Detección Sensible de Proteopathic Siembra Actividad con FRET Citometría de Flujo

El objetivo general de este procedimiento es detectar la actividad inductora de proto patógenos procedente de fuentes recombinantes o biológicas, lo que permite la detección sensible de proteínas, agregados y una muestra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurodegeneración. Por ejemplo, ¿cómo podríamos evaluar cuantitativamente los cambios en la actividad inductora tras una intervención terapéutica en modelos animales de enfermedad?

Las ventajas de esta técnica incluyen su alta especificidad hacia niveles bajos de agregados proteicos. Su especificidad exquisita, su facilidad de uso y su alto rendimiento. Hoy demostraré este procedimiento junto con el coautor Brandon Holmes.

Para preparar el material biológico de siembra, comience por pesar el tejido cerebral congelado en una embarcación desechable de suero. Luego, transfiera el tejido a un tubo cónico y agregue tampón de homogenización frío con hielo, de modo que la solución final sea del 10 % en peso por volumen, y transfiera las muestras a un cuarto frío sobre hielo. A continuación, ajuste una sonda al indicador en la configuración adecuada y enjuague los lados y la base de la sonda.

Por lo tanto, calibre el indicador tres veces como se indica, limpiando la sonda entre cada solución. Cuando la sonda esté lista, sumerja la punta en el tampón de homogenización de una muestra e inicie la sonicación, administrando 25 pulsos en total. Cuando el tejido esté completamente en suspensión, centrifugue el homogenato y transfiera el sobrenadante a un tubo limpio.

Teniendo cuidado de no perturbar el paladar. Aunque existen numerosas técnicas de homogenización, la probation es superior para aislar pequeñas cantidades de semillas protio páticas de especímenes biológicos. La disociación mecánica permite una descomposición consistente y eficiente del tejido y la subsiguiente extracción de semillas.

Luego, alícuote el sobrenadante y almacene los lisados a menos 80 grados Celsius. Para repasar las células biosensoras en condiciones estériles, enjuague cada línea celular con PBS tibio seguido de una incubación de tres minutos con tripsina-EDTA. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con medio de cultivo tibio y transfiera inmediatamente las células a un tubo cónico.

Centrifugar las células resuspendidas, suspendiendo el sedimento en medio fresco. Luego, contar las células y preparar una dilución maestra de células de 3.500.000 células por 13 mililitros de medio. Utilizando una pipeta multicanal, transferir lentamente 130 microlitros de las células a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo plano y tratado, teniendo cuidado de colocar las puntas de la pipeta en el centro de los pocillos sin tocar el fondo de la placa.

Una vez sembradas las células, déjelas asentar sin perturbar durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono y humedad relativa mayor o igual al 80%. Al día siguiente, cuando las células biosensoras alcancen una confluencia del 60 al 65%, combine medio con suero reducido, reactivo liposómico y fuente biológica de siembra para formar complejos de transducción. A continuación, agregue por goteo 20 microlitros del complejo de transducción por la pared lateral de cada pocillo individual de biosensor y regrese las células tratadas al incubador durante otras 24 a 48 horas antes de su recolección.

Las células no tratadas mostrarán solo una fluorescencia difusa. Sin embargo, las células tratadas con material semilla de tau mostrarán agregados brillantes. Después de uno o dos días, recoger las células, reemplazar el medio de cultivo celular con 50 microlitros de tripsina-EDTA para detener la reacción. Después de cinco minutos, añadir 150 microlitros de medio de cultivo frío, transferir inmediatamente las células a una placa de 96 pocillos con fondo redondo y centrifugar para formar el sedimento celular. Aspirar los sobrenadantes sin perturbar los sedimentos y luego resuspender suavemente pero completamente las células en 50 microlitros de paraformaldehído al 2 % durante 10 minutos.

Luego, centrifugar nuevamente las células y resuspender los pellet en 200 microlitros de tampón frío para citometría de flujo lo antes posible. Después de la fijación, colocar la placa en un citómetro de flujo compatible con fret y generar un gráfico de área de dispersión lateral versus área de dispersión frontal por variante. A continuación, con la línea celular uno en funcionamiento, ajustar los voltajes de dispersión lateral y dispersión frontal hasta que la población celular se encuentre en el cuadrante inferior izquierdo.

Luego, utilizando la herramienta de polígono, defina la población celular como la puerta P uno. Ahora, cree un gráfico de dispersión de altura de dispersión frontal frente a área de dispersión frontal según variante y aplique la puerta P uno. A continuación, defina las células individuales como la puerta P dos y genere un histograma para cada una.

Para los filtros C-F-P-Y-F-P y fret, aplique la compuerta P a dos o tres histogramas diferentes, uno para cada filtro C-F-P-Y-F-P y fret, para la compensación. Añada 30 microlitros de la suspensión de la línea celular uno a 200 microlitros de la suspensión de la línea celular dos. Luego, haga clic en el icono de configuración del instrumento, seguido por la pestaña de compensación y verifique la matriz para abrir la tabla de compensación.

