Name: Caspasa-3 La actividad en la amígdala de rata Medido por espectrofluorometría Después de Infarto de Miocardio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a medir la actividad de caspasa-3 en la amígdala de rata tras infarto de miocardio mediante espectrofluorometría. Este método permite estudiar la apoptosis cerebral y sus consecuencias cognitivas.

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. Este trabajo fue apoyado por una beca de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá Kim Gilbert mantiene una beca de Fonds de la recherche du Québec - Santé.

Los animales son manejados de acuerdo con la regulación del Comité de Cuidado de Animales local, de conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales. Las ratas se alojan individualmente bajo condiciones constantes (temperatura de 21-22 ºC y una humedad del 40-50%), incluyendo un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, comenzando a las 08:00 am. Pellets de Chow y agua corriente están disponibles ad libitum durante todo el estudio. Se permite un período de aclimatación de 3 días después de la entrega por el proveedor antes del experimento. Ratas macho Sprague-Dawley con un peso de 300-800 g entre han sido utilizados rutinariamente con este protocolo. 1. MI Cirugía <ol><li> Inducir la anestesia con inyecciones intraperitoneales de ketamina 60 mg / kg y xilazina 10 mg / kg. Confirme anestesia adecuada por la ausencia de reflejos cuando se pellizcan las zarpas. </li><li> Afeitado sitio quirúrgico. Intubar rata con un tubo endotraqueal: catéter (16G 1,77 pulgadas) y colocar los animales en decúbito lateral. Coloque los animales en una almohadilla térmica para mantener la temperatura alrededor de 37 ° C. Conecte el tubo endotraqueal al isoflurano 2%. </li><li> Preparar sitio quirúrgico con gluconato de clorhexidina y alcohol isopropílico. Durante la cirugía, use guantes estériles e instrumentos esterilizados. Aplicar pomada oftálmica de ambos ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Ponga campo estéril en los animales y los instrumentos sobre otro campo estéril al lado del animal. </li><li> Incisión de la piel con hoja de bisturí # 10. Despegar el tejido muscular con una pinza hemostática. Colocar el animal en decúbito ventral. Pared torácica abierta con una pinza y la posición de retracción torácica hemostático. Pericardio abierto con una pinza hemostática. </li><li> Para producir la oclusión coronaria, un bucle de 360 ​​mm de largo sutura de seda de 4-0 alrededor de la arteria coronaria descendente, pasa a través del tejido miocárdico contigua. Inserte ambos extremos de la sutura de seda en una 14G, tubo de plástico largo 1,25 cm. </li><li> Tire de ambos extremos de la sutura de seda y push el tubo hacia abajo contra la arteria para ocluir que, por 40 min. Oclusión Secure sujetando el tubo de plástico con una pinza hemostática. </li><li> Después de 40 min, liberar la oclusión por la liberación de la pinza hemostática, seguido de la eliminación del tubo flexible de sutura y seda. Nota: el control de ratas Sham someten al mismo procedimiento quirúrgico menos la oclusión de la arteria coronaria. </li><li> Antes de cerrar la pared torácica, colocar un catéter flexible (18G, 4,5 cm) a través de la cavidad torácica para extraer el aire fuera del tórax con una jeringa de 5 ml para prevenir el neumotórax. </li><li> Cerrar cavidad torácica con 2-0 sutura, puntada del músculo con 4-0 sutura de seda y la piel con sutura de seda 3-0. </li><li> Antes de cerrar el último punto de la piel, de nuevo extraer el aire fuera del tórax con 5 ml jeringa a través del catéter colocado previamente en la cavidad del tórax. </li><li> Suturar último punto de la piel. Deje de ventilación isoflurano. </li><li> Monitorear el despertar de la rata. No deje a un animal sin vigilancia hasta que tenga regained conciencia suficiente para mantener decúbito esternal. </li><li> Tratar rata cada 8 h durante 24 h con un analgésico (buprenorfina, 0,05 mg / kg ip) y con un antibiótico (una dosis única de duplocillin, 0,2 mg / kg ip). </li><li> Después de la cirugía, las ratas de la casa de forma individual hasta la hora del sacrificio, es decir, 3 días después de la MI. </li><li> El tamaño del infarto, principalmente necrosis, se expresa como el porcentaje de tejido infartado en el área en riesgo del ventrículo izquierdo. Esto puede medido utilizando la coloración de trifeniltetrazolio 11. </li></ol> 2. amígdala Aislamiento <ol><li> Coloque la cabeza del animal por primera vez en una bolsa en forma de cono, con su nariz que sobresale de la abertura de extremo estrecho. Rata seguro para evitar cualquier movimiento. Coloque la cabeza apropiada en la guillotina, entre las hojas de las tijeras. Decapitar a los animales. </li><li> Coloque la cabeza de la rata en un plato mantuvo en hielo picado. Realizar todos los procedimientos para el aislamiento de tejido en hielo picado (4 ° C). </li><li> Sk abierta Cortarull con tijeras, separar cuidadosamente envolturas óseas con gubia ósea tirando hacia arriba y evitar la mutilación de los tejidos debajo. </li><li> Coloque la punta plana de una espátula entre la parte inferior del cráneo y la superficie ventral posterior del cerebro y separar cuidadosamente cerebro de cráneo empujando suavemente la cuchilla hacia adelante a lo largo de la parte inferior del cráneo hasta que el cerebro puede ser levantado lentamente fuera de la cráneo. Deseche el cráneo. </li><li> Coloque el cerebro en su superficie dorsal. Identificar hipotálamo (estructura en la parte delantera del cerebelo) y cortar el cerebro coronal delante de su extremo anterior y detrás de su extremo posterior; descartar las partes anterior y posterior del cerebro si no es necesario para otros usos. </li><li> Visualice las amígdalas como pequeñas esferas debajo de los lóbulos temporales, de forma bilateral, justo al lado del hipotálamo. </li><li> Da la vuelta al cerebro plana en su extremo frontal, superficie dorsal de distancia del experimentador. </li><li> Comience con el lado izquierdo o derecho del cerebro. Separar el hemiesferas y luego la corteza de la amígdala contigua. Cortar manera alrededor de 8 mm de esta corteza floja para permitir el aislamiento de la amígdala. Cortar la amígdala con el bisturí. </li><li> Aislar la parte basolateral de la amígdala de su parte centromedial cortando a lo largo de la sutura oscura que corre a través de ella, casi mitad y mitad. Esta estructura no