Detección Sensible de Proteopathic Siembra Actividad con FRET Citometría de Flujo

El objetivo general de este procedimiento es detectar la actividad de siembra protio pática a partir de fuentes recombinantes o biológicas, lo que permite la detección sensible de proteínas, agregados y una muestra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurodegeneración. Por ejemplo, ¿cómo podríamos evaluar cuantitativamente los cambios en la actividad de siembra después de una intervención terapéutica en modelos animales de enfermedad?

Las ventajas de esta técnica incluyen su alta especificidad hacia bajos niveles de agregados proteicos. Su exquisita especificidad, su facilidad de uso y su alto rendimiento. Demostrando este procedimiento hoy estaré yo, junto con el coautor Brandon Holmes.

Para preparar el material biológico de la semilla, comience pesando el tejido cerebral congelado en un bote de suero desechable. Luego transfiera el tejido a un tubo cónico, agregue tampón de homogeneización helado, de modo que la solución final sea del 10% para esperar el volumen y transferir las muestras a una cámara fría con hielo. A continuación, ajuste una sonda para que el indicador tenga la configuración adecuada y enjuague a un lado y la parte inferior de la sonda.

Por lo tanto, el indicador se inclina tres veces como se indica, limpiando la sonda entre cada solución. Cuando la sonda esté lista, sumerja la punta en el tampón de homogeneización de una muestra e inicie el sonicato entregando 25 pulsos en total. Cuando el tejido esté completamente en suspensión, gire hacia abajo el homogeneizado y transfiera el supinato a un tubo limpio.

Teniendo cuidado de no perturbar el paladar. Si bien existen muchas otras técnicas de homogeneización, la probación es superior para aislar pequeñas cantidades de semillas protio pathic de muestras biológicas. La disociación mecánica permite una descomposición consistente y eficiente del tejido y la posterior extracción de semillas.

A continuación, alícuota en decúbito supino y almacenamiento de los lisados a menos 80 grados centígrados. Para reproducir las células biosensoras en condiciones estériles, enjuague cada línea celular con PBS tibio seguido de una incubación de tres minutos con tripsina EDTA. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con un medio de cultivo tibio e inmediatamente transfiera las células a un tubo cónico.

Centrifugar las células resus, suspendiendo el pellet en medio fresco. Luego cuente las células y haga una dilución celular de mezcla maestra de 3, 500, 000 células por 13 mililitros de medio. Con una pipeta multicanal, transfiera lentamente 130 microlitros de las células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejido de fondo plano, teniendo cuidado de colocar las puntas de la pipeta en el centro de los pocillos sin tocar el fondo de la placa.

Una vez que las células hayan sido colocadas, deje que se asienten sin perturbar durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego incube la placa durante la noche a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y mayor o igual al 80% de humedad relativa. Al día siguiente, cuando las células biosensoras estén confluentes entre un 60 y un 65%, combine el reactivo liposomado medio sérico reducido y la fuente de semillas biológicas para formar complejos de transducción. A continuación, pipetee 20 microlitros de complejo de transducción por el lateral de cada pocillo biosensor individual y devuelva las células tratadas a la incubadora durante otras 24 a 48 horas antes de la cosecha.

Las células no tratadas solo mostrarán fluorescencia difusa. Sin embargo, las células tratadas con material de semilla de tau mostrarán agregados brillantes Después de uno o dos días para cosechar las células, reemplace el medio de cultivo celular con 50 microlitros de intentina EDTA, deteniendo la reacción. Después de cinco minutos con 150 microlitros de cultivo refrigerado, medio, transfiera inmediatamente las células a una placa inferior redonda de 96 pocillos y granule las células, aspire los sobrenadantes S sin alterar los gránulos y, a continuación, suspenda suave pero completamente, suspenda las células en 50 microlitros de paraldehído al 2% durante 10 minutos.

A continuación, vuelva a centrifugar las células y vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de tampón de citometría de flujo refrigerado lo antes posible. Después de la fijación, cargue la placa en un citómetro de flujo compatible con trastes y genere un área de dispersión lateral frente al área de dispersión frontal por diagrama variante. A continuación, con la línea de celda uno en funcionamiento, ajuste los voltajes de dispersión lateral y dispersión directa hasta que la población de celdas esté en el cuadrante inferior izquierdo.

A continuación, con la herramienta de polígono, defina la población de células como marcha P uno. Ahora haga una altura de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión hacia adelante por diagrama de variante y aplique la puerta P one. A continuación, defina las celdas individuales como marcha P dos y genere un histograma cada una.

