuencial de proteínas sensibles al calcio localizadas en la membrana plasmática y el retículo endoplásmico.

Imágenes espontáneas de calcio para la dinámica específica del compartimento en astrocitos

Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED) es compatible con el análisis de la dinámica del almacén de calcio intracelular por imágenes de fluorescencia. El método basa en la orientación de un carboxilesterasa recombinante para el retículo endoplásmico (ER), donde mejora el desenmascaramiento local del sintético de baja afinidad...

Direct Imaging de calcio ER con Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED)

Actualmente, la mayoría de los indicadores de calcio disponibles se utilizan para cuantificar los transitorios de calcio citoplasmático como medidas indirectas del calcio liberado del retículo sarcoplásmico en células de músculo liso cultivadas. Este protocolo describe el uso de un indicador específico basado en FRET que permite la medición directa de las señales de calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico.

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Presentamos protocolos para la aplicación de nuestro indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) CatchER + para el monitoreo de transitorios rápidos de calcio en el retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 y células C2C12 de músculo esquelético usando microscopía de fluorescencia en tiempo real. También se discute un protocolo para la medición y calibración in situ K d .

Seguimiento de la liberación de calcio ER / SR con el Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor de Captura<supUnesdoc.unesco.org unesdoc.unesco.org</sup

Este protocolo describe un método sencillo para analizar las señales de calcio en las plantas generadas por hemipteran insectos, como pulgones. Thaliana de Arabidopsis transformada con el biosensor de calcio GFP GCaMP3 permiten la proyección de imagen en tiempo real en vivo de la dinámica de calcio con una alta resolución temporal y espacial.

En tiempo real en Vivo la grabación de señales de calcio Arabidopsis durante la alimentación de insectos utilizando un Biosensor fluorescente

Aquí presentamos un protocolo de Ca2 + proyección de imagen en neuronas y células gliales, que permite la disección de Ca2 + señales con resolución subcelular. Este proceso es aplicable a todo tipo de celular que permiten la expresión de indicadores de Ca2 + genéticamente codificados.

Disección de Local Ca2 + señales en las células cultivadas por membrana dirigidos Ca2 + indicadores

Este protocolo describe un enfoque para la realización de imágenes de calcio en organoides intestinales humanos infectados por virus y ofrece un enfoque para el análisis.

Obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente

Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.

Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas

Aprende a monitorear la homeostasis del calcio del retículo endoplásmico usando SERCaMP con luciferasa Gaussia en tejido hepático. Este método permite evaluación mínimamente invasiva en modelos in vivo.

Monitoreo de la homeostasis del calcio del retículo endoplasmático Usando una

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