siempre es fácil de identificar. </li><li> Ponga subpartes amígdala en viales identificados por separado y mantener en hielo picado. </li><li> Procedimiento de disección Repita con el otro hemisferio. </li><li> Sumergir viales en nitrógeno líquido durante 1 min. Mantenga vial en -80 ° C congelador hasta que se necesite. </li></ol> 3. actividad caspasa-3 <ol><li> Preparar tampón de lisis con 0,32 M de sacarosa, 1% de Triton-X-100, 10 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético, 2 mM de ditiotreitol, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 mg / l de leupeptina , 10 g / l de pepstatina A y 10 g / l de aprotinina. </li><li>Añadir 150 ml de tampón de lisis a cada muestra (5-10 mg). Mantenga en hielo. Sonicar cada muestra en hielo durante 5 segundos a intensidad máxima (40 W). Incubar el tejido en tampón de lisis en hielo durante 30 min. Vortex cada muestra durante 5 min. </li><li> Realizar ciclos de 3 de congelación / descongelación colocando alternativamente muestras en nitrógeno líquido y en una placa de calefacción controlada por termostato a 37 ° C. Centrifugar a 13000 tejido g (4 ° C) durante 10 min. Retire con cuidado el sobrenadante y mantener en el tubo en hielo. </li><li> Preparar las concentraciones de proteína estándar entre 0 y 10 mg / ml con albúmina de suero bovino. Preparar espacios en blanco con solamente búfer. </li><li> Añadir 200 l de reactivo de Bradford a cada norma. Leer estándar a 595 nm. Para los niveles de proteína, añadir 5 l de muestra de sobrenadante a 795 l de agua destilada y 200 l de reactivo de Bradford. Lea cada muestra a 595 nm y cuantificar la proteína con la curva estándar. </li><li> Preparar tampón de reacción con 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM de MgCl de 2 &lt;/ sub&gt;, 1 mM de ácido tetraacético etilenglicol, 0,1% de 3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato y 1 mM de ditiotreitol. </li><li> Añadir 25 g de proteína a sustratos de tampón de reacción y la caspasa-3 para obtener muestras de reactivos positivos y negativos. Para las muestras negativas, añadir tampón de reacción, 25 g de proteína, 0,4 l de Ac-DEVD-CHO 800 mM y 0,8 l de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Para las muestras positivas, añadir 25 g de proteína al tampón de reacción y 0,8 l de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Procesar todas las muestras negativas y positivas por triplicado. Completar el volumen final de cada muestra hasta 200 l mediante la adición de tampón de reacción. </li><li> Producir controles negativos mediante la adición de 188,7 l de tampón de reacción a 0,5 l de Ac-DEVD-CHO 800 M, 0,8 l Ac-DEVD-AMC 10 mM y 10 l de tampón de lisis. Para los controles positivos, añadir 189,2 l de tampón de reacción, 0,8 l de Ac-DEVD-AMC 10 mM y 10 l de tampón de lisis. </li><li> Incubar las muestras ycontroles en la oscuridad durante 3 horas a 37 ° C </li><li> Detener la reacción con 600 l de glicina 0,4 M y NaOH 0,4 M (pH 10) en cada muestra y control. </li><li> Cuantificar la fluorescencia por espectrofluorometría en la excitación de longitud de onda de 365 nm de longitud de onda y la emisión de 465 nm. Añadir 2 ml de agua destilada a la reacción en cubeta de vidrio. Leer los controles y las muestras durante 10 segundos con 1 punto en cada seg. </li><li> Cuantificar la actividad específica en cada muestra: ((La fluorescencia de las muestras negativas, menos la fluorescencia de las muestras positivas) x volumen de 2,8 ml) dividido por (tiempo de incubación de 3 horas x cantidad de proteína de 25 mg). </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestra experiencia con este protocolo en los últimos 10 años llevó a la identificación de las cuestiones metodológicas críticos. En primer lugar, la disección rápido del cerebro en un plato de Petri en hielo picado es importante para mantener la calidad de preparación. En segundo lugar, debe tenerse en cuenta que la sonicación tejido es más corto para la amígdala cerebral en comparación con otros tipos de tejidos, tales como el corazón (10 seg) o riñones (20 seg). En tercer lugar, el gran cuidado se debe tomar para mezclar cuidadosamente el sustrato antes de añadir a las muestras. Nos encontramos con señales variables cuando la secuencia de mezcla era inadecuada. En cuarto lugar, no hay burbujas deben estar presentes en la celda de cuarzo cuando se leen las muestras. De lo contrario, la señal podría ser alterado. Hicimos un cambio en los últimos años para aumentar la reproducibilidad de los resultados: el aumento de volumen de sustrato para evitar el volumen de menos de 1 l. Sin embargo, las pequeñas variaciones pueden ocurrir entre ensayos sucesivos, y al menos 3 muestras de control deben ser usado paracontrol para variaciones. Medidas de fluorescencia de estos controles se promedian y la media se fija en el 100%. Medidas de fluorescencia en las muestras experimentales se transforman en porcentaje de las muestras de control. Otra limitación de la técnica es que sólo se utiliza una porción de tejido y, por lo tanto, la caspasa-3 actividad podría ser subestimada. De hecho, la ventana de tiempo de la apoptosis es corto en cualquier célula dada y podría perderse a pesar de que se produce en las zonas vecinas en el momento de muestreo 1,4,15. Lo contrario también es posible: la apoptosis podría ser particularmente intensa en porciones de tejido, dando lugar a una sobreestimación de la caspasa-3 actividad. Se recomienda el uso de los tejidos restantes (la amígdala) para técnicas complementarias, tales como ensayos TUNEL o relación Bax / Bcl2 (véase la Introducción). Espectrofluorometría tiene al menos dos ventajas sobre la transferencia Western. En primer lugar, se genera directamente datos cuantitativos. En segundo lugar, mide enzimática unsí mismo en lugar de proteína o la expresión del ARN, que puede ser no relacionado, y se sabe que la expresión de proteínas se puede aumentar sin ningún cambio en la actividad enzimática ctividad. Por otra parte, espectrofluorometría se puede realizar en otros tejidos o con diferentes especies de animales y se puede ajustar para otros subtipos de caspasas, con diferentes sustratos, por lo que las comparaciones de seguros puede ser hecho. En conclusión, este documento demuestra el uso de espectrofluorometría para medir la caspasa-3 actividad en la amígdala, proporcionando evidencia de que la apoptosis se produce en esta región del sistema límbico 3 días después de un IM.

