La purificación de los buques de cerebro de ratón
10 de noviembre de 2015
Describimos un protocolo que permite la purificación del compartimento vascular del cerebro del ratón. Los vasos cerebrales aislados incluyen células endoteliales unidas por uniones estrechas y rodeadas por una lámina basal continua, pericitos, células musculares lisas vasculares, así como membranas astrogliales perivasculares.
El objetivo general del procedimiento es purificar el compartimento vascular del cerebro de ratón manteniendo su integridad estructural, mediante una serie de centrifugaciones lentas y filtraciones, sin necesidad de anticuerpos específicos ni cepas transgénicas. Se han realizado muchos esfuerzos para desarrollar técnicas que permitan investigaciones celulares, moleculares y farmacológicas de la barrera hematoencefálica. La ausencia de separación, gradientes, columnas o pasos de centrifugación a alta velocidad hace que la purificación de los vasos cerebrales mediante este procedimiento sea muy sencilla, rápida y económica.
Los vasos cerebrales permanecerán estructuralmente intactos con las células endoteliales selladas por uniones en forma de etiqueta y rodeadas por parásitos basolaterales, la mayoría de las células musculares vasculares y las membranas astro perivasculares. Este protocolo puede ayudar a responder preguntas clave sobre la función del compartimento vascular de la CE y permitir el estudio de su composición molecular, demostrando que el procedimiento será un rol para un posdoctorado del equipo de Martin Coen S. Antes de comenzar el procedimiento, corte la parte inferior de la sección superior roscada del soporte del filtro.
Luego, use un escalpelo para incisionar la piel desde el cuello del ratón hasta la nariz y retire la piel hacia atrás. Lave el cráneo con PBS para eliminar cualquier pelo contaminante y, a continuación, inserte un par de tijeras en el cráneo anterior a los bulbos olfativos. Abra las tijeras para romper el cráneo en partes y extraiga el cerebro con la espátula.
A continuación, diseccione el plexo coroideo de los ventrículos laterales y transfiera el cerebro a un vaso de precipitados de 150 mililitros que contenga 20 mililitros de solución B1 sobre hielo. Luego, use dos escalpelos para cortar enérgicamente el cerebro en fragmentos de tejido de dos milímetros y utilice un homogenizador automático tipo Dounce para homogeneizar el tejido durante 20 golpes a 400 RPM sobre hielo. Para purificar los vasos, transfiera el homogenizado a un tubo plástico de 50 mililitros y centrifugue la suspensión de tejido.
En una centrífuga con rotor oscilante, se formará una gran interfase blanca compuesta principalmente de mielina en la parte superior del precipitado del recipiente. Deseche el sobrenadante junto con 20 mililitros de solución B dos fría con hielo y agite el tubo vigorosamente durante un minuto. Tras una segunda centrifugación, la mielina formará una capa blanca densa en la superficie del sobrenadante.
Gire lentamente el tubo para permitir que la solución B dos fluya por la pared al verterla y deseche la mielina junto con el sobrenadante. Luego, use una pipeta de plástico envuelta en papel absorbente para eliminar cualquier líquido residual de las paredes del tubo. Tenga cuidado de no tocar el precipitado del vaso y coloque el tubo boca abajo sobre hielo.
A continuación, resuspenda el precipitado en un mililitro de solución B tres fría con hielo, seguido por la adición de otros cinco mililitros de solución B tres, teniendo cuidado de que los vasos no formen agregados. Coloque ahora un filtro de malla de nailon de 20 micrones encima de un matraz Erlenmeyer y equilibre el filtro con 10 mililitros de solución B tres fría con hielo. Vierta la preparación de vasos sobre el filtro y enjuague cuidadosamente los vasos con otros 40 mililitros de solución B tres fría con hielo.
