Name: Monitoreo de la homeostasis del calcio del retículo endoplasmático Usando una Gaussia Luciferasa SERCaMP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a monitorear la homeostasis del calcio del retículo endoplásmico usando SERCaMP con luciferasa Gaussia en tejido hepático. Este método permite evaluación mínimamente invasiva en modelos in vivo.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas. Agradecemos a Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuño y Josh Hinkle por sus contribuciones al desarrollo de este método.

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<li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo pone de relieve la in vitro e in vivo de utilidad Gluc-SERCaMP para supervisar el agotamiento de calcio ER. Aunque la modificación de proteínas para generar SERCaMP parece generalizarse a otras proteínas reportero 12, elegimos Gaussia luciferasa por su robusta (200-1.000 mayor veces) bioluminiscencia en comparación con otras luciferasas 18. Demostramos detectable inducida thapsigargin de liberación Gluc-SERCaMP a través de un rango de dosis de 100 veces de virus Glu...

Las funciones en muchas capacidades celulares incluyendo plegamiento de proteínas, la secreción de proteínas, homeostasis de los lípidos, y de señalización intracelular 1 retículo endoplasmático (ER). Central a la función normal ER es mantener las concentraciones de calcio luminal a ~ 5.000 veces mayores que se encuentran en el citoplasma 2-4. Este proceso intensivo de energía está regulado por la ATPasa de calcio Sarco / retículo endoplásmico (SERCA), una bomba que mueve iones de calcio en la sala de emergencias. Flujo de calcio desde el ER está mediada principalmente por la rianodina (RyR) e inositol trifosfato (IP3R) receptores. Debido a que muchos procesos ER son dependientes de calcio, lo que altera la tienda puede conducir a estrés ER y la muerte celular eventual. ER desregulación de calcio se ha observado en enfermedades como la cardiopatía, la diabetes, el Alzheimer y el Parkinson 5. Debido a la naturaleza progresiva de estas enfermedades, ha sido un reto para delinear la causa-efecto relación entre patogénesis y alteraciones en la tienda de calcio ER. Varias tecnologías han permitido importantes avances en nuestra comprensión de la dinámica del calcio ER, incluyendo colorantes e indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis). Baja afinidad colorantes de calcio, que aumentan en la fluorescencia cuando se une a Ca 2+, se pueden cargar en las células para examinar compartimentos subcelulares con altas concentraciones de calcio 6. Gecis, tales como D1ER y el receptor permite la monitorización de las fluctuaciones de calcio con un control más preciso de la localización subcelular 7-9. Recientemente, otra clase de Gecis llama indicadores de proteínas de orgánulos atrapado en calcio de medición (CEPIA) se han descrito 10. Un tercer enfoque que combina la genética y la química pequeña molécula es-esterasa específica colorante de carga (TED), que utiliza una carboxilesterasa codificado genéticamente (dirigido a la ER) con un colorante de calcio a base de éster 11. Mientras que el AFORenfoques ementioned tienen fortalezas y debilidades inherentes, pueden proporcionar información valiosa sobre la dinámica del calcio ER a través de mediciones agudos de fluorescencia. Ellos son, sin embargo, no es óptimo para los estudios longitudinales a menudo necesarias para investigar la progresión de la enfermedad. Con el objetivo de diseñar un método para controlar la dinámica del calcio durante períodos prolongados de tiempo, hemos identificado y desarrollado una modificación de proteínas para crear las proteínas secretadas calcio ER monitoreo (SERCaMPs) 12. SERCaMP sortea varias limitaciones asociadas con otras metodologías, proporcionando un método mínimamente invasivo para interrogar en varias ocasiones el almacén de calcio ER. Hemos demostrado anteriormente que la ASARTDL péptido carboxi-terminal (alanina-serina-alanina-arginina-treonina-ácido aspártico-leucina) es suficiente para promover la retención de ER; Sin embargo, bajo condiciones que causan disminuciones en calcio ER, la secuencia del péptido ya no es capaz de retener localizatio ERn y la proteína es secretada 13. La base de la tecnología SERCaMP es el apéndice de ASARTDL a la carboxi-terminal de una proteína secretada (por ejemplo, luciferasa Gaussia, o gluc) de modo que la secreción es provocada por el agotamiento de calcio ER, creando así un reportero robusta de ER disregulación de calcio 12. La expresión de Gluc-SERCaMP a través de métodos transgénicos permite fluidos biológicos incluyendo medio de cultivo celular y plasma a analizar los cambios en la actividad gluc como un indicador de la homeostasis del calcio ER. El método tiene aplicaciones para el estudio longitudinal de alteraciones progresivas en la tienda de calcio ER tanto in vitro como in vivo. El siguiente protocolo se escribe como un esquema general para el uso de SERCaMP basado en gluc para estudiar la homeostasis del calcio ER, pero el protocolo puede servir como una guía para SERCaMPs informadores alternativos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 1,5 ml Fisher</td><td>&nbsp;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>Solución NP-40 al 10%&nbsp;</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td>para ensayos intracelulares GLuc</td></tr> 1 <tr><td>ml jeringas luer-lok</td><td>Fisher</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>200 puntas de filtro de microlitros</td><td>Rainin</td><td>RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0 suturas quirúrgicas</td><td>Fisher</td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>agujas de 30 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-821-13A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Láminas de sellado de microplacas adhesivas</td><td>Thermo</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación con alcohol</td><td>Fisher</td><td>22-246-073</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Auto Flow System</td><td>E-Z Anesthesia</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuperación de animales</td><td>Lyon Vet</td><td>ICU-912-004</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Solución de betadine</td><td>Fisher</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Suero de crecimiento bovino</td><td>Thermo</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazina, Native</td><td>Regis Technologies</td><td>1-361204-200</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de corte 3/8 suturas circulares</td><td>WPI</td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador ultrascónico digital</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alto contenido de glucosa, GlutaMAX, piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de masa de ADN</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia luciferasa (proteína recombinante)</td><td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de gauzsia luciferasa (para WB, ICC o IHC)</td><td>New England Biolabs</td><td>E8023S</td><td>1:2.000 (WB)</td></tr><tr><td>Germinador 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>Placas de ensayo Gluc (96 pocillos, opacas)</td><td>Fisher</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Butler Schein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Stop Polvo estíptico</td><td>Butler Schein</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>a452-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R Centrífuga</td><td>Bekman Colter</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Fisher</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscopio</td><td>Nikon Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel y limpieza de PCR</td><td>Pipeta Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Rainin</td><td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 Lenti-X kit de titulación rápida</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>Sello de película PCR</td><td>Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>ReFresh Bote de filtro de carbón</td><td>E-Z Anesthesia</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí, #10</td><td>Fine Science tools Inc</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Ratas SD 150-200 g</td><td>Río Charles</td><td>Ratas</td><td>ratas ordenadas a 150-200 g.&nbsp; Cirugía 5 días después de la llegada</td></tr><tr><td>Marcas auriculares de animales pequeños</td> National <td>Band and Tag co</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Paños quirúrgicos estériles</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 lector de placas</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems 4304437</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>perjudicial para salud humana</td></tr><tr><td>Virapower mezcla de envasado lentiviral</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>Xfect Reactivo de transfección</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Valley Vet</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoreo de la homeostasis del calcio del retículo endoplasmático usando una<em&gt; gaussia</em&gt; luciferasa sercamp

