Name: Detección Sensible de Proteopathic Siembra Actividad con FRET Citometría de Flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Aprende a detectar actividad de siembra proteopática mediante citometría de flujo FRET con alta sensibilidad y especificidad. Este método permite evaluar agregados proteicos en muestras biológicas y recombinantes para investigar enfermedades neurodegenerativas.

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Este trabajo fue apoyado por el Consorcio Tau (M.I.D); Los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) subventoron 1R01NS071835 (M.I.D.), una subvención del Departamento de Defensa PT110816 (a M.I.D.), 1F32NS087805 (a J.L.F.) y 1F31NS079039 (a B.B.H.).

NOTA: Este protocolo hace hincapié en el uso de FRET citometría de flujo para detectar la actividad de siembra de muestras biológicas de ratón. También es compatible con fibrillas recombinantes y muestras biológicas humanas. Ratón de la eutanasia y el cerebro recolección se realizó de acuerdo con los procedimientos aprobados por la IACUC. 1. Cerebro Extracción <ol><li> Siguiendo profunda anestesia con isoflurano (2%), perfundir un ratón con PBS enfriado con hielo que contenía 0,03% de heparina, y extraer el cerebro siguiendo las instrucciones descritas en Gage et al. 18 </li><li> Coloque el tejido extraído en un crio-vial, y encaje congelación colocando en nitrógeno líquido. Alternativamente, congelar el tejido en hielo seco. Una vez congelado, transferencia de tejido a -80 ° C y almacenar durante un período prolongado de tiempo, si es necesario. NOTA: Este protocolo es compatible con homogeneizados de cerebro enteros o regiones microdiseccionadas cerebrales. Ver Hagihara et al. Para un detallado protocolo de micro-disección 19. </li></ol&gt; 2. Preparación de Material Biológico de Semillas <ol><li> Preparar tampón de homogeneización mediante la disolución de inhibidores de la proteasa (EDTA libre) en TBS 1x (1 tableta por cada 10 ml). Vortex vigorosamente, y almacenar en hielo. Inhibidores de la proteasa debe ser libre de EDTA a fin de preservar la viabilidad celular biosensor. </li><li> Pesar tejido cerebral congelado en un desechable sopesar barco, y transferir a un tubo cónico de 5 ml. Añadir tampón de homogeneización enfriado con hielo tal que la solución final es 10% peso / volumen. Temporalmente almacenar en hielo. La masa de tejido y el volumen de tampón de homogeneización posterior variarán dependiendo del tamaño y / o regiones del cerebro utilizado. Aquí, un hemibrain ratón adulto que pesa 0,2 g se suspende en 2 ml de una solución al 10% w / vol. </li><li> Muestras de transferencia en una habitación fría, y ajustar un aparato de ultrasonidos sonda para la configuración adecuada. Para sonicación con sonda con un Ruptor Omni (en la imagen), ajuste la potencia al 20%, lo que corresponde a aproximadamente 75 W. Utilice un modo de pulso para asegurar muestras no se OVer-calentado durante el tratamiento con ultrasonidos. Ajuste el generador de impulsos al 30%, correspondiente a aproximadamente 500 mseg. </li><li> Limpiar la punta de la sonda de ultrasonidos por aclarado con agua, isopropanol, y agua de nuevo, limpiar la sonda entre cada solución. Asegúrese de enjuagar y limpiar tanto los lados y el fondo de la sonda con laboratorio-toallitas. </li><li> Trabajar con una muestra a la vez, sumergir la punta de la sonda en el tampón de homogeneización, e iniciar el aparato de ultrasonidos. El uso de la configuración de energía y generador de impulsos descritos anteriormente, entregar 25 pulsos totales. Asegúrese de que el tejido está completamente en suspensión. Tenga cuidado para evitar la formación de espuma de la muestra durante este paso. NOTA: Las muestras son susceptibles a la formación de espuma si: a) el volumen total es baja o b) el homogeneizado se calienta. Con este instrumento específico, no sonicar con un volumen de menos de 250 l. Para asegurarse de muestras se mantienen refrigeradas, tubos pueden ser almacenados en hielo durante este paso. </li><li> Limpie la sonda por enjugándose lisado residual, luego entregar 10 pulsos en un vaso de precipitados oagua limpia f. Enjuague los lados y el fondo de la sonda con agua, isopropanol, y agua de nuevo (como en el paso 2.4), la limpieza en seco entre cada paso. Para evitar la contaminación, enjuague bien la sonda de entre las muestras. NOTA: Con los agregados de tau, no hemos encontrado que los métodos de limpieza más estrictas son necesarias para evitar la contaminación de muestra a muestra. Otros amiloides, sin embargo, pueden requerir atención adicional que ha sido descrito ampliamente en la literatura 20,21. </li><li> Tienda homogeneizados en hielo hasta que se han procesado todas las muestras. </li><li> Haga girar homogeneizados a 21.300 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo