Name: La purificación de los buques de cerebro de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a purificar vasos cerebrales de ratón preservando su integridad estructural mediante centrifugación y filtración. Este método simplificado facilita el estudio de la barrera hematoencefálica sin anticuerpos específicos.

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Este trabajo fue apoyado por el Labex MemoLife y por el ARSEP (Fondation pour l&#39;aide à la recherche sur la sclérose en plaques)

1. Soluciones y Materiales <ol><li> Preparar soluciones de los vasos de aislamiento: B1, añadir 1,5 ml de HEPES 1 M a 150 ml de HBSS; B2, añadir 3,6 g de dextrano a 20 ml de B1; B3, añadir 1 g de BSA a 100 ml de B1. </li><li> Modificar el soporte del filtro mediante la reducción de la parte inferior de la parte superior de atornillado. </li><li> Preparar soluciones de inmunotinción: solución de fijación, 4% de paraformaldehído en PBS pH 7,4; Permeabilización / solución de bloqueo, diluir suero de cabra al 5% y Triton X100 al 0,25% en PBS pH 7,4. Nota: La fijación depende del tipo de anticuerpos primarios utilizados. </li></ol> 2. Disección Nota: No se requieren condiciones estériles, a menos que los buques se utilizan para fines de cultivo celular. <ol><li> Preparar un vaso de precipitados de 150 ml con 20 ml de B1. Mantenga en hielo y cubrir con parafilm para evitar la contaminación del aire. </li><li> Profundamente anestesiar el ratón bajo una campana con una pequeña toalla de papel empapado en 1 ml de isoflurano pura que se añade into la jaula. La anestesia se verifica por la falta de reacción a una pizca dedo del pie. Matar el ratón por dislocación cervical. NOTA: Estos pasos se llevan a cabo de conformidad con las normas nacionales e institucionales. </li><li> Opcional: Realice la perfusión intracardíaca con 20 ml de PBS 1x para eliminar el contenido de sangre 24. </li><li> Sección de la piel con un bisturí desde el cuello hasta la nariz y tirar a la basura. Retire todos los pelos que contaminan con PBS 1x. </li><li> Para abrir el cráneo, primero insertar tijeras anteriormente hasta el bulbo olfatorio, y abrir las tijeras para romper el cráneo en dos partes. </li><li> Retire con cuidado el cerebro usando una espátula de cerebro. Diseccionar el plexo coroideo de los ventrículos laterales, ya que contaminarían la preparación de los vasos sanguíneos 38. NOTA: Opcional: La preparación final contendrá los vasos del parénquima y meninges. Si no se desea, meninges puede despegarse siguiendo el procedimiento descrito por 38. </li><li> Transfer el cerebro en el vaso de precipitados que contiene la solución B1 en hielo. Hasta 8 cerebros pueden tratarse juntos. </li></ol> 3. Cerebro Tejido Homogeneización <ol><li> El uso de dos escalpelos, manualmente y vigorosamente vencieron el cerebro en la solución B1 posteriormente la obtención de pequeñas piezas de aproximadamente 2 mm. </li><li> Homogeneizar la preparación con un homogeneizador Dounce automatizado, realizando 20 golpes a 400 rpm. Asegúrese de que el tubo de vidrio se mantiene en hielo y que la parte superior de la douncer está en solución cuando se mueve arriba y abajo, a fin de evitar la formación de bolsas de aire. Si se preparan varias muestras, se lava la douncer con agua desionizada entre cada homogeneización. </li></ol> Purificación 4. Recipiente <ol><li> Transferir el homogeneizado en un tubo de plástico de 50 ml y proceder a la centrifugación a 2.000 g durante 10 min a 4 ° C. Una gran interfaz blanco (en su mayoría de mielina) se forma en la parte superior de la pastilla recipiente (rojo si no se realizó la perfusión). </li><li> Eliminar el sobrenadante. El sedimento de buque y la interfaz blanco permanecerá unida juntos. Añadir 20 ml de solución B2 enfriado con hielo y agitar el tubo de forma manual y vigorosamente durante 1 min. </li><li> Proceder a la segunda centrifugación a 4400 g durante 15 min a 4 ° C. La mielina ahora formará una capa blanca densa en la superficie del sobrenadante. </li><li> Separar con cuidado la capa de mielina de las paredes del tubo manteniendo el tubo y lentamente girar para permitir que el sobrenadante a pasar a lo largo de las paredes. Desechar la mielina con el sobrenadante. El sedimento que contiene los vasos permanece unido en la parte inferior del tubo. </li><li> Seque la pared interior del tubo con un papel absorbente envuelto alrededor de una pipeta de plástico 5 ml y eliminar todos los fluidos residuales, evite tocar el pellet buque. Mantenga el tubo boca abajo sobre un papel absorbente