Caspasa-3 La actividad en la amígdala de rata Medido por espectrofluorometría Después de Infarto de Miocardio

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad de la caspasa-3 en la amígdala de la rata tras un infarto de miocardio mediante espectrofluorometría. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la neurociencia conductual, como las consecuencias de un infarto de miocardio sobre el rendimiento cognitivo, la salud mental, el proceso de envejecimiento y el sueño. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla, rápida y confiable.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades porque requiere destreza quirúrgica y para el muestreo de tejidos. El procedimiento será demostrado por Kim Gilbert, una asistente de investigación en nuestro laboratorio. Después de inducir la anestesia según los protocolos institucionales aprobados, confirme una anestesia adecuada mediante la ausencia del reflejo al pellizco en la pata.

Intube al ratón con un tubo endotraqueal y coloque al animal en posición decúbito ventral sobre una almohadilla calefactora para mantener la temperatura corporal a 37 grados Celsius. Conecte el tubo endotraqueal a un equipo de anestesia que suministre isoflurano al 2%. A continuación, prepare el sitio quirúrgico con clorhexidina gluconato y alcohol isopropílico.

Y aplique pomada oftálmica en ambos ojos para prevenir la sequedad. Coloque un campo estéril sobre el animal para crear un área estéril alrededor del sitio quirúrgico. Y coloque los instrumentos quirúrgicos estériles necesarios en otro campo estéril junto al animal.

A continuación, haga una incisión en la piel con una hoja de bisturí número 10 o con tijeras. Utilice tijeras o una pinza hemostática para separar el tejido muscular. Luego, use tijeras o una pinza hemostática para abrir la pared torácica y coloque el retractor torácico, y abra el pericardio con la pinza hemostática.

Para inducir la oclusión coronaria, primero pase un hilo de seda de 360 milímetros de longitud calibre cuatro ceros alrededor de la arteria coronaria descendente y a través del tejido miocárdico contiguo. Introduzca ambos extremos del hilo de seda en un tubo plástico de calibre 14 y 1,25 centímetros de longitud. Tire de ambos extremos del hilo de seda y empuje el tubo hacia abajo contra la arteria para ocluirlo.

Asegure la oclusión mediante la pinza del tubo de plástico con una pinza hemostática y mantenga la oclusión durante 40 minutos. Después de 40 minutos, libere la oclusión retirando primero la pinza hemostática y luego el tubo flexible y el hilo de seda. Cierre la cavidad torácica con sutura número cero y coloque un catéter flexible a través de la cavidad torácica, extrayendo el aire del tórax con una jeringa de 10 mililitros para prevenir neumotórax.

Suture el músculo con hilo de seda 0 y la piel con hilo de seda 3-0. Antes de cerrar la última sutura de la piel, extraiga nuevamente el aire del tórax utilizando la jeringa de 10 mililitros y el catéter. Termine de cerrar la piel y luego detenga el isoflurano.

Coloque la rata en una jaula limpia y supervise durante la recuperación de la anestesia. Administre analgesia con dosis repetidas cada ocho horas. Después de decapitar al animal de forma humanitaria según los procedimientos aprobados, coloque la cabeza de la rata sobre un recipiente colocado en hielo triturado.

Use tijeras para abrir el cráneo. Luego use rongeurs para separar las láminas óseas sin mutilar el tejido subyacente, tirando hacia arriba. A continuación, coloque la hoja plana de una espátula entre la base del cráneo y la superficie ventral posterior del cerebro, y separe el cerebro del cráneo empujando suavemente la hoja hacia adelante, levantando el cerebro fuera del cráneo.

Coloque el cerebro sobre su superficie dorsal. Identifique el hipotálamo delante del cerebelo y corte el cerebro en sentido coronal delante del extremo posterior del hipotálamo y también detrás del extremo anterior. Identifique la amígdala bilateral como dos esferas pequeñas situadas debajo de los lóbulos temporales, justo al lado del hipotálamo.

Luego, coloque el cerebro boca abajo sobre su extremo frontal con la superficie dorsal alejada del experimentador. A continuación, separe los hemisferios y retire la corteza de la amígdala continua. Cuando se revele la amígdala, corte la amígdala con un bisturí.

Corte a lo largo de la sutura oscura que atraviesa la amígdala para separar las partes basolateral y medial central, y luego coloque las dos partes en tubos etiquetados separados sobre hielo. Este paso debe realizarse lo más rápido posible para evitar la degradación de las enzimas. Después de repetir el procedimiento de disección con el otro hemisferio, sumerja los cuatro tubos en nitrógeno líquido durante un minuto y luego almacénelos en el congelador a menos 80 grados Celsius.

Comience añadiendo 150 microlitros de tampón de lisis a cada cinco a 10 miligramos de muestra sobre hielo. Somete cada muestra a sonicación sobre hielo a intensidad máxima durante cinco segundos. A continuación, incube sobre hielo durante 30 minutos.

Durante la incubación, vortexee la muestra durante cinco segundos cada cinco minutos. A continuación, realice tres ciclos de congelación-descongelación colocando las muestras alternativamente en nitrógeno líquido y en una placa calefactora con control térmico ajustada a 37 grados Celsius. Después del último ciclo de congelación-descongelación, centrifugue las muestras de tejido a 1300 Gs a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.

A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante y transfiéralo a un tubo nuevo sobre hielo. Después de cuantificar la proteína según las instrucciones del protocolo escrito, agregue 25 microgramos de proteína a un tubo de reacción que contenga 0,8 microlitros de Ac-DEVD-AMC 10 milimolar y tampón de reacción, para un volumen final de 200 microlitros. Para las muestras de reacción negativa, combine 25 microgramos de proteína con un microlitro de Ac-DEVD-CHO 800 micromolar y 0,8 microlitros de Ac-DEVD-AMC 10 milimolar.

Incube todas las muestras y controles en la oscuridad durante tres horas a 37 grados Celsius. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, detenga la reacción con 600 microlitros de glicina 0,4 molar e hidróxido de sodio 0,4 molar a pH 10 en cada muestra y control. Añada dos mililitros de agua destilada a cada reacción en una cubeta de vidrio.

Cuantifique la fluorescencia mediante espectrofluorometría. Lea los controles y muestras durante 10 segundos con una lectura cada segundo. Finalmente, cuantifique la actividad específica en cada muestra según la fórmula que ahora aparece en pantalla.

Este histograma muestra la actividad de la caspasa-3 en la amígdala de ratas que han sufrido infarto de miocardio. Los datos se expresan como el porcentaje de la actividad media en los controles simulados, establecidos en un 100 %. Cada grupo constaba de ocho ratas. El asterisco indica una diferencia significativa entre grupos con un valor p menor a 0,05.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en siete horas, excluyendo el intervalo entre la cirugía de infarto de miocardio y la toma de muestras de tejido. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir un infarto de miocardio en una rata y medir la actividad de la caspasa-3 en la amígdala de la rata utilizando espectrofluorometría.