limpio, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Deseche la pastilla. Alícuota el sobrenadante, y almacenar los lisados ​​a -80 ° C para su uso posterior. Evite los ciclos de congelación / descongelación de los homogeneizados, sin embargo, ya que esto reduce la eficiencia de la siembra. </li></ol> 3. Las células replating Biosensor NOTA:Utilice cuatro líneas celulares para este ensayo: HEK 293T (célula de la línea # 1), RD-P301S-PPC (célula de la línea # 2), RD-P301S-YFP (célula de la línea # 3), y RD-P301S-PPC / YFP ( línea celular # 4). Por favor, consulte la Tabla 1 para la contribución de cada línea celular para el ensayo. <ol><li> En un entorno estéril, medio de cultivo de aspirado. Enjuague las células con PBS caliente, y aspirar. Trypsinize células (3 ml de tripsina-EDTA (0,05%)) para 3 min, saciar con medio de cultivo caliente (9 ml de DMEM, FBS al 10%, 1% penicilina / estreptomicina, 1% Glutamax), y transferir inmediatamente las células a un tubo cónico. </li><li> Células Centrifugar a 1000 xg durante 5 min a TA. Medio Aspirar y sedimento celular se resuspende en medio de cultivo caliente. </li><li> Utilizando un hemocitómetro, determinar la densidad celular para cada línea celular. La densidad celular variará dependiendo de confluencia en el momento de la cosecha y el volumen de resuspensión. Resuspender las células cosechadas a partir de un plato de 10 cm a 90% de confluencia en 10 ml de medio, por la densidad de células a ser aproximadamente 1 millón de células / ml. </li><li> Haceruna mezcla maestra de las células + medios de comunicación de tal manera que cada pocillo de una placa de 96 pocillos contendrá 35.000 células en 130 l de medios (por ejemplo, para hacer una mezcla maestra para 100 pozos, resuspender 3,5 millones de células en 13 ml de medio). Modificar el número de células para adaptarse a diseños y plazos experimentales individuales. Para el tratamiento de células ~ 18 hr después de la siembra, añadir 35.000 células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. </li><li> Usando una pipeta multicanal, una pipeta lentamente 130 l de suspensión celular mezcla maestra en cada pocillo de un fondo plano, el tejido de cultivo tratado-placa de 96 pocillos. Mientras chapado, coloque la punta de la pipeta en el centro del pozo, sin tocar el fondo de la placa. NOTA: Aunque formato de chapado puede ser modificado, se recomienda hacer n = 4 pocillos para cada una de las líneas celulares 1-3 por placa. El resto de la placa (n = 84) está reservado para la línea celular # 4 (células de biosensores). </li><li> Permitir que las células se asienten dejando la placa en reposo durante 10 min a TA. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2, y y# 8805; humedad relativa 80%. </li></ol> 4. Las células Tratamiento NOTA: El siguiente día, cuando las células de biosensores tau son 60-65% confluentes, preparar complejos de transducción de semillas de la siguiente manera: <ol><li> En un tubo, se combinan reactivo de transfección, como Lipofectamina, con los medios de comunicación reducido suero, tales como Opti-MEM, para hacer una mezcla maestra. Por así, añadir 1,25 reactivo de transfección ly 8,75 l de medios de comunicación reducida de suero. Flick tubo suavemente para mezclar, brevemente girar hacia abajo, y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> En otro tubo, combinar material de siembra (alícuota de lisado de la etapa 2.9) con los medios de comunicación reducida de suero. NOTA: Volumen del material de semilla variará de acuerdo con el experimento individual. Al elegir el volumen de semillas, tener en cuenta: la abundancia de semillas en una muestra y la toxicidad potencial. Homogeneizados brutos pueden ser tóxicos para las células. Como tal, utilice el volumen más bajo posible para controlar su efecto deseado. Anteriormente volúmenes probados de lisado / pocillo fr gamaom 05.01 l, correspondiente a la proteína total 5.20 mg. Asegúrese de que el volumen total por pocillo (semillas + medios reducido suero) es de 10 l. </li><li> Combine el contenido de los dos tubos que se describen en 4.1 y 4.2, flick suavemente para mezclar, brevemente girar hacia abajo (1.000 xg, 5 seg), e incubar a temperatura ambiente durante al menos 20 min y hasta 2 hr. </li><li> Pipetear suavemente 20 l de complejo de transducción en el lado de los pozos de biosensores individuales. Utilice tres repeticiones técnica, si es posible. Volver células tratadas a la incubadora durante 24-48 h. Incubar en las mismas condiciones como se describe en el paso 3.6. NOTA: La condición de control negativo apropiado para esta configuración es biosensores células tratadas con liposomas vacíos (es decir, el reactivo de liposomas + medios de comunicación reducida de suero) porque la aplicación de fosfolípidos introduce un ligero cambio en el perfil de fluorescencia relativa