para drenar cualquier líquido restante. </li><li> Suspender el sedimento en 1 ml de solución B3 helada pipeteando arriba y abajo con las puntas de baja unión, keeping el tubo en hielo, a continuación, añadir otros 5 ml de solución B3. Asegúrese de que los buques se dispersan tanto como sea posible y no forman agregados. </li></ol> 5. Filtración <ol><li> Preparar un vaso de precipitados sobre hielo con 30 ml de solución de B3 enfriado con hielo. Cubra con parafilm para evitar la contaminación del aire. </li><li> Colocar un filtro de 20 micras de malla en un soporte de filtro modificado en la parte superior de un matraz de Becker y equilibrar mediante la aplicación de 10 ml de solución B3 enfriado con hielo. </li><li> Verter la preparación recipiente en el filtro y enjuagar los vasos con 40 ml de solución de B3 enfriado con hielo. </li><li> Recuperar el filtro utilizando pinzas limpias e inmediatamente sumerja en el vaso que contiene la solución B3. Separe los buques del filtro sacudiéndolo suavemente. </li><li> Verter el contenido vaso de precipitados en un tubo de plástico 50 ml y centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Nota: Como alternativa, la suspensión de los vasos cerebrales &#39;desde el paso 4.6 se puede filtrar sobre un filtro de 100 micras de malla.En este caso, los buques más grandes se retienen preferentemente en el filtro, mientras que el flujo a través de los microvasos (principalmente contiene capilares), que luego se filtró en un filtro de 20 micras de malla como anteriormente. </li><li> Resuspender el sedimento de microvasos en 1 ml de solución B3 enfriado con hielo y transferirlo pipeteando en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C. </li></ol> 6. La fijación, permeabilización y el bloqueo <ol><li> Vasos de transferencia transfiriendo al vaso 0,2 ml tubos de PCR que contienen PBS utilizando una punta de unión de baja de 1,0 ml. Tener cuidado de no tocar los vasos, ya que pueden adherirse a la parte exterior de la punta. Realice todos los siguientes pasos bajo un microscopio binocular. </li><li> Para cada uno de los siguientes cambios de medio, deje los tubos en hielo hasta que los barcos han llegado a la parte inferior, y la pipeta a cabo la mayor parte de los líquidos utilizando largas y cosa puntas de pipeta de gel de carga. </li><li> Retire la mayor parte del PBS y añadir 200 l de solución de fijación.Suspender los vasos agitando suavemente y se incuba durante 20 min a TA. </li><li> Pipetear la solución de fijación y reemplazarlo con 200 l de PBS 1x (primer lavado), se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente y repita este paso 3 veces. Cada vez, compruebe que los barcos se han hundido correctamente a la parte inferior de los tubos y la pipeta fuera 1x PBS, asegurando los buques no se tocan. </li><li> Después del último lavado, reemplace 1x PBS por la solución de permeabilización / bloqueo y se incuba 1 hora a RT, la resuspensión de los vasos agitando suavemente de vez en cuando. </li></ol> 7. La inmunotinción <ol><li> Vuelva a colocar la solución de permeabilización / bloqueo con la mezcla de anticuerpos primarios (véanse las referencias de los anticuerpos utilizados aquí y diluciones en la tabla de plantilla de Materiales) diluido en la solución de permeabilización / bloqueo, y se incuba a 4 ° CO / N. </li><li> Después de 3 lavados en PBS a temperatura ambiente, se incuban los vasos con la mezcla de anticuerpos secundarios diluido en PBS durante 2 horasa TA. </li><li> Nota: le recomendamos realizar la tinción nuclear con Hoechst (1: 2000) o DAPI (1: 2000) con el fin de distinguir los vasos de posibles contaminantes pelos o polvo en el microscopio. </li><li> Después de 3 lavados en PBS, resuspender los vasos en 50 l de PBS. </li></ol> 8. Montaje y Observación <ol><li> Preparar una punta con un capilar de vidrio siliconado: cortar una punta de pipeta P200 utilizando un bisturí y ajustar el capilar interior. El volumen aproximado del capilar es de 40 l. </li><li> La transferencia de los buques a un portaobjetos de vidrio utilizando el capilar de vidrio siliconado y retirar con cuidado el líquido con un trozo de papel absorbente. </li><li> Aplique una gota de medio de montaje en los vasos y mantenga un cubreobjetos a 45º permitiendo la caída se extienda a lo largo del borde de la hoja. Deje que se apaga el cubreobjetos y deje a medio y se extendió lentamente. Deje que se seca O / N a temperatura ambiente con la protección de la luz. Los buques se pueden observar bajo un colgmicroscopio confocal ent. </li></ol>