Luego, utilice pinzas limpias para transferir inmediatamente el filtro a un vaso que contenga 30 mililitros de solución B tres fresca, y agite suavemente los recipientes con el filtro. Vierta el contenido del vaso en un tubo plástico de 50 mililitros. A continuación, tras una centrifugación, re suspenda el precipitado en un mililitro de solución B tres fría con hielo antes de la inmunotinción.
Transfiera los vasos a tubos PCR de 0,2 mililitros y coloque los tubos en hielo hasta que el sedimento tisular se asiente en el fondo de los tubos. Luego, utilice puntas para carga de geles para aspirar la mayor parte del líquido. A continuación, inserte una capilar de vidrio silanizada de 40 micrómetros en una punta de pipeta P200 y use la capilar para transferir los vasos a una placa de vidrio; cuando los vasos se hayan sedimentado cuidadosamente, retire el líquido con un trozo de papel absorbente.
Luego, coloque una sola gota de medio de montaje sobre los vasos y coloque una laminilla en un ángulo de 45 grados, permitiendo que el medio de montaje se extienda a lo largo del borde del vidrio hasta que la laminilla quede en su lugar. En esta imagen, se puede observar una marcación continua de RIN alrededor de las células endoteliales neurales, lo que confirma la retención de la lámina basal en los vasos purificados. También se detectan componentes de las uniones estrechas endoteliales, como ZO uno, en los vasos purificados.
Además, la marcación de NG dos y de actina del músculo liso indican la retención de parásitos intactos y de células del músculo liso vascular, respectivamente. Las proteínas de la membrana astrocitaria perivascular conexina 43 y acuaporina cuatro también se detectan en la superficie de los vasos purificados, lo que demuestra la retención adicional de membranas de astrocitos perivasculares durante el proceso de purificación; sin embargo, solo se observan fibras positivas para GFAP dispersas y cortas en los vasos aislados, lo que revela que los cuerpos celulares de los astrocitos no se copurifican. Solo quedan adheridas a los vasos unas pocas fibras neuronales.
De manera similar, tampoco se detectan células positivas para IBA uno y oli dos, lo que confirma que las microglías y los oligodendrocitos no se copurifican. Recomendamos encarecidamente eliminar el plexo coroideo actual antes de la homogenización del cerebro, ya que lo hemos observado como una posible fuente de contaminación, trabajar en un área limpia y evitar la contaminación por cabello y polvo, ya que los anticuerpos tienen una alta afinidad no específica por estos materiales.
También es importante realizar siempre una tinción nuclear. Es posible eliminar las células sanguíneas de los vasos purificados mediante una perfusión intracardiaca con PBS antes de la extracción de los vasos. Hemos extraído con éxito aire y proteínas de vasos purificados mediante este procedimiento, tanto de paletas de vasos recién preparadas como congeladas.
También hemos utilizado sondas fluorescentes y microscopía confocal para estudiar la función de transporte endotelial ex vivo de los vasos. Le deseamos mucha suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para purificar el compartimento vascular del cerebro de ratón manteniendo su integridad estructural. El procedimiento utiliza centrifugaciones a baja velocidad y filtraciones, eliminando la necesidad de anticuerpos específicos o cepas transgénicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología vascular
- Investigación sobre la barrera hematoencefálica
Antecedentes
- Las técnicas de purificación de vasos cerebrales son esenciales para estudiar la barrera hematoencefálica.
- Mantener la integridad estructural durante la purificación es crucial para investigaciones precisas.
- Los métodos anteriores a menudo implicaban procedimientos complejos que podían comprometer la integridad de los vasos.
- Este protocolo tiene como objetivo simplificar el proceso de purificación.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método sencillo para aislar vasos cerebrales.
- Facilitar el estudio de la composición molecular del compartimento vascular.
- Permitir investigaciones sobre la función del compartimento vascular.
Métodos Utilizados
- Centrifugación de baja velocidad
- Técnicas de filtración
- Sin uso de anticuerpos específicos
- No se requieren cepas transgénicas
Resultados principales
- Los vasos cerebrales permanecen estructuralmente intactos tras la purificación.