Las caspasas o aspartato proteasas dirigida cisteína-dependientes son una familia de enzimas que están implicadas en diversos homeostasis processess 1. Las caspasas pueden clasificarse ampliamente en función de sus roles en la apoptosis o la inflamación. Caspasa-1, -4, -5 y -12 están involucrados en la inflamación, mientras que quienes se dedican a la apoptosis puede ser sub-clasificado como caspasas iniciadoras (caspasa-8 y -9) y caspasas verdugo (caspasa-3, -6 y -7 ). Las caspasas desempeñan papeles importantes en muchas patologías, principalmente en trastornos en los que la apoptosis puede ser excesivo, como se observa después de un infarto de miocardio (MI) o isquemia cerebral. En el modelo de rata del síndrome post-MI utilizado en nuestro laboratorio, se establece que se activa la caspasa-3 no sólo en el miocardio 2, sino también en el sistema límbico que está implicada en el control del estado de ánimo y emociones 3-6. También se ve que se activa la caspasa-3 en diferentes regionesdel sistema límbico, como la amígdala y el hipocampo, y esta activación picos alrededor de 3 días después de la lesión isquémica 4. Curiosamente, la caspasa-3 actividad se correlaciona con el post-MI alteraciones de comportamiento y su atenuación mediante intervenciones farmacológicas y nutricionales reduce estas lesiones, lo que sugiere una posible relación entre la caspasa-3 y post-MI depresión 7-12. Caspasa-3 de activación se puede medir mediante diversas técnicas. Western Blot comprueba las propiedades enzimáticas de las caspasas y puede detectar enzimas activas, así como sus formas pro-enzima. Western Blot, sin embargo, es semi-cuantitativa, y pequeñas variaciones se puede perder por la debilidad de la relación señal-ruido de 13. Una mejor técnica se basa en la escisión de un sustrato (DEVD-AMC) por la caspasa-3 que libera un compuesto fluorogénico y se puede medir por espectrofluorometría. Caspasa-3 de activación es un marcador fiable de la apoptosis. Medición de la apoptosis can ser inestable debido a que la ventana de tiempo de ocurrencia es corto, y las células vecinas pueden fagocitar cuerpos apoptóticos o células 14. La apoptosis se puede confirmar más mediante otras técnicas, tales como Terminal desoxinucleotidil transferasa dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) de ensayo, que detecta la fragmentación de ADN resultante de las cascadas de señalización de apoptosis 6, o la relación de las proteínas pro / anti-apoptóticos, tales como Bax / Bcl2 6.