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<li>Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Visual+Description+of+the+Dissection+of+the+Cerebral+Surface+Vasculature+and+Associated+Meninges+and+the+Choroid+Plexus+from+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
<li>Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+Method+to+Isolate+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells+by+Magnetic+Cell+Sorting+and+Dominant+mRNA+Expression+of+Multidrug+Resistance-associated+Protein+1+and+4+in+Highly+Purified+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells.</a> Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).</li>
<li>Warren, M. S., Zerangue, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+gene+expression+profiles+of+ABC+transporters+in+brain+microvessel+endothelial+cells+and+brain+in+five+species+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human.</a> Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La barrera sangre-cerebro regula el paso de sustancias fisiológicas dentro y fuera del SNC y lo protege contra sustancias potencialmente nocivas presentes en la sangre. Está implicado en varias patologías del sistema nervioso central, incluyendo enfermedades neurodegenerativas 2 y 28 tumores cerebrales. La muy baja permeabilidad de la BHE también dificulta el paso de agentes terapéuticos dirigidos células neuronales y el desarrollo de métodos que tengan la intención de abrir de forma reversible la BHE sin con...

El funcionamiento adecuado del sistema nervioso central (SNC) requiere un entorno extracelular altamente regulado, y sus demandas metabólicas son enormes en comparación con otros órganos 1. El SNC es también extremadamente sensibles a una amplia gama de productos químicos, generalmente inofensivo para los órganos periféricos, pero a la misma, neurotóxico. Para garantizar el correcto funcionamiento, la mayor parte del &#39;vasculatura SNC forma una barrera endotelial; la barrera hematoencefálica (BBB), que controla el flujo de moléculas e iones, así como el paso de las células inmunes entre la sangre y el cerebro, lo que se mantiene la homeostasis adecuada 2, sino también limitar la entrada de drogas terapéuticas, los tratamientos que impiden por lo tanto de trastornos neurológicos 3. A nivel celular, la BBB se sostiene principalmente por extensas uniones estrechas entre las células endoteliales, la expresión de los transportadores de eflujo polarizado y una tasa muy baja transcitosis 4. Propiedades y funciones de la BBB se inducen principalmente por necélulas ighboring 4. En particular, los pericitos juegan un papel importante en la inducción y mantenimiento de la BBB 5,6. Siendo células contráctiles, pericitos también regulan el flujo sanguíneo 7 al igual que las células del músculo liso que rodean los grandes vasos. Por último, los astrocitos, las principales células gliales del cerebro, enviar grandes procesos denominados endfeet alrededor de la mayor parte de la vasculatura del cerebro 8 y modular la acreditación integridad y la quiescencia inmune 9, la transferencia de metabolitos a las neuronas 10, e inducir el estrecho acoplamiento entre la actividad neuronal y el flujo de sangre 11,12. La capacidad para estudiar las propiedades moleculares y celulares del sistema cerebrovascular es crucial para caracterizar mejor su contribución a la fisiología del cerebro y la fisiopatología. Para abordar esta cuestión, las estrategias para aislar el sistema vascular cerebral del cerebro se han desarrollado, que permite la preparación de fragmentos de vasos cerebrales intactas. Cerebral buque purification fue descrito inicialmente utilizando cerebros bovinos 13 y mejorado y adaptado a otras especies, en particular los roedores 14. En este último estudio, se introdujo el uso de filtros de diferentes tamaños para separar los vasos cerebrales en al fracciones enriquecidas en los vasos de diferentes diámetros. Curiosamente, en estas preparaciones, las células endoteliales mantienen sus propiedades metabólicas 15, funcionalidad transportador 16 y 17 de polarización. A continuación, describimos en detalle este protocolo y demostrar, además, que los vasos aislados conservan la mayor parte de sus estructuras en situ. Las células endoteliales se mantienen unidos por uniones estrechas y rodeado por una lámina basal continua. Pericitos y células musculares lisas de permanecer unidos a la capa endotelial, así como de astrocitos perivasculares membranas. Sin embargo, se eliminan astrocitos, células microgliales, neuronas y oligodendrocitos. Por último, se describe un procedimiento para llevar a cabo la inmunotinción en vasos cerebrales aisladas. </p&gt; Hasta ahora la mayoría de los estudios moleculares y celulares en relación con el sistema cerebrovascular se han realizado en células de los vasos cerebrales purificados disociados por la célula de clasificación utilizando cepas reportero ratón específicos de células o procedimientos basados ​​en inmunotinción 18,19. Aunque estas técnicas permite el aislamiento de las poblaciones de células cerebrovasculares casi puros, células aisladas pierden por completo su in situ morfología y las interacciones, que a su vez, afecta en gran medida sus propiedades moleculares y celulares. El protocolo descrito aquí, lo que permite el aislamiento de fragmentos cerebrovasculares enteros sin necesidad de anticuerpos específicos o manchas de ratones transgénicos, ofrece una buena alternativa como la estructura general de los vasos cerebrales aisladas se conserva, por lo tanto, disminuyendo repercusiones sobre sus propiedades moleculares. Vasos aislados podrían entonces ser utilizados para el estudio de la actividad genética, la síntesis de proteínas y la regulación de la acreditación como se ha descrito recientemente 20,21 </sup&gt;. Por último, en comparación con láser captura microdissection 22,23 del presente protocolo es barato, fácil de realizar y rápidamente adaptables a cualquier laboratorio.

