Caspasa-3 La actividad en la amígdala de rata Medido por espectrofluorometría Después de Infarto de Miocardio

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad de la caspasa-3 en la amígdala de rata después de un infarto de miocardio mediante espectrofluorometría. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la ciencia neural del comportamiento, como las consecuencias de un infarto de miocardio en el rendimiento cognitivo, la salud mental, el proceso de envejecimiento y el sueño. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla, rápida y fiable.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades porque requiere la destreza para la cirugía y la toma de muestras de tejidos. La demostración del procedimiento estará a cargo de Kim Gilbert, asistente de investigación en nuestro laboratorio. Después de inducir la anestesia de acuerdo con los protocolos institucionales aprobados, confirmar la anestesia adecuada a través de la ausencia del reflejo de pinzamiento de la pata.

Intuble a la rata con un tubo endotraqueal y coloque al animal en posición de decúbito ventral sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal a 37 grados centígrados. Conecte el tubo endotraqueal a una máquina de anestesia que dispense isofluorano al 2%. A continuación, prepare el sitio quirúrgico con gluconato de clorhexidina y alcohol isopropílico.

Y aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para prevenir la sequedad. Coloque un paño estéril sobre el animal para crear un campo estéril alrededor del sitio quirúrgico. Y coloque los instrumentos quirúrgicos estériles requeridos en otro campo estéril junto al animal.

A continuación, haga una incisión en la piel con una hoja de bisturí número 10 o unas tijeras. Use tijeras o una pinza hemostática para despegar el tejido muscular. A continuación, utilice unas tijeras o una pinza hemostática para abrir la pared torácica y colocar el retractor torácico, y abra el pericardio con la pinza hemostática.

Para inducir la oclusión coronaria, primero se coloca una sutura de seda de 360 milímetros de largo alrededor de la arteria coronaria descendente y a través del tejido miocárdico contiguo. Inserta ambos extremos de la sutura de seda en un tubo de plástico de calibre 14 de 1,25 centímetros de largo. Tire de ambos extremos de la sutura de seda y empuje el tubo hacia abajo contra la arteria para ocluirla.

Asegure la oclusión sujetando el tubo de plástico con una pinza hemostática y mantenga la oclusión durante 40 minutos. Después de 40 minutos, libere la oclusión retirando la pinza hemostática y luego el tubo flexible y la sutura de seda. Cierre el tórax con dos suturas cero y coloque un catéter flexible a través de la cavidad torácica y extraiga el aire del tórax con una jeringa de 10 mililitros para prevenir el neumotórax.

Coser el músculo con cuatro suturas de seda cero y la piel con tres suturas de seda cero. Antes de cerrar la última sutura cutánea, vuelva a extraer aire del tórax con la jeringa de 10 mililitros y el catéter. Termine de cerrar la piel y luego detenga el isofluorano.

Coloque a la rata en una jaula limpia y vigile durante la recuperación de la anestesia. Administrar analgesia con dosis repetidas cada ocho horas. Después de decapitar humanamente al animal de acuerdo con los procedimientos aprobados, coloque la cabeza de la rata en un plato colocado sobre hielo picado.

Usa unas tijeras para abrir el cráneo. A continuación, utilice rongeurs para separar las gavillas de hueso sin mutilar el tejido subyacente tirando hacia arriba. A continuación, coloque la hoja plana de una espátula entre la parte inferior del cráneo y la superficie ventral posterior del cerebro y separe el cerebro del cráneo empujando suavemente la hoja hacia adelante, levantando el cerebro fuera del cráneo.

Coloca el cerebro sobre su superficie dorsal. Identifique el hipotálamo delante del cerebelo y corte el cerebro coronalmente por delante del extremo posterior del hipotálamo y también por detrás del extremo anterior. Identifica la amígdala bilateral como dos pequeñas esferas debajo de los lóbulos temporales, justo al lado del hipotálamo.

A continuación, voltea el cerebro sobre su extremo frontal con la superficie dorsal alejada del experimentador. A continuación, separa los hemisferios y retira la corteza de la amígdala continua. Cuando se revele la amígdala, córtela con un bisturí.

Corte a lo largo de la sutura oscura que atraviesa la amígdala para separar las partes basolateral y medial central y luego coloque las dos partes en tubos etiquetados separados sobre hielo. Este paso debe realizarse lo más rápido posible para evitar el deterioro de las enzimas. Después de repetir el procedimiento de disección con el otro hemisferio, sumerja los cuatro viales en nitrógeno líquido durante un minuto y luego guárdelos en el congelador a 80 grados centígrados negativos.

Comience agregando 150 microlitros de tampón de lisis a cada cinco a 10 miligramos de muestra en hielo. Sonicar cada muestra en hielo a máxima intensidad durante cinco segundos. Luego incube en hielo durante 30 minutos.

Durante la incubación, agite la muestra durante cinco segundos cada cinco minutos. A continuación, realice tres ciclos de congelación-descongelación colocando las muestras alternativamente en nitrógeno líquido y en una placa calefactora controlada termostáticamente a 37 grados centígrados. Después del ciclo final de congelación y descongelación, centrifugar las muestras de tejido a 1300 G a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.

A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante y transfiéralo a un tubo nuevo con hielo. Después de cuantificar la proteína de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito, agregue 25 microgramos de proteína a un tubo de reacción que contenga 0,8 microlitros de Ac-DEVD-AMC de 10 milimolares y tampón de reacción para un volumen final de 200 microlitros. Para muestras de reacción negativa, combine 25 microgramos de proteína con un microlitro de Ac-DEVD-CHO de 800 micromolares y 0,8 microlitros de Ac-DEVD-AMC de 10 milimolares.

Incubar todas las muestras y controles en la oscuridad durante tres horas a 37 grados centígrados. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, detenga la reacción con 600 microlitros de glicina 0,4 molar e hidróxido de sodio 0,4 molar a pH 10 en cada muestra y control. Agregue dos mililitros de agua destilada a cada reacción en una cubeta de vidrio.

Cuantificar la fluorescencia por espectrofluorometría. Lea controles y muestras durante 10 segundos con una lectura por segundo. Finalmente, cuantifique la actividad específica en cada muestra de acuerdo con la fórmula que ahora se muestra en la pantalla.

Este histograma muestra la actividad de la caspasa-3 en la amígdala de ratas que han sufrido un infarto de miocardio. Los datos se expresan como el porcentaje de actividad media en los controles simulados establecido en 100%Cada grupo constaba de ocho ratas. El asterisco indica una diferencia significativa entre los grupos con un valor de p inferior a 0,05.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en siete horas, excluyendo el intervalo entre la cirugía de infarto de miocardio y la toma de muestras de tejido. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir un infarto de miocardio en una rata y medir la actividad de la caspasa-3 en la amígdala de la rata mediante espectrofluorometría.