- Las células endoteliales están selladas por uniones estrechas.
- Los vasos están rodeados por una lámina basal continua y pericitos.
- Se demostró un proceso de purificación rápido y rentable.
Conclusiones
- Este protocolo es una herramienta valiosa para estudiar el compartimento vascular del cerebro del ratón.
- Permite investigaciones celulares, moleculares y farmacológicas.
- El método puede mejorar la comprensión de la función de la barrera hematoencefálica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La purificación de la vasculatura cerebral intacta permite la eliminación mecanicista de riesgos asociados a dianas de la barrera hematoencefálica (BHE) en programas de enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias. Mantener la integridad estructural de las uniones estrechas endoteliales, los pericitos y los pies terminales de los astrocitos respalda la confianza predictiva en la validación de dianas y la trasladabilidad de los ensayos. Este enfoque reduce la ambigüedad biológica en las fases iniciales del descubrimiento al preservar la composición de la unidad neurovascular para el cribado funcional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas al preservar la arquitectura de la unidad neurovascular para estudios de interacción con el blanco.
- Valor operativo: Permite la validación funcional del blanco mediante la conservación de la polaridad celular y la señalización intercelular.
- Valor estratégico: Apoya la confianza predictiva y la selección de carteras al reducir los riesgos asociados con los mecanismos de penetración de la barrera hematoencefálica.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados con lámina basal intacta y uniones estrechas para la selección de compuestos posteriores.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante la preservación estructural de los compartimentos vasculares.
- Valor estratégico: Destaca la preparación para cribado y la reutilización de la plataforma para evaluar la permeabilidad de la BHE y la modulación de objetivos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia de la enfermedad mediante la retención de membranas astrocitarias perivasculares y la cobertura de músculo liso en vasos purificados.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al mantener la integridad de la unidad neurovascular.
- Valor estratégico: Aborda decisiones de avance ajustadas al riesgo al permitir la reducción mecanicista del riesgo asociado a dianas vasculares.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Sitúa el método dentro del continuo de descubrimiento desde el Descubrimiento Inicial hasta la Identificación de Compuestos Prometedores y el trabajo Preclínico, apoyando la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en la investigación neurovascular.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la prueba de hipótesis, la aclaración de vías y la reducción de riesgos biológicos de la unidad neurovascular.
- Tamizaje: Describe la preparación del ensayo, la reproducibilidad y las salidas cuantitativas mediante inmunotinción de marcadores de uniones estrechas y de la lámina basal.
- Análisis: Destaca las mediciones, resultados o salidas estadísticas que ayudan a los equipos a comparar condiciones mediante etiquetado fluorescente de marcadores endoteliales, de pericitos y de astrocitos.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica o la alineación de biomarcadores mediante la retención de proteínas de la membrana glial astrocitaria perivascular y de la acuaporina cuatro.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable en lugar de una técnica de uso único para la reducción de riesgos de dianas vasculares en todas las etapas del descubrimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de la ambigüedad mecanicista en estudios de penetración de la barrera hematoencefálica.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante centrifugación y filtración a baja velocidad, sin necesidad de anticuerpos ni cepas transgénicas.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del desarrollo, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas en programas neurovasculares.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en la integridad preservada del compartimento vascular.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados necesarios en disección neurovascular y técnicas de centrifugación a baja velocidad.
- Los requisitos de instrumentación e infraestructura analítica incluyen centrífuga con rotor oscilante, filtros de malla de nailon y sistemas de transferencia capilar.
- Requisitos de estandarización entre equipos para la purificación de vasos sanguíneos en equipos de descubrimiento y preclínicos.
- Consideraciones de adaptación entre sistemas modelo, teniendo en cuenta que el protocolo está optimizado para la vasculatura cerebral de ratón.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la documentación original: copurificación incompleta de cuerpos celulares de astrocitos y posible contaminación por plexo coroideo si no se elimina previamente a la homogenización.