<table><tbody><tr><td>Trituradora de tejidos tamaño C</td><td>Thomas scientific</td><td>3431E25</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga 5415&nbsp; Centrífuga R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000320</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico modular de alto rendimiento</td> El sistema compacto <td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr> proporciona puntas <tr><td>Leica LED1000</td><td>Leica</td><td>LED1000</td><td></td></tr><tr><td>de alta calidad (P1000)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>14200T</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex Portafiltros de 47 mm PP 8/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td><td></td></tr><tr><td>Disco de filtro de red de nailon Hydrophilic 20 &micro; m 47 mm 100/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td><td></td></tr><tr><td>Disco filtrante de red de nailon Hydrophilic 100 &micro; m 47 mm 100/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a>Tubo de</td><td></td></tr> <tr><td>borosilicato de pared estándar</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>1014356290F</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos, espesor 1</td><td>Thermo Scientific</td><td>P10143263NR1</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml Tubos de pared delgada y tapa abovedada</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; PARAFILM M (tamaño de rollo 4 pulgadas y veces; 125 pies)</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol</td><td>Tecnología Life</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Tecnología Life</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano de Leuconostoc spp. Sr. ~70,000</td><td>Sigma</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehído (p/v), sin metanol&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>bisBenzimida H 33342 triclorhidrato (Hoechst)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Isolectina GS-IB4 De Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugado; Dilución 1/100</td><td>Life technology</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Agrin (conejo) ; dilución 1/400</td><td>amablemente proporcionada por el Dr. Markus A Ruegg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti ZO-1 (ratón, clon 1A12)</td><td>Life technology</td><td>33-9100</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anti Smooth Muscle Actin (ratón, clon 1A4)</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>&nbsp; dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anti GFAP (ratón, clon GA5)</td><td>Sigma</td><td>G3893</td><td>&nbsp; dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anti AQP4 (conejo)</td><td>Sigma</td><td>A5971</td><td>&nbsp; dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anti Cx43 (ratón, clon&nbsp; 2)</td><td>BD Biosciences</td><td>610061</td><td>&nbsp; dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anti Olig2 (conejo)</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>&nbsp; dilución 1:200</td></tr><tr><td>Anti NF-M (ratón)</td> <td>proporcionada por el Dr. Beat M. Riederer, Universidad de Lausana, Suiza.</td><td>&nbsp; dilución 1:10</td><td></td></tr><tr><td>Anti Iba1 (conejo)</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>&nbsp; dilución 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Ratón IgG (H+L) Anticuerpo Tecnología</td><td>Life</td><td>A11029</td><td>&nbsp; dilución 1:2.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 488</td><td>conjugado Tecnología de vida</td><td>A11034</td><td>&nbsp; dilución 1:2.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Cabra Anti-Ratón Anticuerpo IgG (H+L)</td><td>Tecnología Life</td><td>A21424</td><td>&nbsp; dilución 1:2.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-conejo de cabra, conjugado Alexa Fluor 555</td><td>Tecnología de vida</td><td>A21429</td><td>&nbsp; Dilución 1:2.000</td></tr></tbody></table>