Genere un gráfico de área de FRET versus área de CFP mediante un diagrama de variación y aplique la compuerta P dos. Luego, con la línea celular uno y la línea celular dos en funcionamiento, haga clic en el icono de cuadrantes y dibuje cuadrantes de forma que las poblaciones fluorescentes negativas y positivas queden separadas por los dos cuadrantes inferiores. Ahora cree una tabla de estadísticas que muestre la intensidad de fluorescencia mediana o MFI de FRET para las compuertas LL tres y LR tres, y ajuste el parámetro de FRET en la matriz de compensación hasta que la MFI de la señal de FRET sea aproximadamente igual entre LL tres y LR tres.

A continuación, realice un gráfico de dispersión del área YFP frente al área CFP con cuadrantes. Ajuste el parámetro YFP en la matriz de compensación hasta que la intensidad media de fluorescencia (MFI) de la señal YFP sea aproximadamente igual entre los cuadrantes. De forma similar a lo mostrado previamente para citometría de flujo FRET.

El desbordamiento fluorescente primario ocurre desde CFP emitido hacia el canal de detección de FRET, lo cual puede corregirse mediante compensación de fluorescencia utilizando células de control positivo de un solo color. Una vez que todas las compuertas se han establecido y la señal de CFP se ha compensado, resalte los pocillos de interés y ejecute el resto de la placa para analizar los datos. Primero, defina las células y las células individuales utilizando los mismos parámetros que se usaron para configurar el análisis de flujo.

A continuación, utilizando la línea celular tres, represente las células positivas únicas para YFP en un gráfico de fret frente a YFP por variante. Dibuje una puerta poligonal que siga y se aleje de la pendiente de la población de células positivas para fret, con el fin de definir una puerta falsa de fret, que excluya el desbordamiento de YFP hacia el filtro de fret. Después de aplicar la puerta falsa de fret a todas las muestras, represente las células C-F-P-Y-F-P tratadas con liposomas vacíos en un gráfico de fret frente a CFP por variante e introduzca una puerta poligonal a lo largo de la pendiente de la población, que se extienda hacia arriba y hacia la izquierda, alejándose de la población.

Cualquier evento que entre en esta puerta se considera positivo para FRET, y el porcentaje de células correlacionará con la titulación de semilla utilizada durante el tratamiento. Finalmente, registre los parámetros de análisis de interés, incluyendo el porcentaje de positividad para FRET y la intensidad de fluorescencia mediana de las células positivas para FRET. Luego, mida el producto del porcentaje de positividad y la IMF para calcular manualmente la densidad integrada de FRET.

En ausencia de agregados o semillas de tau, la proteína tau se mantiene en un estado monomérico soluble, representado por una señal fluorescente difusa y negativa para FRET consistente. Tras la introducción de semillas de tau en las células biosensoras, la tau endógena se convierte en un estado agregado y positivo para FRET, lo cual permite la cuantificación mediante FRET. El análisis mediante citometría de flujo confirma que concentraciones en el rango de femtomoles por litro de tau recombinante son suficientes para su detección. Aquí.

El tejido del tronco encefálico de ratones con tauopatía sacrificados a diferentes edades sirve como una región cerebral representativa que demuestra una detección constante de actividad de nucleación en los animales tan temprano como a los 1,5 meses de edad. En este experimento, el homogenado cerebral de sujetos con enfermedad de Alzheimer mostró una actividad de nucleación robusta, mientras que los controles emparejados por edad y sujetos con enfermedad de Huntington no demostraron especificidad del ensayo para agregados de tau. Cultivos primarios de neuronas no tratados transducidos con construcciones lentivirales de tau, CFP y tau, YFP exhibieron una señal fluorescente difusa tras el tratamiento con semillas recombinantes de tau.

Sin embargo, la proteína tau endógena forma grandes agregados detectables mediante citometría de flujo FRET incluso en ausencia de transducción mediada por liposomas. Cuando las fuentes de semillas se preincuban con fármacos que inhiben la captación de tau, como la heparina, y se tratan en ausencia de liposomas, puede bloquearse la actividad de semilla presente tanto en muestras recombinantes de fis como en muestras de cerebro de ratones con tauopatía. Una vez dominado.

Esta técnica puede completarse en tres días, con solo una a dos horas de trabajo en el banco cada día. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se requerirá una optimización interna para ciertos pasos. Por ejemplo, al determinar títulos efectivos a partir de semillas protiopáticas de diversas fuentes biológicas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar, realizar y analizar experimentos de citometría de flujo FRET con el fin de detectar actividad de siembra protéica patológica procedente de fuentes recombinantes y biológicas.