<table><tbody><tr><td>Espectroflurómetro</td><td>Instrumento de tecnología de fotones (ahora Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>con DeltaRAM&nbsp; Monocromador de acceso aleatorio&nbsp;</td></tr><tr><td>Respirador</td><td>Aparato Harvard</td><td>683</td><td>ventilación para animales pequeños</td></tr><tr><td>Cubeta de vidrio</td><td>Celdas de precisión NSG</td><td>3G10</td><td>Vidrio óptico (340-2.500 nm) 10 mm de recorrido</td></tr><tr><td>Sonicador</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&nbsp; series</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

caspasa-3 la actividad en la amígdala de rata medido por espectrofluorometría después de infarto de miocardio

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

El infarto de miocardio (IM) tiene a medio y largo plazo consecuencias dramáticas en los niveles fisiológicos y de comportamiento, pero los mecanismos involucrados aún no están claros. Nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo de rata de síndrome post-MI que muestra alteraciones funcionales cardíacas, pérdida neuronal en el sistema límbico, déficits cognitivos y conductuales signos de depresión. A nivel neuronal, la caspasa-3 de activación media post-MI apoptosis en diferentes regiones límbicas, como la amígdala - alcanzando un máximo de 3 días después de la MI. Alteraciones cognitivas y conductuales aparecen 2-3 semanas después de la MI y éstas se correlacionan estadísticamente con medidas de actividad caspasa-3. El protocolo descrito aquí se utiliza para inducir MI, recoger el tejido de la amígdala y medir actividad caspasa-3 utilizando espectrofluorometría. Para inducir la MI, la arteria coronaria descendente se ocluye durante 40 min. El protocolo para la evaluación de la caspasa-3 de activación empieza 3 días después de MI: las ratas se sacrificaron y se aisló la amígdala RAPIDLY desde el cerebro. Las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80 ° C hasta su análisis real. La técnica que se realiza para evaluar la activación de la caspasa-3 se basa en la escisión de un sustrato (DEVD-AMC) por la caspasa-3, que libera un compuesto fluorogénico que se puede medir por espectrofluorometría. La metodología es cuantitativa y reproducible pero el equipo requerido es caro y el procedimiento para la cuantificación de las muestras consume mucho tiempo. Esta técnica se puede aplicar a otros tejidos, tales como el corazón y los riñones. DEVD-AMC puede sustituirse por otros sustratos para medir la actividad de otras caspasas.