a las células no expuestas al biosensor reactivo de liposomas. </li></ol> 5. Las células Cosecha de FRET Citometría de Flujo <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: Antes de cosechar las células-generalmente 24-48 horas post-tratamiento es posible obtener una lectura preliminar de la actividad de siembra utilizando el filtro de GFP en un microscopio de fluorescencia estándar invertida. Las células tratadas y sin material de siembra (es decir, los liposomas vacíos) mostrarán fluorescencia difusa, mientras que las células tratadas con material de siembra mostrarán intensa punteada e inclusiones reticulares intracelulares (Figura 1A - B). <ol><li> Usando una pipeta multicanal, aspirar todo medio celular (150 l). Células de 5 min trypsinize (50 l), y se inactiva con 150 l de medio de cultivo frío. No incluya un enjuague de PBS antes de la tripsinización en este paso, ya que puede causar elevación celular y pérdida celular subsiguiente. Excluir los contaminantes células muertas y los desechos durante la citometría de flujo a través de las estrategias de compuerta. </li><li> Inmediatamente después del temple, las células de transferencia a una placa de fondo redondo de 96 pocillos, y se centrifuga a 1000 xg durante 5 min a RT. </li><li> Aspirar y desechar medio, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Suavemente, pero a fondo, resuspender el botón celular en 50 l 2% de paraformaldehído, y se incuba durante 10 min. Alternativamente, las células dirigidas viven, aunque la fijación proporciona resultados más limpios y más consistentes. </li><li> Células Centrifugar a 1000 xg durante 5 min a TA. Aspirar y desechar paraformaldehído, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Suavemente, pero a fondo, resuspender el botón celular en 200 l de tampón de citometría de flujo frío (HBSS, 1% de FBS, EDTA 1 mM) y ejecutar la placa tan pronto como sea posible para evitar la aglutinación de células. </li></ol> 6. FRET Citometría de Flujo NOTA: Utilice un citómetro de flujo tal como el MACSQuant VYB, que está equipado con FRET-compatible líneas de láser y conjuntos de filtros (Tabla 2). Para cada paso dentro de esta sección, haga clic en el bien de interés utilizando la plantilla 96 y del software, y haga clic en&quot;Jugar&quot; para iniciar la captación de la muestra y el flujo. Hacer parcelas o tablas estadísticas haciendo clic en el icono &quot;nueva ventana de análisis &#39;. Cambiar parámetros de eje en parcelas de dos variables individuales haciendo clic en el título ya sea en el eje X o Y y seleccionar el filtro adecuado. Para desplazar poblaciones celulares o señales de fluorescencia, aumentar o disminuir las tensiones asociadas con los filtros adecuados. Con este instrumento, ejecute &lt;1.000 eventos / seg para garantizar el seguimiento de una sola célula exacta. <ol><li> Hacer una dispersión-Side Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Área (FSC-A) trama bivariada, y con la línea celular # 1 en funcionamiento, ajustar los voltajes SSC y FSC hasta que la población de células es en el cuadrante inferior izquierdo. Haga clic en la herramienta polígono, y definir la población de células (Puerta P1). Para todos los parámetros de compuerta véase la Figura 2. </li><li> Haga una FSC-H (altura) vs FSC Un bivariado trama, y ​​aplicar Puerta P1 a esta parcela haciendo clic en &quot;vivo&quot; por encima de la trama, y ​​la selección de P1. Con la línea celular # 1corriendo, haga clic en la herramienta polígono, y definir las células individuales (Puerta P2). </li><li> Haga 3 parcelas de histograma, una para cada uno de los filtros de interés: PPC, YFP y FRET. Aplicar Puerta P2 a todas estas parcelas haciendo clic en &quot;vivo&quot; por encima de las parcelas, y la selección de P2. Con la línea celular # 1 en funcionamiento, ajustar los voltajes de tal manera que la población de células mediana en la PPC, YFP, y FRET histogramas son todos entre 0 y 1. Para medir PPC y FRET, excitar las células con el láser de 405 nm, y la captura de fluorescencia con una 450/50 nm y 525/50 nm filtro, respectivamente. Para medir YFP, excitar las células con un 488 nm láser y captura de fluorescencia con un 525/50 nm filtro. Ajustes del láser y el filtro se describen adicionalmente en la Tabla 2. </li><li> Realice una indemnización por PPC desbordamiento en los canales de FRET y YFP. NOTA: La compensación es el proceso de corrección de derrame de fluorescencia. Desbordamiento de fluorescencia se produce cada vez que se detecta la emisión de fluorescencia de un solo fluorocromo dentro de un filtro desiseñados para medir señal de otro fluorocromo. Con una indemnización adecuada, el desbordamiento de fluorescencia PPC puede ser retirado de los canales de FRET y YFP. NOTA: La compensación requiere la presencia de ambas células positivas y negativos de