La purificación de los buques de cerebro de ratón

El objetivo general del procedimiento es purificar el compartimento vascular del cerebro del ratón manteniendo su integridad estructural, utilizando una serie de centrifugaciones y filtraciones a baja velocidad sin necesidad de anticuerpos específicos o cepas transgénicas. Se han realizado muchos esfuerzos para desarrollar técnicas que permitan investigaciones celulares, moleculares y farmacológicas de la barrera hematoencefálica. La ausencia de separación, gradientes, colons o pasos de centrifugación de alta velocidad hace que la purificación de los vasos cerebrales mediante este procedimiento sea muy fácil, rápida y económica.

Los vasos cerebrales permanecerán estructuralmente intactos con las células endot selladas por una unión de etiqueta y rodeadas por los parásitos larares basales, las células musculares vasculares S y las membranas astronómicas perivasculares. Este protocolo puede ayudar a responder preguntas clave sobre la función del compartimento vascular CE y permitir el estudio de su composición molecular, demostrando que el procedimiento será un postdoctorado del equipo de Martin Coen S. Antes de comenzar el procedimiento, corte la parte inferior de la parte superior atornillada del portafiltros.

A continuación, utiliza un bisturí para incidir la piel desde el cuello del ratón hasta la nariz y tirar de la piel hacia atrás. Lave el cráneo con PBS para eliminar los pelos contaminantes y luego inserte un par de tijeras en el cráneo anterior a los bulbos olfativos. Abre las tijeras para romper el cráneo en partes y retira el cerebro con la espátula.

A continuación, diseccione el plexo coroideo de los ventrículos laterales y transfiera el cerebro a un vaso de precipitados de 150 mililitros que contiene 20 mililitros de solución B one en hielo. A continuación, utilice dos bisturíes para cortar vigorosamente el cerebro en fragmentos de tejido de dos milímetros, y utilice un homogeneizador automático para homogeneizar el tejido durante 20 brazadas a 400 rpm en hielo. Para purificar los recipientes, transfiera el homogeneizado a un tubo de plástico de 50 mililitros y centrifugue la suspensión de tejidos.

En una centrífuga de rotor oscilante, se formará una gran interfaz blanca que consiste principalmente en mielina en la parte superior del gránulo del recipiente. Deseche el sobrenadante a 20 mililitros de solución B dos helada y agite el tubo vigorosamente durante un minuto. Después de una segunda centrifugación, la mielina formará una densa capa blanca en la superficie del sobrenadante.

Gire lentamente el tubo para permitir que la solución B dos corra a lo largo de la pared a medida que se vierte y deseche la mielina con el sobrenadante. A continuación, utilice una pipeta de plástico envuelta en papel absorbente para eliminar cualquier líquido residual de las paredes del tubo. Tenga cuidado de no tocar el pellet del recipiente y gire el tubo boca abajo sobre hielo.

A continuación, suspenda el pellet en un mililitro de solución B tres helada, seguido de la adición de otros cinco mililitros de solución B tres teniendo cuidado de que los recipientes no formen agregados. Ahora coloque un filtro de malla de nailon de 20 micras encima de un matraz Becker y equilibre el filtro con 10 mililitros de solución B tres helada. Vierta la preparación del recipiente en el filtro y enjuague cuidadosamente los recipientes con otros 40 mililitros de solución B tres helada.

A continuación, utilice unas pinzas limpias para transferir inmediatamente el filtro a un vaso de precipitados que contenga 30 mililitros de solución B tres fresca, y fije los recipientes del filtro agitando suavemente. Vierta el contenido del vaso de precipitados en un tubo de plástico de 50 mililitros. Luego, después de una centrifugación, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de solución B tres helada antes de la inmunotinción.

Transfiera los recipientes a tubos de PCR de 0,2 mililitros y coloque los tubos en hielo hasta que el tejido se sedimente en el fondo de los tubos. A continuación, utilice las puntas de carga de gel para aspirar la mayor parte del líquido. A continuación, inserte un capilar de vidrio siliconado de 40 micrómetros en una punta de pipeta P 200 y utilice el capilar para transferir los recipientes a un portaobjetos de vidrio cuando los recipientes se hayan asentado, retire con cuidado el líquido con un trozo de papel absorbente.

A continuación, cargue una sola gota de medio de montaje en los recipientes y aplique un cubreobjetos en un ángulo de 45 grados, permitiendo que el medio de montaje se extienda a lo largo del borde del vidrio hasta que el cubreobjetos esté en su lugar. En esta imagen, se puede observar un marcaje continuo de RIN alrededor de las células endoteliales neurales que confirma la retención de la lámina basal en los vasos purificados. Los componentes de las uniones estrechas endoteliales, como ZO uno, también se detectan en los vasos purificados.

Además, el marcaje de NG two y actina del músculo liso indica la retención de parásitos intactos y células vasculares del músculo liso, respectivamente. La conexión de las proteínas de membrana astroglial perivascular 43 y acuaporina cuatro también se detectan en la superficie de los vasos purificados, lo que demuestra la retención adicional de las membranas de los astrocitos perivasculares durante el proceso de purificación, solo se observan fibras positivas GFAP dispersas y cortas, sin embargo, se observan en los vasos aislados que revelan que los cuerpos celulares de los astrocitos no están copurificados. Solo unas pocas fibras neuronales permanecen unidas a los vasos.

Del mismo modo, las células positivas para IBA uno y oli dos tampoco se detectan, lo que confirma que la microglía y los oligodendrocitos no están copurificados. Recomendamos encarecidamente eliminar el plexo actual antes de la homogeneización del cerebro, ya que lo experimentamos como una posible fuente de contaminación, trabajar en un área limpia y evitar la contaminación del cabello y el polvo. Los anticuerpos tienen una alta afinidad inespecífica por estos materiales.

También es importante realizar siempre una tinción nuclear. Es posible extraer las células sanguíneas de los vasos purificados realizando perfusión intracardíaca con PBS antes de la extracción de los vasos. Hemos extraído con éxito aires y proteínas de recipientes purificados por este procedimiento a partir de paletas de recipientes recién preparados o congelados.

También hemos utilizado sondas fluorescentes y microscopía confocal para estudiar la función de transporte endotelial ex vivo de los vasos. Te deseamos buena suerte con tus experimentos.