la purificación de los buques de cerebro de ratón

Purification of Mouse Brain Vessels

En el cerebro, la mayor parte del sistema vascular consiste en una barrera selectiva, la barrera hematoencefálica (BBB) ​​que regula el intercambio de moléculas y células inmunes entre el cerebro y la sangre. Por otra parte, la enorme demanda metabólica neuronal requiere una regulación de momento a momento del flujo sanguíneo. Cabe destacar que las anomalías de estas regulaciones son características etiológicas de la mayoría de las patologías cerebrales; incluyendo glioblastoma, accidente cerebrovascular, edema, epilepsia, enfermedades degenerativas (por ejemplo: enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer), tumores cerebrales, así como las condiciones inflamatorias tales como esclerosis múltiple, meningitis y disfunciones cerebrales sepsis inducida. Por lo tanto, la comprensión de los eventos de señalización que modulan la fisiología vascular cerebral es un gran desafío. Mucho penetración en las propiedades celulares y moleculares de los diversos tipos de células que componen el sistema cerebrovascular se puede obtener de cultivo primario o clasificación de células a partir de tejido cerebral recién disociada. Sin embargo,propiedades tales como la polaridad celular, la morfología y relaciones intercelulares no se mantienen en tales preparaciones. El protocolo que se describe aquí está diseñado para purificar fragmentos de vasos del cerebro, mientras que el mantenimiento de la integridad estructural. Se demuestra que los vasos aislados consisten en células endoteliales sellados por uniones estrechas que están rodeados por una lámina basal continua. Los pericitos, células de músculo liso, así como las membranas de astrocitos perivasculares endfeet permanecen unidos a la capa endotelial. Por último, se describe cómo llevar a cabo experimentos de inmunotinción en vasos cerebrales purificados.

Aquí se describe un protocolo que permite el aislamiento mecánico de los vasos cerebrales 14. Figura 1 resume las principales etapas de esta técnica. La arquitectura de los vasos cerebrales es compleja e incluye varios tipos de células, es decir, células endoteliales sellados por uniones estrechas y rodeados por pericitos, células musculares lisas, y procesos de pie 9 de astrocitos. Por lo tanto, después del aislamiento de los vasos cerebrales, que tuvo como objetivo carac...

Describimos un protocolo que permite la purificación del compartimento vascular del cerebro del ratón. Los vasos cerebrales aislados incluyen células endoteliales unidas por uniones estrechas y rodeadas por una lámina basal continua, pericitos, células musculares lisas vasculares, así como membranas astrogliales perivasculares.