fluorescencia. Por lo tanto, para compensar en las células de la PPC-positivos (célula de la línea # 2), las células negativas (célula de la línea # 1) debe ser añadido a la muestra antes de la carrera. <ol><li> Spike en 30 l de línea celular # 1 suspensión de un solo pozo en 200 l de línea celular # 2 suspensión inmediatamente antes de la compensación. </li><li> Haga clic en el icono de &quot;Configuración del instrumento&quot;, a continuación, la pestaña &#39;compensación&#39;, y comprobar &quot;matriz&quot; para abrir la tabla de compensación. </li><li> Haga una FRET-A vs PPC-Una parcela bivariado, y aplicar P2 puerta, como se describe en el paso 6.3. Con líneas celulares 1 + 2 en ejecución, haga clic en el icono de &quot;cuadrante&quot; y dibujar cuadrantes de manera que las poblaciones de fluorescencia-negativos y -positivas están separadas por los dos cuadrantes inferiores (Puertas LL3 unnd LR3, respectivamente). </li><li> Crear una tabla de estadísticas que muestra la intensidad media de fluorescencia (MFI) de FRET para el LL3 y puertas LR3. Ajustar el parámetro de FRET en la matriz de compensación hasta que el MFI de la señal de FRET es equivalente entre LL3 y LR3. Después de este paso, la IMF de la señal de FRET es igual entre las células no teñidas y células CFP-positivos, lo que sugiere la ausencia de desbordamiento de la PPC en el canal de FRET. </li><li> Hacer un YFP-A vs PPC-Una parcela bivariado, y aplicar P2 puerta, como se describe en el paso 6.3. Dibuja cuadrantes (LL4 y LR4) similar a la realizada en el paso 6.4.3. </li><li> Crear una tabla de estadísticas que muestra el MFI de YFP para LL4 y LR4. Ajuste el parámetro de YFP en la matriz de compensación hasta que el MFI de la señal de YFP es equivalente entre LL4 y LR4. Después de este paso, la IMF de una señal de YFP es igual entre las células no teñidas y células CFP-positivos, lo que sugiere la ausencia de desbordamiento de la PPC en el canal de YFP. </li></ol></li><li> Folldebido configuración puerta y compensación, resalte pozos de interés y ejecutar el resto de la placa. </li><li> Después de todas las muestras se han ejecutado, archivos de datos de exportación haciendo clic en &#39;archivo&#39;, luego &#39;copia&#39;. Seleccione la pestaña &quot;archivos de datos &#39;, seleccione la carpeta experimento, y haga clic en« copia ». </li></ol> Análisis 7. Datos NOTA: parámetros de eje Cambio en parcelas de dos variables individuales haciendo clic en el título ya sea en el eje X o Y y seleccionar el filtro adecuado. <ol><li> Archivos FCS abiertas en la citometría de flujo programa de análisis. </li><li> Basado en las propiedades de dispersión, utilice una puerta poligonal para definir la población de células (SSC vs FSC) y la población singlete (FSC-H vs FSC-A) de las células tratadas con liposomas vacíos, de manera similar a la descrita en la Sección 6. </li><li> Si se realizó una compensación PPC durante la instalación, no ajuste más PPC. </li><li> Crear un FRET vs YFP bivariado trama. Utilizando la línea celular # 3, Definir una puerta falsa FRET mediante la elaboración de una puerta poligonal que se ejecuta a lo largo de la pendiente de la población de células FRET-positivo. Esta puerta excluye las células de un solo positivo YFP que emiten una señal de FRET dentro del filtro, y se extrae similar a la mostrada anteriormente mediante la prohibición et al. 22 </li><li> Definir una puerta FRET trazando celdas vacías de liposomas tratados PPC / YFP en un FRET vs PPC bivariado trama. Introducir una puerta poligonal a lo largo de la pendiente de la población que se extiende hacia arriba y hacia la izquierda lejos de la población. Esta puerta debe excluir la mayoría de las células (~ 99%), de tal manera que el fondo FRET es ≥1% de las células. Cualquier evento que cambian en esta puerta se consideran FRET-positivo. Nota: Cada una de las puertas se ha descrito anteriormente se aplica a todas las muestras antes de construir puertas posteriores. Tras el análisis, cuatro puertas individuales se definen (población celular; singlete; falsa FRET; FRET). </li><li> Parámetros de análisis de registro de interés, entre ellos: ciento positividad FRET y MFIde las células FRET-positivo. Calcular manualmente la densidad de FRET integrado midiendo el producto del porcentaje de positividad y la IMF. NOTA: Si la densidad de FRET integrado se utiliza como una medida de resultado, establezca FRET de fondo (tal como se define en el paso 7.5) y MFI a mayor que o igual a 1 con el fin de evitar el cálculo de un producto que es menos de sus dos factores individuales. </li></ol>

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<li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer%27s+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537(2015).</li>
</ol>

Este ensayo ha sido licenciado a Janssen Pharmaceuticals.