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

El retículo endoplasmático (ER) contiene el mayor nivel de calcio intracelular, con concentraciones aproximadamente 5000 veces mayor que los niveles citoplasmáticos. El control estricto sobre el calcio ER es imprescindible para el plegamiento de proteínas, la modificación y la trata. Las perturbaciones a ER de calcio pueden dar lugar a la activación de la respuesta de la proteína desplegada, un mecanismo de respuesta de estrés ER de tres patas, y contribuir a la patogénesis de una variedad de enfermedades. La capacidad de monitorear alteraciones de calcio ER durante el inicio de la enfermedad y la progresión es importante en principio, pero difícil en la práctica. Los métodos actualmente disponibles para el monitoreo de calcio ER, tales como tintes y proteínas fluorescentes dependientes de calcio, han proporcionado información sobre la dinámica del calcio ER en las células, sin embargo estas herramientas no son muy adecuados para estudios in vivo. Nuestro laboratorio ha demostrado que una modificación en el carboxi-terminal de la luciferasa Gaussia confiere la secreción del reportero en respuesta aEl agotamiento de calcio ER. Los métodos para utilizar una luciferasa basado, proteína de monitoreo de calcio ER secretada (SERCaMP) para in vitro e in aplicaciones in vivo se describen en el presente documento. Este vídeo destaca inyecciones hepáticas, la manipulación farmacológica de Gluc-SERCaMP, extracción de sangre y el procesamiento y los parámetros de ensayo para el control longitudinal de calcio ER.

El método Gluc-SERCaMP permite la evaluación de la homeostasis del calcio ER mediante el muestreo de fluidos extracelulares. Varios controles pueden ser incluidas en el diseño experimental para mejorar la interpretación de los resultados. En primer lugar, el uso de un reportero constitutivamente secretada (por ejemplo, gluc sin la ASARTDL C-terminal o &quot;Gluc-No Tag&quot;) se puede emplear para evaluar los efectos de los tratamientos experimentales en la vía secretora (secreción celular global) y la expresió...

La homeostasis del calcio del retículo endoplásmico se ve alterada en diversas patologías. Se puede utilizar un indicador de proteína de monitoreo de calcio del RE (SERCaMP) para detectar interrupciones en el almacenamiento de calcio del RE. Este protocolo describe el uso de una SERCaMP de Gaussia luciferasa para examinar la homeostasis del calcio del RE in vitro e in vivo.