La purificación de los buques de cerebro de ratón

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

El objetivo general del procedimiento es purificar el compartimento vascular del cerebro de ratón manteniendo su integridad estructural, mediante una serie de centrifugaciones lentas y filtraciones, sin necesidad de anticuerpos específicos ni cepas transgénicas. Se han realizado muchos esfuerzos para desarrollar técnicas que permitan investigaciones celulares, moleculares y farmacológicas de la barrera hematoencefálica. La ausencia de separación, gradientes, columnas o pasos de centrifugación a alta velocidad hace que la purificación de los vasos cerebrales mediante este procedimiento sea muy sencilla, rápida y económica.Los vasos cerebrales permanecerán estructuralmente intactos con las células endoteliales selladas por uniones en forma de etiqueta y rodeadas por parásitos basolaterales, la mayoría de las células musculares vasculares y las membranas astro perivasculares. Este protocolo puede ayudar a responder preguntas clave sobre la función del compartimento vascular de la CE y permitir el estudio de su composición molecular, demostrando que el procedimiento será un rol para un posdoctorado del equipo de Martin Coen S. Antes de comenzar el procedimiento, corte la parte inferior de la sección superior roscada del soporte del filtro.Luego, use un escalpelo para incisionar la piel desde el cuello del ratón hasta la nariz y retire la piel hacia atrás. Lave el cráneo con PBS para eliminar cualquier pelo contaminante y, a continuación, inserte un par de tijeras en el cráneo anterior a los bulbos olfativos. Abra las tijeras para romper el cráneo en partes y extraiga el cerebro con la espátula.A continuación, diseccione el plexo coroideo de los ventrículos laterales y transfiera el cerebro a un vaso de precipitados de 150 mililitros que contenga 20 mililitros de solución B1 sobre hielo. Luego, use dos escalpelos para cortar enérgicamente el cerebro en fragmentos de tejido de dos milímetros y utilice un homogenizador automático tipo Dounce para homogeneizar el tejido durante 20 golpes a 400 RPM sobre hielo. Para purificar los vasos, transfiera el homogenizado a un tubo plástico de 50 mililitros y centrifugue la suspensión de tejido.En una centrífuga con rotor oscilante, se formará una gran interfase blanca compuesta principalmente de mielina en la parte superior del precipitado del recipiente. Deseche el sobrenadante junto con 20 mililitros de solución B dos fría con hielo y agite el tubo vigorosamente durante un minuto. Tras una segunda centrifugación, la mielina formará una capa blanca densa en la superficie del sobrenadante.Gire lentamente el tubo para permitir que la solución B dos fluya por la pared al verterla y deseche la mielina junto con el sobrenadante. Luego, use una pipeta de plástico envuelta en papel absorbente para eliminar cualquier líquido residual de las paredes del tubo. Tenga cuidado de no tocar el precipitado del vaso y coloque el tubo boca abajo sobre hielo.A continuación, resuspenda el precipitado en un mililitro de solución B tres fría con hielo, seguido por la adición de otros cinco mililitros de solución B tres, teniendo cuidado de que los vasos no formen agregados. Coloque ahora un filtro de malla de nailon de 20 micrones encima de un matraz Erlenmeyer y equilibre el filtro con 10 mililitros de solución B tres fría con hielo. Vierta la preparación de vasos sobre el filtro y enjuague cuidadosamente los vasos con otros 40 mililitros de solución B tres fría con hielo.Luego, utilice pinzas limpias para transferir inmediatamente el filtro a un vaso que contenga 30 mililitros de solución B tres fresca, y agite suavemente los recipientes con el filtro. Vierta el contenido del vaso en un tubo plástico de 50 mililitros. A continuación, tras una centrifugación, re suspenda el precipitado en un mililitro de solución B tres fría con hielo antes de la inmunotinción.Transfiera los vasos a tubos PCR de 0,2 mililitros y coloque los tubos en hielo hasta que el sedimento tisular se asiente en el fondo de los tubos. Luego, utilice puntas para carga de geles para aspirar la mayor parte del líquido. A continuación, inserte una capilar de vidrio silanizada de 40 micrómetros en una punta de pipeta P200 y use la capilar para transferir los vasos a una placa de vidrio; cuando los vasos se hayan sedimentado cuidadosamente, retire el líquido con un trozo de papel absorbente.Luego, coloque una sola gota de medio de montaje sobre los vasos y coloque una laminilla en un ángulo de 45 grados, permitiendo que el medio de montaje se extienda a lo largo del borde del vidrio hasta que la laminilla quede en su lugar. En esta imagen, se puede observar una marcación continua de RIN alrededor de las células endoteliales neurales, lo que confirma la retención de la lámina basal en los vasos purificados. También se detectan componentes de las uniones estrechas endoteliales, como ZO uno, en los vasos purificados.Además, la marcación de NG dos y de actina del músculo liso indican la retención de parásitos intactos y de células del músculo liso vascular, respectivamente. Las proteínas de la membrana astrocitaria perivascular conexina 43 y acuaporina cuatro también se detectan en la superficie de los vasos purificados, lo que demuestra la retención adicional de membranas de astrocitos perivasculares durante el proceso de purificación; sin embargo, solo se observan fibras positivas para GFAP dispersas y cortas en los vasos aislados, lo que revela que los cuerpos celulares de los astrocitos no se copurifican. Solo quedan adheridas a los vasos unas pocas fibras neuronales.De manera similar, tampoco se detectan células positivas para IBA uno y oli dos, lo que confirma que las microglías y los oligodendrocitos no se copurifican. Recomendamos encarecidamente eliminar el plexo coroideo actual antes de la homogenización del cerebro, ya que lo hemos observado como una posible fuente de contaminación, trabajar en un área limpia y evitar la contaminación por cabello y polvo, ya que los anticuerpos tienen una alta afinidad no específica por estos materiales.También es importante realizar siempre una tinción nuclear. Es posible eliminar las células sanguíneas de los vasos purificados mediante una perfusión intracardiaca con PBS antes de la extracción de los vasos. Hemos extraído con éxito aire y proteínas de vasos purificados mediante este procedimiento, tanto de paletas de vasos recién preparadas como congeladas.También hemos utilizado sondas fluorescentes y microscopía confocal para estudiar la función de transporte endotelial ex vivo de los vasos. Le deseamos mucha suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Neurociencia