La citometría de flujo del sistema FRET descrito aquí es una poderosa herramienta para evaluar de forma rápida y cuantitativamente la actividad de siembra tau. Sólo se requiere la experiencia de cultivo de células moderado y un conocimiento práctico de FRET y citometría de flujo. Otros ensayos de siembra, como tioflavina T - que exhibe fluorescencia aumentada cuando se une a la estructura de lámina beta - son laboriosos y requieren un sustrato de proteína pura, recombinante. Además, los ensayos in vitro de siem...

La acumulación intracelular de tau amiloides define tauopatías tales como enfermedad de Alzheimer. En las etapas iniciales de la enfermedad, la patología es generalmente localizada en regiones discretas del cerebro, pero con progresión de la enfermedad, la patología se extiende invariablemente a lo largo de distintas redes neuronales 1-5. La evidencia acumulada sugiere propagación transcelular de agregados de proteínas tóxicas subyace en esta patología (revisado en 6-10). En este modelo, las semillas proteopathic (por ejemplo, tau) se liberan de las células del donante y entran en las células vecinas, la transformación de la proteína tau nativa en la forma mal plegada a través cambio conformacional con plantilla 11-15. El ensayo descrito aquí fue desarrollado para detectar con sensibilidad tal actividad siembra. Es compatible con la proteína recombinante y muestras biológicas y permite la cuantificación de los niveles de minutos de actividad siembra proteopathic 16. Células HEK 293T que expresan de forma estable tau d repeticiónOmain (RD) que contiene la mutación P301S asociado a la enfermedad ya sea fusionado a PPC o YFP (denominado en lo sucesivo como células tau-RD-CFP / YFP) servir como un biosensor estable de la actividad de la siembra. En ausencia de semillas proteopathic, las células mantener tau como un monómero soluble, y no tienen ningún fondo apreciable FRET. Absorción espontánea o transducción mediada por liposomas de las semillas de tau en las células, sin embargo, los resultados en RD-CFP y agregación RD-YFP, que produce una señal de FRET que se mide dentro de las células individuales a través de citometría de flujo. Numerosos componentes de este ensayo fueron diseñados para mejorar la sensibilidad y reducir la variabilidad. Fue seleccionado expresión ratio 1 RD-PPC / YFP, ya que proporciona óptima de la señal: Una línea celular monoclonal con un 1 ruido. Para aumentar la sensibilidad, los fosfolípidos se utilizan para introducir semillas directamente en las células (aunque para estudiar los mecanismos biológicos de la absorción, esto puede ser omitido). Por último, citometría de flujo monitores FRET a nivel de población y de una sola célula<html> nivel, a diferencia de otros ensayos de agregación de proteínas. La medida de resultado final, la densidad de FRET integrado, es altamente cuantitativo y representa tanto por el número de células con la agregación, y el grado en que se ha producido la agregación dentro de cada célula. Todos estos parámetros optimizados aumentar la sensibilidad y asegurar la reproducibilidad. Este sistema fue empleado recientemente en un estudio integral en ratones transgénicos tauopatía P301S 17 que evaluó la aparición temporal y la progresión de la actividad de siembra de tau en relación con otros marcadores patológicos tau uso común (por ejemplo, MC1, AT8, PG5 y tioflavinas). Actividad siembra es, con mucho, el marcador más temprana y más robusta de la patología tau evaluado, precediendo a la detección histológica por al menos 6 semanas. Siembra actividad aparece en 1,5 meses y aumenta progresivamente con la edad, lo que sugiere un papel causal de las semillas proteopathic en la aparición y / o progresión de la neurodegeneración 16. e_content &quot;&gt; cuantificación precisa de los niveles de diminutas de material de semilla a partir de muestras biológicas puede facilitar los estudios que monitorean progresión de la enfermedad temprana. Al acortar la duración del ensayo y permitiendo el uso de los animales más jóvenes, esto podría aumentar la eficiencia y la exactitud de los ensayos preclínicos con animales. Por ejemplo, en el ratón P301S se ha descrito anteriormente, los compuestos de plomo se podrían entregar tan pronto como 4-6 semanas (inmediatamente antes de, o al inicio de la actividad de la siembra), y controlado para la eficacia de 2-4 semanas más tarde. El ensayo debe cuantificar con precisión cualquier reducción de la siembra actividad. FRET citometría de flujo ha in vitro aplicaciones de cribado también. Por ejemplo, los reactivos anti-tau (por ejemplo, anticuerpos, moléculas pequeñas, etc.) se puede probar rápidamente por su capacidad para bloquear la inducción de la siembra directamente en cultivo, utilizando ya sea tau recombinante agregados o lisados ​​derivados del cerebro como una fuente de semilla (Figura 5). Con esta configuración, una vez que se prepara material de siembra, un experimento toma sólo tres días para completar, incluyendo el análisis de datos. La rápida cuantificación de la actividad de siembra proteopathic tanto, puede facilitar muchos estudios de la neurodegeneración.