Monitoreo de la homeostasis del calcio del retículo endoplasmático Usando una<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasa SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en monitorear la alteración del calcio del retículo endoplasmático a lo largo del tiempo mediante el uso de una proteína reportera secretada. Esto se logra mediante la transgénesis mediada por vectores virales en el tejido diana, específicamente el hígado. En este ejemplo, con el reportero Gai luciferasa circa, se recoge un fluido biológico posterior, como la sangre, con el fin de medir la cantidad de circa liberado desde el tejido; luego, se añade el sustrato de luciferasa a las muestras de plasma y se mide la luminiscencia para determinar la disminución del calcio en el retículo endoplasmático.Los resultados muestran una alteración en el calcio del RE, indicada por niveles elevados de C en plasma. La homeostasis del RE puede monitorearse durante períodos prolongados mediante el muestreo repetido de pequeños volúmenes de fluidos biológicos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como colorantes de baja afinidad para calcio o indicadores de calcio codificados genéticamente, es que la homeostasis del calcio en el RE puede monitorearse in vivo a lo largo del tiempo mediante un procedimiento mínimamente

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

Research

Investigación

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Biology

Biología

Este protocolo describe un método para la medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial de imagen fluorescente. El método se aprovecha de una circular permutaciones YFP basada en sensor de calcio de doble excitación radiométrica (radiométrica pericam-mt) expresa selectivamente en las mitocondrias.

Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

El retículo endoplasmático juega un papel clave en la biogénesis de proteínas y en la homeostasis del calcio. Hemos establecido un sistema experimental que nos permite abordar el papel de los canales de Ca2 + de fugas y para caracterizar sus mecanismos de regulación putativo. Este sistema consiste en el silenciamiento de genes mediada por siRNA y de células vivas imágenes de Ca2 +.

Imágenes en vivo del calcio celular combinado con el silenciamiento de genes mediada por siRNA Identifica Ca 2 + Canales de fugas en la membrana del ER y sus mecanismos de regulación

La extensión de la tienda que funciona con...

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Fuente: Bannai, H., et. al., Disección de señales locales de Ca2+ en células cultivadas por indicadores de Ca2+ dirigidos a la membrana. J. Vis. Exp. (2019)El video demuestra imágenes de fluorescencia para observar la dinámica espontánea del calcio específica del compartimento en los astrocitos mediante el monitoreo secuencial de proteínas sensibles al calcio localizadas en la membrana plasmática y el retículo endoplásmico.

Imágenes espontáneas de calcio para la dinámica específica del compartimento en astrocitos

Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED) es compatible con el análisis de la dinámica del almacén de calcio intracelular por imágenes de fluorescencia. El método basa en la orientación de un carboxilesterasa recombinante para el retículo endoplásmico (ER), donde mejora el desenmascaramiento local del sintético de baja afinidad...

Direct Imaging de calcio ER con Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED)

Actualmente, la mayoría de los indicadores de calcio disponibles se utilizan para cuantificar los transitorios de calcio citoplasmático como medidas indirectas del calcio liberado del retículo sarcoplásmico en células de músculo liso cultivadas. Este protocolo describe el uso de un indicador específico basado en FRET que permite la medición directa de las señales de calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico.

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Presentamos protocolos para la aplicación de nuestro indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) CatchER + para el monitoreo de transitorios rápidos de calcio en el retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 y células C2C12 de músculo esquelético usando microscopía de fluorescencia en tiempo real. También se discute un protocolo para la medición y calibración in situ K d .

Seguimiento de la liberación de calcio ER / SR con el Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor de Captura<supUnesdoc.unesco.org unesdoc.unesco.org</sup

Este protocolo describe un método sencillo para analizar las señales de calcio en las plantas generadas por hemipteran insectos, como pulgones. Thaliana de Arabidopsis transformada con el biosensor de calcio GFP GCaMP3 permiten la proyección de imagen en tiempo real en vivo de la dinámica de calcio con una alta resolución temporal y espacial.

En tiempo real en Vivo la grabación de señales de calcio Arabidopsis durante la alimentación de insectos utilizando un Biosensor fluorescente

Aquí presentamos un protocolo de Ca2 + proyección de imagen en neuronas y células gliales, que permite la disección de Ca2 + señales con resolución subcelular. Este proceso es aplicable a todo tipo de celular que permiten la expresión de indicadores de Ca2 + genéticamente codificados.

Disección de Local Ca2 + señales en las células cultivadas por membrana dirigidos Ca2 + indicadores

Este protocolo describe un enfoque para la realización de imágenes de calcio en organoides intestinales humanos infectados por virus y ofrece un enfoque para el análisis.

Obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente

Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.

Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas

Aprende a monitorear la homeostasis del calcio del retículo endoplásmico usando SERCaMP con luciferasa Gaussia en tejido hepático. Este método permite evaluación mínimamente invasiva en modelos in vivo.

Monitoreo de la homeostasis del calcio del retículo endoplasmático Usando una

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