En este artículo presentamos una técnica sencilla y práctica para la fundición cerebrovascular que es fácil de realizar y pueden ser utilizados para obtener imágenes del árbol vascular del cerebro del ratón adulto.

Fundición cerebrovascular del ratón adulto de imágenes en 3D y el análisis morfológico

Este video muestra el aislamiento de vasos intactos del cerebro de un ratón que constituyen la barrera hematoencefálica (BBB) junto con las neuronas y las células gliales. Los vasos aislados se pueden utilizar como modelo in vitro para estudiar su papel en el mantenimiento de la homeostasis cerebral.

Aislamiento de vasos cerebrales de ratón: un protocolo para aislar vasos intactos de una muestra de cerebro murino

Este video muestra el aislamiento de capilares de cerebros porcinos frescos. El proceso consiste en eliminar las meninges, aislar la materia gris del tejido cerebral, homogeneizar y filtrar la materia gris para aislar los capilares y, finalmente, utilizar la digestión enzimática para purificar aún más los capilares.

Purificación de capilares de un cerebro porcino

Este video muestra un método para aislar pericitos cerebrales del cerebro de un ratón. Las células aisladas se cultivan en medios específicos de pericitos para promover la proliferación de pericitos.

Aislamiento y cultivo de pericitos cerebrales de ratón

Este video muestra un método para aislar los tubos endoteliales del parénquima cerebral de ratón. A través de una combinación de digestión enzimática y disociación mecánica, el proceso produce un tubo intacto con células endoteliales.

Preparación de tubos endoteliales cerebrales a partir de arteriolas parenquimatosas de ratón

Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC) están interconectadas por proteínas de unión específicas que forman una barrera altamente regulada que separa la sangre y el sistema nervioso central (SNC), la llamada barrera hematoencefálica (BBB). El aislamiento de las células endoteliales microvasculares primarias del cerebro murino, como se discute en este protocolo, permite estudios detallados in vitro de la BHE.

Aislamiento de células primaria murino cerebro endoteliales microvasculares

Describimos aquí un protocolo reproducible para aislar el círculo del ratón de Willis.

Protocolo para el aislamiento del Círculo de Willis Ratón

Presentamos un protocolo para la extracción de pericitas cerebrales murinas. Basado en una extracción de pericita orientada al enriquecimiento libre de antibióticos, este protocolo es una herramienta valiosa para estudios in vitro que proporcionan alta pureza y alto rendimiento, disminuyendo así el número de animales experimentales utilizados.

Un método de alta salida para aislar los pericytes cerebrales del ratón

La preparación intensiva de "tubos" endoteliales cerebrales intactos de ratón de las arteriolas del parénquima cerebral se ilustra para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral. Además, demostramos las fortalezas experimentales de este modelo de estudio endotelial para imágenes de fluorescencia y medición electrofisiológica de vías clave de señalización celular, incluidos los cambios en el [Ca2+] intracelular y el potencial de membrana.

Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón

Demostramos la inducción química de la dilatación de grandes vasos sanguíneos en ratones como modelo para investigar la disfunción cerebrovascular, que se puede utilizar para el modelado de la demencia vascular y la enfermedad de Alzheimer. También demostramos la visualización de la vasculatura mediante la inyección de compuesto de caucho de silicona y proporcionamos una guía visual clara para medir los cambios en el tamaño de los vasos sanguíneos.

Un enfoque visual para inducir dolicoectasia en ratones para modelar la disfunción cerebrovascular mediada por grandes vasos

Aprende a purificar vasos cerebrales de ratón preservando su integridad estructural mediante centrifugación y filtración. Este método simplificado facilita el estudio de la barrera hematoencefálica sin anticuerpos específicos.

La purificación de los buques de cerebro de ratón

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