Los explantes de retina enteras de pollo embriones para Tratamientos electroporación y Reactivos Químicos

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar experimentalmente, manipular y cultivar implantes retinianos completos de embriones de pollo. Esto se logra primero recolectando ambos ojos de un embrión de pollo y colocándolos en una placa de Petri. El segundo paso consiste en eliminar la esclerótica y el epitelio pigmentario utilizando pinzas finas.

A continuación, se somete todo el explante retiniano a electroforesis de ADN plasmídico con electrodos planos circulares. El paso final consiste en incubar el explante retiniano en medio de cultivo, en una placa de 24 pocillos dentro de un incubador.

Finalmente, los implantes retinianos completos se fijan, seccionan mediante criomicrotomía y se analizan mediante microscopía de inmunofluorescencia para visualizar las neuronas retinianas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como las operaciones electro OVO, es que es rápida, fácil de realizar y garantiza resultados reproducibles. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo del sistema nervioso central, como cómo la neurogénesis se ve afectada por reactivos químicos específicos, como inhibidores enzimáticos o productos génicos que actúan sobre el ciclo celular tras la incubación.

Coloque los huevos a la edad embrionaria deseada dentro de la cabina de flujo laminar y limpie las cáscaras con etanol al 70 % para evitar la contaminación del embrión. Golpee firmemente un costado del huevo contra una superficie dura para abrirlo y luego coloque su contenido en una placa de Petri de 100 milímetros. Utilice una cucharilla pequeña para transferir el embrión a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga PBS precalentado a 37 grados Celsius, con el fin de evitar que el tejido se seque.

A continuación, seccione la cabeza del embrión y coloque la placa de Petri de 35 milímetros que contiene el tejido embrionario sobre un microscopio estereoscópico binocular. En la cabina de flujo laminar, utilice pinzas finas para realizar una incisión a través de la boca, en la zona ventral al ojo. A partir del sitio de la incisión, desgarre el tejido que rodea completamente el ojo.

A continuación, pellizque el nervio óptico y retire el ojo intacto de la cuenca ocular. Recolecte ambos ojos, el izquierdo y el derecho, del mismo embrión para usarlos como ojo control o tratado. Utilice una cucharilla pequeña para transferir los ojos a una nueva placa de Petri de 35 milímetros que contenga PBS precalentado usando pinzas finas.

Retire todo el tejido alrededor del ojo, incluyendo el esclerótico en laga. A continuación, pellizque una pequeña incisión en el epitelio pigmentario en la parte dorsal del ojo, teniendo cuidado de no dañar la retina neural. Luego, abra suavemente el epitelio pigmentario a partir del sitio de la incisión.

Deje la lente y toda la retina adheridas al cuerpo vítreo. Retire el epitelio pigmentario, teniendo cuidado en la región del cuerpo ciliar alrededor de la pupila en la parte anterior del ojo, y a lo largo de la hendidura coroidea, ya que es difícil eliminarlo de estas ubicaciones. Encienda el electrodo y ajuste el voltaje a 15 voltios para una retina de hamburguesa en estadio 20 a 25 o a 20 voltios para una retina en estadio 26 a 27.

A continuación, configure los pulsos repetidos en cinco pulsos de 50 milisegundos de duración con intervalos de un segundo. Utilice un generador de pulsos que pueda controlarse mediante un pedal de pie en el suelo, ya que se necesitarán ambas manos para mantener los electrodos en su lugar. Conecte dos electrodos de platino con forma de paleta hechos a medida a la toma de salida del generador de pulsos.

Los electrodos mostrados aquí fueron fabricados a partir de placas de platino de 0,1 milímetros y el alambre de conexión de 0,8 milímetros estaba aislado. Utilizando tubos de plástico, transfiera cuidadosamente todo el explante retiniano a un vete mediante una pipeta de pasteur de polietileno a la que se le ha cortado el extremo. Evite usar puntas de pipeta, ya que la retina tiende a adherirse al plástico y desgarrarse.

A continuación, utilice una pipeta de 100 microlitros para retirar suavemente todo el PBS que rodea el explante retiniano. Tenga cuidado de no tocar la retina para evitar rasgarla. Añada 100 microlitros de la solución de plásmido diluida al QVE y asegúrese de que todo el explante retiniano quede cubierto con la solución.

Presione suavemente hacia abajo el explante retiniano con pinzas si flota hacia la parte superior. Use electrodos de pinzas para colocar el cristalino de cara a cualquier lado del vete y dirija el nervio óptico hacia la parte inferior del vete. A continuación, coloque el electrodo positivo frente al cristalino y el electrodo negativo detrás de la retina sin tocar el tejido.

Aplique la corriente presionando el pedal del pie y verifique la presencia de burbujas en los electrodos, lo que indica una descarga exitosa. Utilice una pipeta de 100 microlitros para retirar toda la mezcla de plásmido del qve sin dañar la retina. La mezcla de plásmido se puede reutilizar de tres a cinco veces tras retirar el plásmido.

Llene el vete con PBS precalentado. Utilice pinzas para desprender suavemente el explante retinal de la pared del vete. Luego, use la pipeta de polietileno para transferir todo el explante retinal a una placa de 24 pocillos que contenga un mililitro de medio de cultivo precalentado.

Incubar solo un explante retiniano por pocillo en medio. Incubar el explante retiniano a 37 grados Celsius y 5% CO2 en un agitador rotatorio con una velocidad constante de 50 RPM. La rotación asegura la máxima exposición al medio y evita la adhesión de la retina al fondo de la placa de 24 pocillos.

Después de 24 horas de cultivo, se observaron células positivas para GFP en una gran parte de la retina intacta, ya que la electrotransferencia provocó que una amplia zona retiniana incorporara el plásmido y expresara el gen reportero. Tras el corte, se detectaron fácilmente células individuales positivas para GFP a lo largo del eje basal ACO de la retina. El explante retiniano completo puede mantenerse en cultivo aproximadamente 24 horas más.

Los tiempos de incubación pueden provocar retraso en el desarrollo, malformaciones morfológicas, apoptosis y, eventualmente, desintegración de la retina. Una sección de un explante retiniano completo cultivado durante 24 horas fue inmunomarcada con fosfohistona tres, que aparece aquí en el canal rojo; la fosfohistona tres marca las células en la fase tardía de G2/M. Las células positivas para pH3 se encontraron en el lado apical de la retina, lo cual es consistente con el desarrollo retiniano normal.

Como se muestra aquí, este desarrollo puede bloquearse mediante la adición de un inhibidor de CDK12; la incubación con el inhibidor durante cuatro horas antes de la obtención de imágenes redujo significativamente el número de células positivas para pH3 en la retina tras su desarrollo. Esta técnica se ha utilizado con éxito para investigar la expresión génica reportada a partir de un nuevo plásmido de ADN y para tratar explantes retinianos con reactivos químicos, incluyendo reguladores de la vía de daño del ADN y del ciclo celular. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como electrooporaciones *in ovo*, con el fin de confirmar aún más los resultados.