La amígdala fue aislado en 8 simulado (control) y 8 ratas MI tres días después de la inducción del protocolo de isquemia / reperfusión. Caspasa-3 se midió la actividad en este tejido usando un fluorocromo que se puede escindir por la caspasa-3 activa y se detecta por espectrofluorometría. Medidas positivas y negativas (consulte los pasos 3.11, 3.12 y 3.16) se realizaron por triplicado y se midieron durante 10 seg, con 1 punto en cada seg. Se calcularon las diferencias entre los controles positivos y negativos y el promedio de las diferencias para todo el tejido simulado realizado durante este experimento se fijó en 100%. Los resultados de las ratas MI fueron escalados de acuerdo con esta referencia y Figura 1 ilustra los resultados finales: indica una actividad significativamente mayor en ratas MI en comparación con simulado (p &lt;0,05). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> Figura 1. La caspasa-3actividad en la amígdala de ratas MI, expresado como porcentaje de la actividad media de controles simulados, se establece en 100% (8 ratas por grupo). * Indica diferencia significativa entre los grupos (p &lt;0,05). Los datos se expresan como media ± SEM.

El infarto de miocardio (IM) no solo va seguido de un deterioro de la función cardíaca, sino también de una apoptosis en la amígdala, una región del cerebro implicada en las consecuencias conductuales del IM. Este protocolo describe cómo inducir el infarto de miocardio, recolectar tejido de la amígdala y medir la actividad de la caspasa-3, un marcador de apoptosis.

Caspasa-3 La actividad en la amígdala de rata Medido por espectrofluorometría Después de Infarto de Miocardio