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Inhibidores de la proteasa (sin EDTA)</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>Barcos de pesaje</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubo cónico</td><td>EE. UU. Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>Omni Sonic Ruptor Homogeneizador ultrasónico</td><td>Omni International</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Tip para homogeneizador ultrasónico</td><td>Omni International</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>orejeras con cancelación de ruido</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubos cónicos Phenix</td><td>Research</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>25 ml reactivos reactivos</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Fisher Scientific</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 placas de fondo redondas de pocillos</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehído</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica RT</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 40 Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner Rotor de cuchara oscilante</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Citómero de flujo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis Flow Jo</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l puntas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l puntas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 ml puntas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l puntas de pipeta</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipeta serológica</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipeta serológica</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipeta serológica</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

detección sensible de proteopathic siembra actividad con fret citometría de flujo

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Cada vez hay más evidencia que apoya la propagación transcelular de agregados de proteínas tóxicas, o semillas proteopáticas, como mecanismo para el inicio y la progresión de la patología en varias enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer y las tauopatías relacionadas. El papel potencialmente crítico de las semillas de tau en la progresión de la enfermedad respalda firmemente la necesidad de un ensayo sensible que detecte fácilmente la actividad de siembra en muestras biológicas. 
Combinando la especificidad de la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET), la sensibilidad de la citometría de flujo y la estabilidad de una línea celular monoclonal, se ha diseñado un ensayo de siembra ultrasensible que es compatible con la detección de semillas a partir de muestras recombinantes o biológicas, incluidos los homogeneizados de cerebro humano y de ratón. El ensayo emplea células monoclonales HEK 293T que expresan de manera estable el dominio de repetición (RD) propenso a la agregación de tau que alberga la mutación P301S asociada a la enfermedad fusionada con CFP o YFP, que producen una señal FRET tras la agregación de proteínas. La absorción de semillas proteopáticas de tau (pero no de otras proteínas) en las células biosensoras estimula la agregación de RD-CFP y RD-YFP, y la citometría de flujo monitorea sensible y cuantitativamente este FRET inducido por la agregación. El ensayo detecta concentraciones femtomolares (monómero equivalente) de semillas de tau recombinantes, tiene un rango dinámico que abarca tres órdenes de magnitud y es compatible con homogeneizados cerebrales de ratones transgénicos con tauopatía y sujetos con tauopatía humana. Con ligeras modificaciones, el ensayo también puede detectar la actividad de siembra de otras semillas proteopáticas, como la α-sinucleína, y también es compatible con cultivos neuronales primarios. La facilidad, sensibilidad y amplia aplicabilidad de la citometría de flujo FRET la hacen útil para estudiar una amplia gama de trastornos de la agregación de proteínas.

FRET citometría de flujo permite sensible, cuantitativa, y la detección rápida de la actividad de la siembra a partir de muestras biológicas o recombinantes. Ensayo de configuración es fácil: líneas celulares estables que expresan monoclonales derivados de tau-RD-CFP / YFP son transducidas con material de siembra, se incubaron durante 24-48 horas, y se sometieron a análisis de citometría de flujo (Figura 1A). En ausencia de semillas, las células mantienen biosensores tau en una forma monomérica soluble ...

La transferencia de célula a célula de agregados de proteínas, o semillas proteopáticas, puede ser la base de la progresión de la patología en las enfermedades neurodegenerativas. Aquí, se describe un nuevo ensayo de citometría de flujo FRET que permite la detección específica y sensible de la actividad de siembra a partir de muestras recombinantes o biológicas.