Para los filtros C-F-P-Y-F-P y de traste, aplique a la puerta P dos o tres histogramas diferentes, uno para el C-F-P-Y-F-P y otro para los filtros de traste para compensar. Pico de 30 microlitros de la línea celular una suspensión en 200 microlitros de la línea celular dos suspensión. A continuación, haga clic en el icono de configuración del instrumento seguido de la pestaña de compensación y marque la matriz para abrir la tabla de compensación.

Genere un área de traste frente al área CFP por gráfico de variables y aplique la puerta P dos. Luego, con la línea celular uno y la línea celular dos en ejecución, haga clic en el icono del cuadrante y dibuje cuadrantes como las poblaciones fluorescentes negativas y positivas que están separadas por los dos cuadrantes inferiores. Ahora cree una tabla de estadísticas que muestre la intensidad de fluorescencia media o MFI del traste para las puertas LL tres y LR tres y ajuste el parámetro del traste en la matriz de compensación hasta que el MFI de la señal del traste sea aproximadamente igual entre LL tres y LR tres.

A continuación, haga un área YFP frente a un área CFP mediante un gráfico variado con cuadrantes. Ajuste el parámetro YFP en la matriz de compensación hasta que el MFI de la señal YFP sea aproximadamente igual entre los cuadrantes. Similar al mostrado anteriormente para la citometría de flujo por traste.

El desbordamiento fluorescente primario se produce a partir de CFP emitido en el canal de detección de trastes, que se puede corregir mediante la compensación de fluorescencia utilizando las celdas de control positivo de un solo color cuando se han configurado todas las puertas y se ha compensado la señal CFP. Resalte los pozos de interés y ejecute el resto de la placa para analizar los datos. En primer lugar, defina las celdas y las celdas individuales utilizando los mismos parámetros que estamos configurando el análisis de flujo.

A continuación, utilizando la línea celular tres, trace las células positivas individuales de YFP en un traste frente a YFP mediante un gráfico variante. Dibuje una puerta poligonal que corre a lo largo y lejos de la pendiente de la población de celdas positivas del traste para definir una marcha de traste falso, que excluye el desbordamiento de YFP en el filtro de trastes. Después de aplicar la marcha del traste falso a todas las muestras, trace las células C-F-P-Y-F-P tratadas con liposomas vacíos en un traste frente a CFP mediante una gráfica variada e introduzca un ga poligonal a lo largo de la pendiente de la población que se extienda hacia arriba y hacia la izquierda alejándose de la población.

Cualquier evento que se desplace a esta puerta se considera positivo para el traste y el porcentaje de células se correlacionará con el título de semillas utilizado durante el tratamiento. Por último, registre los parámetros de análisis de interés, incluido el porcentaje de positividad del traste y la intensidad de fluorescencia media de las células positivas al traste. A continuación, mida el producto del porcentaje de positividad y el MFI para calcular manualmente la densidad de trastes integrada.

En ausencia de agregados o semillas de tau, la tau se mantiene en un estado monomérico soluble representado por una señal fluorescente difusa y negativa al traste constante. Tras la introducción de semillas de tau en las células biosensoras, la tau endógena se convierte en una cuantificación de traste agregada y en estado positivo. El análisis de citometría de flujo posterior confirma que las concentraciones femtomolares de tau recombinante son suficientes para la detección. Aquí.

El tejido del tronco encefálico de ratones tauopatía sacrificados a diferentes edades, sirve como una región representativa del cerebro, demostrando una detección consistente de la actividad de siembra en los animales a partir de los 1,5 meses de edad. En este experimento, los sujetos con un cerebro homogéneo de los sujetos con enfermedad de Alzheimer mostraron una actividad de siembra robusta, mientras que los sujetos con el control y la enfermedad de Huntington no demostraron la especificidad del ensayo para los agregados de tau en cultivos neuronales primarios no tratados transducidos con tau, CFP y tau. Las construcciones lentivirales de YFP exhibieron una señal fluorescente difusa tras el tratamiento con semillas de tau recombinantes.

Sin embargo, la tau endógena forma grandes agregados detectables por citometría de flujo incluso en ausencia de transducción mediada por liposomas. Cuando las fuentes de semillas se preincuban con fármacos que inhiben la absorción de tau, como la heparina, y se tratan en ausencia de liposomas, se puede bloquear la actividad de siembra contenida en las muestras de cerebro de ratón con fis recombinantes y tauopatía. Una vez dominado.

Esta técnica se puede completar en tres días con solo una o dos horas de trabajo en el banco cada día. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se requerirá una optimización interna para ciertos pasos. Por ejemplo, al determinar títulos efectivos a partir de semillas protio pathic de diversas fuentes biológicas.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo configurar, ejecutar y analizar experimentos de citometría de flujo de traste con el fin de detectar la actividad de siembra protio pática de fuentes recombinantes y biológicas.