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad de la caspasa-3 en la amígdala de la rata tras un infarto de miocardio mediante espectrofluorometría. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la neurociencia conductual, como las consecuencias de un infarto de miocardio sobre el rendimiento cognitivo, la salud mental, el proceso de envejecimiento y el sueño. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla, rápida y confiable.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades porque requiere destreza quirúrgica y para el muestreo de tejidos. El procedimiento será demostrado por Kim Gilbert, una asistente de investigación en nuestro laboratorio. Después de inducir la anestesia según los protocolos institucionales aprobados, confirme una anestesia adecuada mediante la ausencia del reflejo al pellizco en la pata.Intube al ratón con un tubo endotraqueal y coloque al animal en posición decúbito ventral sobre una almohadilla calefactora para mantener la temperatura corporal a 37 grados Celsius. Conecte el tubo endotraqueal a un equipo de anestesia que suministre isoflurano al 2%. A continuación, prepare el sitio quirúrgico con clorhexidina gluconato y alcohol isopropílico.Y aplique pomada oftálmica en ambos ojos para prevenir la sequedad. Coloque un campo estéril sobre el animal para crear un área estéril alrededor del sitio quirúrgico. Y coloque los instrumentos quirúrgicos estériles necesarios en otro campo estéril junto al animal.A continuación, haga una incisión en la piel con una hoja de bisturí número 10 o con tijeras. Utilice tijeras o una pinza hemostática para separar el tejido muscular. Luego, use tijeras o una pinza hemostática para abrir la pared torácica y coloque el retractor torácico, y abra el pericardio con la pinza hemostática.Para inducir la oclusión coronaria, primero pase un hilo de seda de 360 milímetros de longitud calibre cuatro ceros alrededor de la arteria coronaria descendente y a través del tejido miocárdico contiguo. Introduzca ambos extremos del hilo de seda en un tubo plástico de calibre 14 y 1,25 centímetros de longitud. Tire de ambos extremos del hilo de seda y empuje el tubo hacia abajo contra la arteria para ocluirlo.Asegure la oclusión mediante la pinza del tubo de plástico con una pinza hemostática y mantenga la oclusión durante 40 minutos. Después de 40 minutos, libere la oclusión retirando primero la pinza hemostática y luego el tubo flexible y el hilo de seda. Cierre la cavidad torácica con sutura número cero y coloque un catéter flexible a través de la cavidad torácica, extrayendo el aire del tórax con una jeringa de 10 mililitros para prevenir neumotórax.Suture el músculo con hilo de seda 0 y la piel con hilo de seda 3-0. Antes de cerrar la última sutura de la piel, extraiga nuevamente el aire del tórax utilizando la jeringa de 10 mililitros y el catéter. Termine de cerrar la piel y luego detenga el isoflurano.Coloque la rata en una jaula limpia y supervise durante la recuperación de la anestesia. Administre analgesia con dosis repetidas cada ocho horas. Después de decapitar al animal de forma humanitaria según los procedimientos aprobados, coloque la cabeza de la rata sobre un recipiente colocado en hielo triturado.Use tijeras para abrir el cráneo. Luego use rongeurs para separar las láminas óseas sin mutilar el tejido subyacente, tirando hacia arriba. A continuación, coloque la hoja plana de una espátula entre la base del cráneo y la superficie ventral posterior del cerebro, y separe el cerebro del cráneo empujando suavemente la hoja hacia adelante, levantando el cerebro fuera del cráneo.Coloque el cerebro sobre su superficie dorsal. Identifique el hipotálamo delante del cerebelo y corte el cerebro en sentido coronal delante del extremo posterior del hipotálamo y también detrás del extremo anterior. Identifique la amígdala bilateral como dos esferas pequeñas situadas debajo de los lóbulos temporales, justo al lado del hipotálamo.Luego, coloque el cerebro boca abajo sobre su extremo frontal con la superficie dorsal alejada del experimentador. A continuación, separe los hemisferios y retire la corteza de la amígdala continua. Cuando se revele la amígdala, corte la amígdala con un bisturí.Corte a lo largo de la sutura oscura que atraviesa la amígdala para separar las partes basolateral y medial central, y luego coloque las dos partes en tubos etiquetados separados sobre hielo. Este paso debe realizarse lo más rápido posible para evitar la degradación de las enzimas. Después de repetir el procedimiento de disección con el otro hemisferio, sumerja los cuatro tubos en nitrógeno líquido durante un minuto y luego almacénelos en el congelador a menos 80 grados Celsius.Comience añadiendo 150 microlitros de tampón de lisis a cada cinco a 10 miligramos de muestra sobre hielo. Somete cada muestra a sonicación sobre hielo a intensidad máxima durante cinco segundos. A continuación, incube sobre hielo durante 30 minutos.Durante la incubación, vortexee la muestra durante cinco segundos cada cinco minutos. A continuación, realice tres ciclos de congelación-descongelación colocando las muestras alternativamente en nitrógeno líquido y en una placa calefactora con control térmico ajustada a 37 grados Celsius. Después del último ciclo de congelación-descongelación, centrifugue las muestras de tejido a 1300 Gs a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante y transfiéralo a un tubo nuevo sobre hielo. Después de cuantificar la proteína según las instrucciones del protocolo escrito, agregue 25 microgramos de proteína a un tubo de reacción que contenga 0,8 microlitros de Ac-DEVD-AMC 10 milimolar y tampón de reacción, para un volumen final de 200 microlitros. Para las muestras de reacción negativa, combine 25 microgramos de proteína con un microlitro de Ac-DEVD-CHO 800 micromolar y 0,8 microlitros de Ac-DEVD-AMC 10 milimolar.Incube todas las muestras y controles en la oscuridad durante tres horas a 37 grados Celsius. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, detenga la reacción con 600 microlitros de glicina 0,4 molar e hidróxido de sodio 0,4 molar a pH 10 en cada muestra y control. Añada dos mililitros de agua destilada a cada reacción en una cubeta de vidrio.Cuantifique la fluorescencia mediante espectrofluorometría. Lea los controles y muestras durante 10 segundos con una lectura cada segundo. Finalmente, cuantifique la actividad específica en cada muestra según la fórmula que ahora aparece en pantalla.Este histograma muestra la actividad de la caspasa-3 en la amígdala de ratas que han sufrido infarto de miocardio. Los datos se expresan como el porcentaje de la actividad media en los controles simulados, establecidos en un 100 %. Cada grupo constaba de ocho ratas. El asterisco indica una diferencia significativa entre grupos con un valor p menor a 0,05.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en siete horas, excluyendo el intervalo entre la cirugía de infarto de miocardio y la toma de muestras de tejido. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir un infarto de miocardio en una rata y medir la actividad de la caspasa-3 en la amígdala de la rata utilizando espectrofluorometría.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

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