Detección Sensible de Proteopathic Siembra Actividad con FRET Citometría de Flujo

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar la actividad inductora de proto patógenos procedente de fuentes recombinantes o biológicas, lo que permite la detección sensible de proteínas, agregados y una muestra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurodegeneración. Por ejemplo, ¿cómo podríamos evaluar cuantitativamente los cambios en la actividad inductora tras una intervención terapéutica en modelos animales de enfermedad? Las ventajas de esta técnica incluyen su alta especificidad hacia niveles bajos de agregados proteicos. Su especificidad exquisita, su facilidad de uso y su alto rendimiento. Hoy demostraré este procedimiento junto con el coautor Brandon Holmes.Para preparar el material biológico de siembra, comience por pesar el tejido cerebral congelado en una embarcación desechable de suero. Luego, transfiera el tejido a un tubo cónico y agregue tampón de homogenización frío con hielo, de modo que la solución final sea del 10 % en peso por volumen, y transfiera las muestras a un cuarto frío sobre hielo. A continuación, ajuste una sonda al indicador en la configuración adecuada y enjuague los lados y la base de la sonda.Por lo tanto, calibre el indicador tres veces como se indica, limpiando la sonda entre cada solución. Cuando la sonda esté lista, sumerja la punta en el tampón de homogenización de una muestra e inicie la sonicación, administrando 25 pulsos en total. Cuando el tejido esté completamente en suspensión, centrifugue el homogenato y transfiera el sobrenadante a un tubo limpio.Teniendo cuidado de no perturbar el paladar. Aunque existen numerosas técnicas de homogenización, la probation es superior para aislar pequeñas cantidades de semillas protio páticas de especímenes biológicos. La disociación mecánica permite una descomposición consistente y eficiente del tejido y la subsiguiente extracción de semillas.Luego, alícuote el sobrenadante y almacene los lisados a menos 80 grados Celsius. Para repasar las células biosensoras en condiciones estériles, enjuague cada línea celular con PBS tibio seguido de una incubación de tres minutos con tripsina-EDTA. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con medio de cultivo tibio y transfiera inmediatamente las células a un tubo cónico.Centrifugar las células resuspendidas, suspendiendo el sedimento en medio fresco. Luego, contar las células y preparar una dilución maestra de células de 3.500.000 células por 13 mililitros de medio. Utilizando una pipeta multicanal, transferir lentamente 130 microlitros de las células a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo plano y tratado, teniendo cuidado de colocar las puntas de la pipeta en el centro de los pocillos sin tocar el fondo de la placa.Una vez sembradas las células, déjelas asentar sin perturbar durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono y humedad relativa mayor o igual al 80%. Al día siguiente, cuando las células biosensoras alcancen una confluencia del 60 al 65%, combine medio con suero reducido, reactivo liposómico y fuente biológica de siembra para formar complejos de transducción. A continuación, agregue por goteo 20 microlitros del complejo de transducción por la pared lateral de cada pocillo individual de biosensor y regrese las células tratadas al incubador durante otras 24 a 48 horas antes de su recolección.Las células no tratadas mostrarán solo una fluorescencia difusa. Sin embargo, las células tratadas con material semilla de tau mostrarán agregados brillantes. Después de uno o dos días, recoger las células, reemplazar el medio de cultivo celular con 50 microlitros de tripsina-EDTA para detener la reacción. Después de cinco minutos, añadir 150 microlitros de medio de cultivo frío, transferir inmediatamente las células a una placa de 96 pocillos con fondo redondo y centrifugar para formar el sedimento celular. Aspirar los sobrenadantes sin perturbar los sedimentos y luego resuspender suavemente pero completamente las células en 50 microlitros de paraformaldehído al 2 % durante 10 minutos.Luego, centrifugar nuevamente las células y resuspender los pellet en 200 microlitros de tampón frío para citometría de flujo lo antes posible. Después de la fijación, colocar la placa en un citómetro de flujo compatible con fret y generar un gráfico de área de dispersión lateral versus área de dispersión frontal por variante. A continuación, con la línea celular uno en funcionamiento, ajustar los voltajes de dispersión lateral y dispersión frontal hasta que la población celular se encuentre en el cuadrante inferior izquierdo.Luego, utilizando la herramienta de polígono, defina la población celular como la puerta P uno. Ahora, cree un gráfico de dispersión de altura de dispersión frontal frente a área de dispersión frontal según variante y aplique la puerta P uno. A continuación, defina las células individuales como la puerta P dos y genere un histograma para cada una.Para los filtros C-F-P-Y-F-P y fret, aplique la compuerta P a dos o tres histogramas diferentes, uno para cada filtro C-F-P-Y-F-P y fret, para la compensación. Añada 30 microlitros de la suspensión de la línea celular uno a 200 microlitros de la suspensión de la línea celular dos. Luego, haga clic en el icono de configuración del instrumento, seguido por la pestaña de compensación y verifique la matriz para abrir la tabla de compensación.Genere un gráfico de área de FRET versus área de CFP mediante un diagrama de variación y aplique la compuerta P dos. Luego, con la línea celular uno y la línea celular dos en funcionamiento, haga clic en el icono de cuadrantes y dibuje cuadrantes de forma que las poblaciones fluorescentes negativas y positivas queden separadas por los dos cuadrantes inferiores. Ahora cree una tabla de estadísticas que muestre la intensidad de fluorescencia mediana o MFI de FRET para las compuertas LL tres y LR tres, y ajuste el parámetro de FRET en la matriz de compensación hasta que la MFI de la señal de FRET sea aproximadamente igual entre LL tres y LR tres.A continuación, realice un gráfico de dispersión del área YFP frente al área CFP con cuadrantes. Ajuste el parámetro YFP en la matriz de compensación hasta que la intensidad media de fluorescencia (MFI) de la señal YFP sea aproximadamente igual entre los cuadrantes. De forma similar a lo mostrado previamente para citometría de flujo FRET.El desbordamiento fluorescente primario ocurre desde CFP emitido hacia el canal de detección de FRET, lo cual puede corregirse mediante compensación de fluorescencia utilizando células de control positivo de un solo color. Una vez que todas las compuertas se han establecido y la señal de CFP se ha compensado, resalte los pocillos de interés y ejecute el resto de la placa para analizar los datos. Primero, defina las células y las células individuales utilizando los mismos parámetros que se usaron para configurar el análisis de flujo.A continuación, utilizando la línea celular tres, represente las células positivas únicas para YFP en un gráfico de fret frente a YFP por variante. Dibuje una puerta poligonal que siga y se aleje de la pendiente de la población de células positivas para fret, con el fin de definir una puerta falsa de fret, que excluya el desbordamiento de YFP hacia el filtro de fret. Después de aplicar la puerta falsa de fret a todas las muestras, represente las células C-F-P-Y-F-P tratadas con liposomas vacíos en un gráfico de fret frente a CFP por variante e introduzca una puerta poligonal a lo largo de la pendiente de la población, que se extienda hacia arriba y hacia la izquierda, alejándose de la población.Cualquier evento que entre en esta puerta se considera positivo para FRET, y el porcentaje de células correlacionará con la titulación de semilla utilizada durante el tratamiento. Finalmente, registre los parámetros de análisis de interés, incluyendo el porcentaje de positividad para FRET y la intensidad de fluorescencia mediana de las células positivas para FRET. Luego, mida el producto del porcentaje de positividad y la IMF para calcular manualmente la densidad integrada de FRET.En ausencia de agregados o semillas de tau, la proteína tau se mantiene en un estado monomérico soluble, representado por una señal fluorescente difusa y negativa para FRET consistente. Tras la introducción de semillas de tau en las células biosensoras, la tau endógena se convierte en un estado agregado y positivo para FRET, lo cual permite la cuantificación mediante FRET. El análisis mediante citometría de flujo confirma que concentraciones en el rango de femtomoles por litro de tau recombinante son suficientes para su detección. Aquí.El tejido del tronco encefálico de ratones con tauopatía sacrificados a diferentes edades sirve como una región cerebral representativa que demuestra una detección constante de actividad de nucleación en los animales tan temprano como a los 1,5 meses de edad. En este experimento, el homogenado cerebral de sujetos con enfermedad de Alzheimer mostró una actividad de nucleación robusta, mientras que los controles emparejados por edad y sujetos con enfermedad de Huntington no demostraron especificidad del ensayo para agregados de tau. Cultivos primarios de neuronas no tratados transducidos con construcciones lentivirales de tau, CFP y tau, YFP exhibieron una señal fluorescente difusa tras el tratamiento con semillas recombinantes de tau.Sin embargo, la proteína tau endógena forma grandes agregados detectables mediante citometría de flujo FRET incluso en ausencia de transducción mediada por liposomas. Cuando las fuentes de semillas se preincuban con fármacos que inhiben la captación de tau, como la heparina, y se tratan en ausencia de liposomas, puede bloquearse la actividad de semilla presente tanto en muestras recombinantes de fis como en muestras de cerebro de ratones con tauopatía. Una vez dominado.Esta técnica puede completarse en tres días, con solo una a dos horas de trabajo en el banco cada día. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se requerirá una optimización interna para ciertos pasos. Por ejemplo, al determinar títulos efectivos a partir de semillas protiopáticas de diversas fuentes biológicas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar, realizar y analizar experimentos de citometría de flujo FRET con el fin de detectar actividad de siembra protéica patológica procedente de fuentes recombinantes y biológicas.

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